一种抑制核酸扩增产物污染的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抑制核酸扩增产物污染的方法及应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 现如今在食品质量安全检测、临床医学以及法医鉴定中，对于致病菌、目标DNA的 检测大多用核酸扩增的方法，主要为PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增（LAMP)等方法。 而在检测过程中，各检测实验室常被核酸扩增产物的污染所困扰，由于核酸污染所导致的 假阳性结果会造成检测的失败。然而，到如今对于这种污染的预防多数都在于实验室对环 境和设施的严格分区管理和定期的清洁制度。一旦发生了核酸的污染，采取的措施就是对 污染区域用次氯酸钠进行彻底的清洁、2周之内不要做任何的扩增实验或更换实验地点，使 DNA进行自身的降解以达到消除核酸扩增产物造成的污染。这些就是现阶段对于消除核酸 扩增产物污染的有效手段。但是，所需要消耗的费用、人员和时间都很多，不利于检测工作 的进行，并造成了较大的时间和经济损失。
[0003] 叠氮溴化丙锭（PMA)是biotium公司开发的一种具有高亲和力的光敏DNA绑定染 料。染料本身具有弱荧光的，但是和核酸结合之后荧光性变强。它具有高亲和性并优先结 合到双链DNA上。由于光解作用，染料上光敏的叠氮基转化为高反应性的氮烯基，其易于与 结合部位的任何烃（碳氢化合物）部分反应，形成稳定的共价键的氮-碳键，从而导致永久 性的DNA修饰。染料几乎完全细胞膜不透性，从而可以用于有选择地修饰只从死细胞中暴 露出来的DNA，而远离活细胞中完整的DNA。目前，对PMA的应用主要是去除死菌对检测结 果的影响，还没有利用PMA进行抑制核酸扩增产物污染的报道。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种抑制核酸扩增产物污染的方法，所采取的技 术方案如下：
[0005] 本发明的目的在于提供一种抑制核酸扩增产物污染的方法，该方法是利用叠氮溴 化丙锭溶液处理污染有核酸扩增产物的环境，再对环境进行曝光处理。
[0006] 所述方法的步骤如下：
[0007] 1)利用二甲基亚砜（DMS0)或水溶解叠氮溴化丙锭，配制叠氮溴化丙锭溶液； [0008] 2)将步骤1)所得的叠氮溴化丙锭溶液溶解、喷洒或涂抹到污染环境中；
[0009] 3)对步骤2)经过处理的环境进行曝光处理。
[0010] 优选地，步骤1)所述配制叠氮溴化丙锭溶液，是利用二甲基亚砜或水溶解叠氮溴 化丙锭至浓度2mM以上。
[0011] 优选地，步骤2)所述将叠氮溴化丙锭溶液溶解喷涂污染环境中，抑制PCR产物时， 叠氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在〇. 〇3mM以上。
[0012] 优选地，步骤2)所述将叠氮溴化丙锭溶液溶解喷涂污染环境中，抑制LAMP产物 时，叠氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在〇. 148mM以上。
[0013] 优选地，步骤3)所述曝光处理，是在光强11151ux-1115001ux下，处理0.5-30min。
[0014] 更优选地，所述曝光处理，是在光强1115001ux下处理30s。
[0015] 更优选地，所述曝光处理，是在光强11151ux下处理30min。
[0016] 所述方法的具体步骤如下：
[0017] 1)利用二甲基亚砜溶解叠氮溴化丙锭至浓度为2mM，获得叠氮溴化丙锭溶液；
[0018] 2)将步骤1)所得的叠氮溴化丙锭溶液溶解、喷洒或涂抹到污染环境中，其中，在 抑制PCR产物时，叠氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在0. 03mM以上，在抑制LAMP产物时，叠 氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在0. 148mM以上；
[0019] 3)在光强1115001ux下处理30s。
[0020] 所述方法用于预防和消除实验室或工厂中的核酸扩增产物的污染。
[0021] 优选地，所述方法，的具体步骤如下：
[0022] 1)利用二甲基亚砜溶解叠氮溴化丙锭至浓度为2mM，获得叠氮溴化丙锭溶液；
[0023] 2)将步骤1)所得的叠氮溴化丙锭溶液溶解、喷洒或涂抹到污染环境中；
[0024] 3)在光强1115001ux下处理30s;
[0025] 4)处理结束后，利用无污染的水清洗或喷涂污染环境后，在光强1115001UX的条 件下处理30min，以消除残留PMA对日后实验可能的影响。
[0026] 本发明的原理在于，由于PMA结构中带有一个叠氮基团（_N3)，在光激发下脱去 (_N2)形成活跃的氮宾中间体，能与DNA形成永久性的共价键（-NH-CH，)，使DNA不能发生 扩增反应。
[0027] 本发明所取得的有益效果如下：
[0028] 1.本发明所提供的方法可以有效的抑制PCR、实时荧光定量PCR(resl-time PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增技术（NASBA)、链置换扩增（SDA)技术和环 介导等温扩增（LAMP)技术等核酸扩增方法中所产生的污染，解决了阳性核酸扩增产物对 日后核酸扩增实验的干扰问题，能够很好的抑制核酸扩增过程中，假阳性结果的出现。
[0029] 2.本发明所提供的方法，操作步骤十分简单方便，耗时也很短。本发明所提供的方 法省略了现有技术在黑暗中孵育的步骤，也可以获得良好的技术效果。同时，利用本发明所 提供的方法处理过的环境，处理结束后立即就可进行扩增实验，无需等待污染源自身降解， 大大缩短了处理时间。
[0030] 3.在本专利之前，叠氮溴化丙锭主要是对活菌和死菌进行区分，细菌的DNA常为 低卷曲的负性超螺旋结构。现有技术仅能说明叠氮溴化丙锭可以与这种低卷曲的负性超螺 旋结构DNA进行结合，并产生抑制作用，却尚无研宄证明叠氮溴化丙锭对经过LAMP扩增以 后形成的具有不同个数茎环结构和多环菜花样结构的DNA也可以起到抑制作用。本发明所 提供的方法实现了对环介导等温扩增（LAMP)技术所产生的特殊的茎环状结构扩增产物的 抑制，能够避免污染LAMP扩增产物所引起的假阳性结果。
【附图说明】
[0031] 图1为实施例2中PMA对LAMP产物的污染的抑制效果；
[0032](M:Marker;1:阳性；2-7:暗孵育时间分别为Omin;lmin;2min;3min;4min; 5min;8 :阴性）。
[0033] 图2为实施例3中不同光源的灯光对核酸产物抑制效果的影响；
[0034](M:Marker; 1 :阳性；2 :光照强度为1115lux的白炽灯光照；3 :光照强度为 11151UX的卤素灯光照；4 :阴性）。
[0035] 图3为实施例4中DMSO对于LAMP产物污染抑制效果的影响；
[0036](M :Marker;1 :2ul2mMPMA处理LAMP产物；2 :2ulDMSO处理LAMP产物；3 :阳 性）。
[0037] 图4为实施例5中PMA对LAMP产物的抑制效果；
[0038](M:MarkerD2000 ;1:阳性