人外周血循环dna的引物序列及定量检测试剂盒的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生物技术，是一种基于定量核酸扩增的分子生物学方法，特别涉及实时定量多聚酶链反应（real-timePCR)，通过使用特异性的引物扩增人外周血中循环DNA的保守基因Alu的不同片段，通过检测释放的荧光信号对人外周血中循环DNA进行定量检测。【
背景技术：
】[0002]循环DNA(circulatingDNA)又称游离DNA(cell-freeDNA，cf-DNA)是一种存在于动植物和人的体液中的无细胞状态的胞外DNA。1977年，Leon等首先发现肿瘤患者血浆DNA含量明显增高，提出了监测外周血游离DNA水平在观察疗效、预测复发方面的作用（LeonSA，ShapinoB，SkaaroffDM，etal.FreeDNAintheserumofcancerpatientsandtheeffectoftherapy[J].CancerRes.1977?37(3)：646)〇^SuzukiN?KamatakiA，YamakiJ?etal.CharacterizationofcirculatingDNAinhealthyhumanplasma.ClinChimActa，2008,387(1-2):55-58"研究表明健康人循环DNA含量极微，约在5ug/L左右。文献"MulcahyHE，LyauteyJ，LederreyC，etal.AprospectivestudyofK-rasgenemutationintheplasmaofpancreaticcancerpatients[J].ClinCancerRes，1998,4(2):271"、"GeorgG6bel，DorisAuer，IngeGaugg，etal.PrognosticsignificanceofmethylatedRASSF1AandPITX2genesinblood-andbonemarrowplasmaofbreastcancerpatients[J].BreastCancerResTreat，2011，130(8)：109-117"和"ChanSL，ChanAK，HuiEP?etal.QuantitationofcirculatingmethylatedRASSF1AinprognosticationandmonitoringoftreatmentresponseinunresectablehepatocellularcarcinomafHCC).JClinOncOl，2011，29(suppl):abstr4058"记载，当机体处于肿瘤、自身免疫性疾病和炎性反应等情况下，体内循环DNA的含量会相应的增加，但其产生的机制至今仍不十分明确。目前循环DNA的血清学检测还不能直接用于疾病的早期诊断和疗效判断，但它与一些疾病的产生与发展有着密切的联系，因此检测循环DNA并对某些已知病种的特异性基因进行确定具有重要的临床意义，循环DNA将有可能成为颇具前景的疾病早期诊断和疗效判断的新型分子标志物。[0003]目前，国内外应用较多的定量检测方法可分为两大类：一是以聚合酶链反应(PCR)为基础的扩增方法，如甲基化特异性PCR法（methylationspecificPCR，MSP)和实时焚光定量PCR法（real-timefluorescencequantitativePCR，RTFQ_PCR);二是信号放大技术检测方法，如支链DNA(branchedDNA，bDNA)检测技术。过去几年中研究循环DNA浓度的研究者多采用基于定量PCR的分析方法，例如"EllingerLMlillerDaMUllerSC，etal.CirculatingmitochondrialDNAinserum：Auniversaldiagnosticbiomarkerforpatientswithurologicalmalignancies.UrolOncol，2012,30(4):509-515"和"HuangZ，HuaD，HuY，etal.QuantitationofplasmacirculatingDNAusingquantitativePCRforthedetectionofhepatocellularcarcinoma.PatholOncolRes，2012,18(2)：271-276"，高灵敏性的实时PCR方法为仅测量可被特异性扩增的DNA信号提供了条件，可以检测皮克（pg)级的DNA。当然也有一些改进技术或联合应用技术可以更加精确地测定循环DNA的含量，但尚无统一的标准。[0004]随着分子生物学的飞速发展，分子检验技术已成为临床检验技术和病理诊断技术中最热门的技术方法，比如Real-timePCR技术在乙肝、丙肝和人乳头瘤病毒（HPV)以及乳腺癌、肺癌中的应用，为个体化诊治方案提供了坚实的理论基础。【
发明内容】[0005]本发明利用分子生物学Real-timePCR技术，基于Alu的可以作为人类DNA片段的特异性标记的基因序列特点（Alu是人类基因组中的一种中等重复序列，长约300bp，大约平均每隔6kb左右就有1个Alu序列，在哺乳动物内含量最丰富，同源性最尚，因此其可以作为人类DNA片段的特异性标记），设计了Alu基因不同长度产物的引物，从中选取特异性高的5对上下游Real-timePCR的引物，采用荧光定量PCR的方法扩增了不同长度的Alu片段，同时建立了Alu的标准品，可以定量检测不同Alu片段的拷贝数，从而反映人体循环DNA的数量，本方法具有高特异性、高敏感性，能够建立良好的、统一的分子质控标准，能够弥补不同检测结果之间缺乏可比性等缺点，是一个很好的循环DNA检测方法。[0006]本发明的第一个目的是克服现有检测方法的标准化和质控手段不完善等缺点。[0007]本发明的第二个目的是提供Alu的保守序列作为检测人外周血循环DNA。[0008]本发明的第三个目的是提供5对不同长度PCR产物的Alu高特异性引物和Alu标准品。[0009]本发明的第四个目的是提供一种简便的人外周血循环DNA定量检测的试剂盒。[0010]本发明的技术方案如下：[0011]一组用于扩增Alu的特异性引物，分别针对Alu保守序列的不同长度片段。5对引物分别是Alul-F(上游）、R(下游），Alu2-F(上游）、R(下游），Alu3-F(上游）、R(下游），Alu4-F(上游）、R(下游），Alu5-F(上游）、R(下游）。提供Alu的基因序列，作为检测的靶DNA片段，具有高度的保守性，同时提供5对引物的核酸序列。[0012]人外周血循环DNA的引物序列，为一组用于扩增Alu的特异性引物，分别针对Alu保守序列的不同长度片段；所述的一组包括五对引物分别是：[0013]第一对上游引物Alul-F:5'-agaccatcctggetaacacg_3'，[0014]第一对下游引物Alul-R:5'-agaeggagtetcgetctgtc_3'；[0015]第二对上游引物Alu2_F:5'-etaacaeggtgaaaccccg_3'，[0016]第二对下游引物Alu2_R:5'-egeccaggctggagtg-3'；[0017]第三对上游引物Alu3_F:5'-gtgaaaccccgtetctactaaaaa_3'，[0018]第三对下游引物Alu3_R:5'-gagtgcagtggcgegat_3'；[0019]第四对上游引物Alu4_F:5'-tacaaaaaattageegggcg_3'，[0020]第四对下游引物Alu4-R:5'-gatetcggcteactgcaag-3>;[0021]第五对上游引物Alu5_F:5'-aaaattageegggegtg_3'，[0022]第五对下游引物Alu5_R:5'-gttcacgeeattetcctgc_3'。[0023]-种配套5对引物的标准品，其为含Alu保守基因序列的纯化质粒，标准品经过基因工程技术将Alu目的基因序列连接到质粒上，通过鉴定、扩增、提取和纯化获得，并通过260nm进行吸光度读取，进行浓度计算分析获得的DNA准确的拷贝数目，并通过稀释制备成不同浓度的标准品。[0024]具体为：[0025]含有Alu基因片段SEQIDNO.13的纯化质粒；制备过程通过对Alu扩增后获得目的片段并连接TOC57载体；用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2引物对Alu进行扩增，程序为95°C2min;94°C20sec，55°C30sec，72°C30sec共35个循环，条件为包含400yMdNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、100mMKCl、4mMMgC12、0.2U/ylTaqDNA聚合酶，通过以上方法获得Alu目的片段；Alu目的片段和PUC57质粒经过内切酶EcoRI和Hindlll在37°C，2小时以上（AluPCR产物或者PUC57质粒10uL、10XRBuffer2uL，EcoRI酶luL，HindIIII酶luL，水6uL)，酶切产物经过PCR产物纯化柱纯化获得20uL酶切产物；酶切产物再经过T4连接酶22°C反应12小时（Alu酶切产物5uL、PUC57质粒2uL、T4连接酶luL、10XBufferluL、水luL)，随后通过标准的基因工程技术，进行筛选、扩增和纯化，并通过对质粒进行DNA测序证实Alu已经被连接于质粒PUC57载体；对纯化质粒进行260nM的吸光度检测，计算质粒的拷贝数。[0026]-种检测人外周血循环DNA的试剂盒：[0027]试剂A1-A5:由5对针对Alu不同长度PCR产物的引物组成的5种溶液。A1-A5溶液分别包含5uMAlul-F(上游）、5uMAlul-R(下游），5uMAlu2-F(上游）、5uMAlu2-R(下游），5uMAlu3-F(上游）、5uMAlu3-R(下游），5uMAlu4-F(上游）、5uMAlu4-R(下游），5uMAlu5-F(上游）、5uMAlu5-R(下游）；[0028]其中，[0029]试剂A1:由第一对上游引物Alul-F(5yM)、第一对下游引物Alul-R(5yM)，溶解于水；[0030]试剂A2:由第二对上游引物Alu2-F(5yM)、第二对下游引物Alu2-R(5yM)，溶解于水；[0031]试剂A3:由第三对上游引物Alu3-F(5yM)、第三对下游引物Alu3-R(5yM)，溶解于水；[0032]试剂A4:由第四对上游引物Alu4-F(5yM)、第四对下游引物Alu4-R(5yM)，溶解于水；[0033]试剂A5:由第五对上游引物Alu5-F(5yM)、第五对下游引物Alu5-R(5yM)，溶解于水；[0034]试剂B:2XSYBRGreenqPCRMix，包含包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP的400yMdNTPs、100mMKCl、4mMMgC12、0.2U/y1TaqDNA聚合酶和2XSYBRGreen;[0035]试剂C:R0X(50X)或者ROXII(当前第1页1 2