一种新型人3号染色体探针的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型人3号染色体探针的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]焚光原位杂交(FISH,fluorescence in situ hybridizat1n)是一项在体外直接观察细胞中特定核酸的技术。根据碱基互补配对的原则，特定的DNA序列与细胞内的目标序列互补结合。由于探针带有荧光，在合适的激发光照射下，杂交探针及目标DNA能够在荧光显微镜下被清楚地观察到，是一种直观有效的检测方法。
[0003]由于传统FISH探针序列的长度较大，导致所需要的杂交时间很长(一般是过夜杂16-18小时)，不能及时的得到检测结果，这不利于临床的诊断及治疗。对FISH探针进行改进，缩短杂交时间，提尚检测效率，有利于临床的诊断及治疗。
[0004]有必要研宄出一种新型快速FISH探针的制备方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种新型人3号染色体探针的制备方法及其应用。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
新型人3号染色体探针，包括FISH荧光探针，缓冲液和染色液，其中，3号染色体特异性探针的序列为:
探针 1:TGAGTTTGGAAACAGTCAGTTTGTA 探针 2: CACTTTGAGGCCATTGGTGGAAAAG 探针 3: CTTGTCTGTGGAATTTGCAAGGGGA 探针 4: CAACTCACAGAGTTTAACCTTTCTT 探针 5: CTCAGGAACTACTTTGTGATATGTG 探针 6:ATATTTGGACCTCTTTGAGGCTTTC 探针 7:ACAGAATCATTCTCAGGAACTACTT 探针 8: CTTCCTTTAGACAGTGCAGATTTGA 探针 9: CATAATGCTAGACAGAAGAATTCTC 探针 10: CTTCTTTTGGGATGTATGTATTCA 探针 11:AGTTGAACCTTCCTTTAGACAGAGC 探针 12: CACTCTTTTTGTGGAATTTGCAAG 探针 13:ATTCTAGCAGTATGAGGCCAATGGT 探针 14: CATTCTCAGAAACTGCTTTGTGATG 探针 15: CTCTTTGAGGCCTTCGTTGGAAACG 探针 16: CATAGAGCAGTTTGGAAAGACTTAG 探针 17: CTCAGTAGCTTCTTTGTGTGTGTG
上述检测试剂盒中的使用的探针中，3号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。
[0007]优选的，上述探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。
[0008]优选的，上述探针所用缓冲液为:20mM?50mM Tris-HCl (PH8.0?8.8)，1mMMgCl2,10% ?30% 甲酰胺。
[0009]优选的，上述探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。
[0010]本发明的有益效果是:
本发明试剂盒，采用优化的短序列荧光探针，将原有的FISH检测时间由16?18小时缩短至I?2小时，可以快速、准确地检测出人3号染色体，对未来染色体异常快速检测方法的探宄起指示性作用。
【附图说明】
[0011]图1是人3号染色体经本试剂盒荧光探针染色后的镜检结果。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:
一、新型人3号染色体探针，包括FISH荧光探针，缓冲液和染色液，其中，3号染色体特异性探针的序列为:
探针 1:TGAGTTTGGAAACAGTCAGTTTGTA探针 2: CACTTTGAGGCCATTGGTGGAAAAG探针 3: CTTGTCTGTGGAATTTGCAAGGGGA探针 4: CAACTCACAGAGTTTAACCTTTCTT探针 5: CTCAGGAACTACTTTGTGATATGTG探针 6:ATATTTGGACCTCTTTGAGGCTTTC探针 7:ACAGAATCATTCTCAGGAACTACTT探针 8: CTTCCTTTAGACAGTGCAGATTTGA探针 9: CATAATGCTAGACAGAAGAATTCTC探针 10: CTTCTTTTGGGATGTATGTATTCA探针 11:AGTTGAACCTTCCTTTAGACAGAGC探针 12: CACTCTTTTTGTGGAATTTGCAAG探针 13:ATTCTAGCAGTATGAGGCCAATGGT探针 14: CATTCTCAGAAACTGCTTTGTGATG探针 15: CTCTTTGAGGCCTTCGTTGGAAACG探针 16: CATAGAGCAGTTTGGAAAGACTTAG探针 17: CTCAGTAGCTTCTTTGTGTGTGTG
其中，3号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。该探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。
[0013]实验时，加入10ul的缓冲液溶解探针干粉，缓冲液的成分为:20mM?50mMTris-HCl (PH8.0 ?8.8)，1mM MgCl2,10% ?30% 甲酰胺。
[0014]上述探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。
[0015]二、FISH 检测:
1.羊水样本处理
1)取彡5ml羊水转移到15ml的离心管(标记)中，2000rpm室温离心10分钟；
2)观察并记录沉淀情况，上清(约4ml)转移到新15ml离心管(标记)，置4°C冰箱中保存；
3)沉淀加入5mlIxPBS并混匀，2000rpm室温离心10分钟，弃上清，管底留约Iml ；
4)加入5ml的0.05%胰酶溶液，反复吹打混匀，37°C放置5_10分钟，2000rpm室温离心10分钟，弃上清，管底留约Iml ；
5)加入5ml0.075M KCl，反复吹打混匀，37°C孵育20分钟；
6)缓慢贴壁加入Iml的固定液，室温孵育5分钟，2000rpm室温离心10分钟，弃上清至约 Iml ；
7)沉淀吹打混匀，缓慢加入Iml固定液，轻柔吹打混匀。再加入5ml的固定液，放入-20°C冰箱中至少I小时以上；
8)2000rpm室温离心10分钟，尽可能吸尽上清。
[0016]2.滴片
1)视细胞沉淀量酌情加入固定液，吹打混匀，滴于(3ul悬液)准备好的干燥玻片上，自然晾干后于光镜下观察细胞密度，10倍镜下每一视野内细胞数不少于100个，根据镜检结果用新鲜固定液调整细胞悬液浓度，重新滴片备用；
2)室温下过夜老化或60°C热台烘烤30分钟老化备用。
[0017]3.杂交前处理
1)取出玻片，放入IXPBS室温洗涤3分钟；
2)取出玻片，放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟；
3)取出玻片，放入室温IXPBS中3分钟；
4)取出玻片，放入另一缸室温IXPBS中3分钟；
5)取出玻片，再将其依次放入室温70%，90%，100%梯度乙醇脱水各2分钟；
6)取出玻片，室温晾干。
[0018]4.杂交
1)从_20°C冰箱中取出探针干粉，震荡混匀，瞬时离心；加入10ul的缓冲液，混匀后作为杂交液；
2)加10μ I的杂交液(含3号染色体)到杂交区域，迅速盖上22 X 22mm盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；
3)用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；
4)将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性85°C:10分钟，杂交42°C:20分钟。
[0019]5.杂交后处理
1)将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片(若盖玻片难以去除，可以将其放入洗液I中微微摇晃，以利于其脱落)；
2)玻片放入洗液中室温孵育5分钟；
3)取出玻片，再将其放入洗液中室温孵育2分钟； 4)取出玻片，自然干燥玻片。
[0020]6.镜检
相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察；其中，3号染色体探针显示为绿色信号。
[0021]注意事项:FISH检测第4-6步需避光操作。
[0022]三、检测结果:
镜检结果如图1所示。从图中可以看出，本发明的检测试剂盒中所使用的探针，可以与目的序列快速稳定的结合，检测结果准确可靠，同时大大缩短了人3号染色体荧光检测时间。
【主权项】
1.一种新型人3号染色体探针的制备方法及其应用，通过NCBI Mapview数据库检索并下载人3号染色体的序列，在染色体着丝粒上找到重复性高，特异性好的序列作为3号染色体的特异性探针，其中，3号染色体特异性探针的序列为： 探针 I :TGAGTTTGGAAACAGTCAGTTTGTA 探针 2 ： CACTTTGAGGCCATTGGTGGAAAAG 探针 3 ： CTTGTCTGTGGAATTTGCAAGGGGA 探针 4 ： CAACTCACAGAGTTTAACCTTTCTT 探针 5 ： CTCAGGAACTACTTTGTGATATGTG 探针 6 ：ATATTTGGACCTCTTTGAGGCTTTC 探针 7 ：ACAGAATCATTCTCAGGAACTACTT 探针 8 ： CTTCCTTTAGACAGTGCAGATTTGA 探针 9 ： CATAATGCTAGACAGAAGAATTCTC 探针 10 ： CTTCTTTTGGGATGTATGTATTCA 探针 11 ：AGTTGAACCTTCCTTTAGACAGAGC 探针 12 ： CACTCTTTTTGTGGAATTTGCAAG 探针 13 ：ATTCTAGCAGTATGAGGCCAATGGT 探针 14 ： CATTCTCAGAAACTGCTTTGTGATG 探针 15 ： CTCTTTGAGGCCTTCGTTGGAAACG 探针 16 ： CATAGAGCAGTTTGGAAAGACTTAG 探针 17 :CTCAGTAGCTTCTTTGTGTGTGTG。
2.根据权利要求I所述的人3号染色体新型探针，其特征在于：3号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。
3.根据权利要求1，2所述的人3号染色体新型探针，其特征在于：探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。
4.根据权利要求1，2，3所述的人3号染色体新型探针，其特征在于：3号染色体特异性探针所用缓冲液为：20mM ?50mM Tris-HCl (PH8. O ?8. 8)，IOmM MgCl2,10% ?30% 甲酰胺。
5.根据权利要求1，2，3，4所述的人3号染色体新型探针，其特征在于：3号染色体特异性探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。
【专利摘要】本发明涉及新型快速FISH探针的制备方法，用这种方法制备了人3号染色体特异性探针进行试验，试验结果表明，新型快速FISH探针的制备方法能够准确快速地对人3号染色体进行定位，对未来染色体异常快速检测方法的探究起指示性作用。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68, C12N15-10
【公开号】CN104830844
【申请号】CN201510211541
【发明人】陈华云, 刘淑园, 陈嘉昌, 丁渭, 肖湘文, 黄爽, 曾烨, 赵丽, 方凤银
【申请人】广州和实生物技术有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月29日