用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴别绿壳蛋鸡的引物组合物及其应 用。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择(MAS，markerassistedselection)是随着现代分子生物学技 术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从 而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。目前，MAS技术应用主要集中在基因聚合（Gene pyramiding)、基因渗入（Genetransgression)、根据育种计划构建基因系等方面。在家禽 育种上，分子辅助标记选择运用的非常广泛。如对羽速，胫长，及裸颈性状的表型选择非常 成功，而且广泛应用与生产，以相应的快慢羽基因（Kk)，性连锁矮小基因（dwarf，dw)及裸 颈基因作为分子标记进行MAS的技术，在育种和生产中也逐渐得到应用。
[0003] SLC01B3基因属于有机阴离子转运蛋白（organicanion-transporting polyp印tide)家族，能帮助胆盐类物质跨膜运输至卵壳腺，卵壳腺上皮细胞将胆绿素 分泌至蛋壳中，使得蛋壳最终呈现绿色。DavidWragg和JoramM.Mwacharo等人通过 RT-PCR(real-timePCR)的检测在美国和欧洲本地鸡种Mapuchefowl的研宄上发现 SLC01B3基因在母鸡的输卵管和壳腺部有过量的表达。他们通过全基因组相关联分析 (GWAS)的方法发现鸡3号染色体上EAV-HP的长末端重复序列转插入到了鸡1号染色体 SLC01B3基因和SLC01C1基因之间，这就是SLC01B3过量表达的原因。另一个候选基因 HM0X1，则未过量表达。由于SLC01B3基因SLC01C1之间存在EAV-HP插入序列促使SLC01B3 基因过量表达，从而产生绿壳蛋。绿壳蛋基因型（LS)相对非绿壳蛋基因型（CC)为显性，所 以在母鸡体细胞中只要包含一条SLC01B3基因的染色体单链就可以出现绿壳蛋的表型，而 如果公鸡是杂合子，则理论上后代一半群体中含有非绿壳蛋基因型，而但在表型选育种无 法将这一部分剔除，从而选育精准度不高，所以有必要对进行分子标记选择。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于鉴别绿壳蛋鸡的引物组合物及其应用。
[0005] 本发明中用于鉴别绿壳蛋鸡及其基因型的引物组合物，包括2对引物 对，其中，1对引物对为SLC01B3基因插入EAV-HP序列引物，序列为：上游引物： 5'-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'，下游引物：5' -GGACGAGCGAACGGAGAC-3'，如 SEQIDNO. 1、2所示；另一对引物对为SLC01B3非插入序列引物，序列为：上游引物： 5' -ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'，下游引物：5' -ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT-3'，如SEQ IDNO. 1、3 所示。
[0006] 所述引物组合物可以应用于鉴别绿壳蛋鸡的基因型。
[0007] 应用所述引物组合物鉴别绿壳蛋鸡基因型的方法，包括如下步骤：以待测鸡的 DNA基因组为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，扩增产物进 行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果：若只得到209bp的条带，则待测鸡的SLC01B3基因基因 型为LS/LS显性纯合型；若只得到312bp的条带，则待测鸡的SLC01B3基因基因型为CC/CC 隐性纯合型；若得到209bp和312bp的两条带，则待测鸡的SLC01B3基因基因型为为LS/CC 杂合型。。
[0008] 其中，所述PCR扩增反应条件为：95°C预变性5min;95°C变性30s，57°C退火30s， 72°C延伸30s，38个循环；之后，72°C延伸5min;反应体系：25微升体系，2XPCRMasterMix 12. 5yL，上游引物（10yM) 1yL，下游引物 1 (10yM) 0. 5yL，下游引物 2 (10yM) 0. 5yL， DNA模板1yL，灭菌过的超纯水9. 5yL。
[0009] 本发明还保护所述引物组合物在制备鉴别绿壳蛋鸡及其基因型试剂盒中的应用。
[0010] 本发明还包括含有权利要求1所述的引物组合物的试剂盒，及其在鉴别绿壳蛋鸡 及其基因型中的应用。
[0011] 本发明还包括一种用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的分子标记，显性SLC01B3基因分子 标记的序列如SEQIDNO. 4所示，隐性SLC01B3基因分子标记的序列如SEQIDNO. 6所示。 该分子标记可用于鉴别绿壳蛋鸡的基因型。
[0012] 根据Ensemble数据库的信息，鸡SLC01B3基因共20032bp，位于1号染色体的 65, 317, 306-65, 337, 388bp。SLC01B3基因SLC01C1之间存在EAV-HP插入序列，插入位点位 于鸡1号染色体基因序列的65,319,447处。本发明通过设计合成3条引物用于多重PCR 扩增，扩增SLC01B3基因插入EAV-HP引物序列为序列1和序列2组成的引物组合物，扩增 SLC01B3非插入引物序列为序列1和序列3组成的引物组成物。可以通过检测扩增产物来 鉴定待测鸡的SLC01B3基因基因型。
【附图说明】
[0013] 图1 :SLC01B3基因插入EAV-HP测序图；
[0014] 图2 :SLC01B3基因非插入EAV-HP测序图；
[0015] 图3 :SLC01B3基因EAV-HP插入序列的三种基因型琼脂糖电泳图。
【具体实施方式】
[0016] 下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0018] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0019] 以包含SLC01B3基因的待测鸡全基因组DNA为模板，设计特定的引物对以引物对 扩增鸡SLC01B3基因EAV-HP插入片段序列，将扩增产物直接在1%的琼脂糖凝胶电泳上进 行电泳，电泳完毕后采用凝胶成像系统拍照，判定个体基因型进行判定。具体实施方法：
[0020] (1)特定引物的设计：
[0021] 以NCBI公布的红色原鸡序列（NC_006093. 2)和文献《EndogenousRetrovirus EAV-HPLinkedtoBlueEggPhenotypeinMapucheFowl》中公布序列做为参考，利用 Primer6. 0 设计PCR引物，
[0022] 其EAV-HP插入片段扩增序列为：
[0023] 上游引物：ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG，（序列表中的序列 1)
[0024] 下游引物：GGACGAGCGAACGGAGAC，（序列表中的序列2)。
[0025] 其扩增产物长度为209bp;
[0026] 非插入片段扩增序列为：
[0027] 上游引物：ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG，（序列表中的序列 1)
[0028] 下游引物：ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT，（序列表中的序列 2)
[0029] 其扩增产物长度为312bp。
[0030] (2)鸡样本的采集：
[0031] 以2个鸡品种/系作为检测对象，其中绿壳蛋鸡从江西引进，属于培育品种，旧院 黑鸡属于地方品种。具体采集样本见下表：
[0032] 表1试验材料
[0033]
【主权项】
1. 用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物，其特征在于，包括2对引物对，其中，1对引物对为 SLCO1B3基因插入EAV-HP序列引物，序列为：上游引物：5'-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'， 下游引物：5' -GGACGAGCGAACGGAGAC-3'，如 SEQ ID NO. 1、2 所示；另一对引物对为 SLC01B3 非插入序列引物，序列为：上游引物：5' -ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'，下游引物： 5' -ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT-3'，如 SEQ ID NO. 1、3 所示。
2. 权利要求1所述的引物在鉴别绿壳蛋鸡基因型中的应用。
3. -种应用权利要求1所述引物鉴别绿壳蛋鸡基因型的方法，其特征在于，包括如下 步骤：以待测鸡的DNA基因组为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，获得PCR扩 增产物，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果：若只得到209bp的条带，则待测鸡 的SLC01B3基因基因型为LS/LS显性纯合型；若只得到312bp的条带，则待测鸡的SLC01B3 基因基因型为CC/CC隐性纯合型；若得到209bp和312bp的两条带，则待测鸡的SLC01B3基 因基因型为为LS/CC杂合型。
4. 根据权利要求3所述的鉴别绿壳蛋鸡基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增 反应条件为：95°〇预变性511^11;95°〇变性308,57°〇退火308,72°〇延伸308,38个循环 ；之后，72°C延伸5min;反应体系：25微升体系，2XPCR Master Mix 12.5yL，上游引物 (10 μΜ) 1 μ L，下游引物 1 (10 μΜ)0· 5 μ L，下游引物 2(10 μΜ)0· 5 μ L，DNA 模板 1 μ L，灭菌过 的超纯水9. 5 μ L。
5. 权利要求1所述的引物在制备鉴别绿壳蛋鸡基因型的试剂盒中的应用。
6. 用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所 述的引物。
7. 权利要求6所述的试剂盒在鉴别绿壳蛋鸡基因型中的应用。
8. -种用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的分子标记，其特征在于：显性SLC01B3基因分子标 记的序列如SEQ ID NO. 4所示，隐性SLC01B3基因分子标记的序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 如权利要求8所述分子标记在鉴别绿壳蛋鸡基因型中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用。该引物组合物包括2对引物对，其中，1对引物对为SLCO1B3基因插入EAV-HP序列引物，序列如SEQ ID NO.1、2所示；另一对引物对为SLCO1B3非插入序列引物，序列如SEQ ID NO.1、3所示。以待测鸡的DNA基因组为模板，用所述引物对其进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，可以通过检测扩增出的209bp和312bp条带来鉴定待测鸡是否产绿壳蛋，同时可以鉴定鸡绿壳蛋基因型。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104830843
【申请号】CN201510194180
【发明人】赵小玲, 李思辰, 舒刚, 朱庆, 张露, 崔璨, 尹华东, 王彦, 刘凌斌, 竭航
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月22日