一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术的构建及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术和该技术在产糖醇异常毕赤酵母{Pichia anomala)基因组改造中的应用。
【背景技术】
[0002]糖醇是指糖类的醛、酮羰基被还原为羟基后生成的多元醇，通式H(CHOH)n+1H，由于加氢作用而失去了还原性，每个碳原子上会连有一个羟基。它们具有很多独特的性质，例如在机体内的代谢能量较低，可防治牙齿龋变，与低胰岛素代谢响应，因此，是一类重要的功能性食品原料。此外，糖醇在医药领域，化工领域以及动物营养等方面也具有更多的应用。在医药领域，它们是药物合成的重要中间体，广泛用于阿糖胞苷、阿拉阿糖腺苷、D-核糖、L-核糖、去氧核糖、L-阿拉伯糖等的合成原料。如D-阿拉伯糖醇的衍生物1，4_ 二脱氧-1，4-亚胺基-D-阿拉伯糖醇是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，可防治艾滋病。糖醇还可以作为运输介质，以通过血脑屏障。另外，在化工方面，可以有机合成制取醇酸树脂和表面活性剂，糖醇是高分子发泡材料合成的激活剂，可用做显影材料的稳定剂，还可增强铝电容器在高温下的可靠性以及提高电解质溶液的黏度等。因而，糖醇作为一类高附加值产品已广泛应用于食品、医药、化工、皮革、涂料以及国防等行业。其中，D-阿拉伯糖醇与木糖醇是研宄较多的一类多功能五碳糖醇，2004年被美国能源部(DOE)列为12类高附加值生物基化学品之一 O
[0003]目前糖醇的主要生产方法有:自然提取法、化学合成法及生物合成法。糖醇广泛存在于自然界植物中，但含量很少，提取困难，直接提取不经济。化学合成法在高温高压条件下催化加氢得到糖醇，该方法过程较复杂、设备投资大、安全要求高、操作费用高、污染较严重、底物要求高等。生物合成方法具有安全、高效、绿色等潜在优势，其反应条件温和，并显示出严格的对映选择性或区域选择性，还避免了化学合成法所需高温高压反应条件和昂贵的催化剂，节省能源消耗。作为一种重要催化载体，微生物在化学品生物合成中的应用越来越广泛。糖醇生物合成主要是利用产糖醇的微生物发酵或转化葡萄糖、木糖以及木糖母液等生物质原料，关于微生物制造多功能糖醇的研宄已经广泛开展，主要包括产糖醇代谢工程菌株的构建以及天然产糖醇微生物的筛选与改造。随着生物技术的不断发展与成熟，微生物发酵工业得到快速发展，其中工业菌种性能的改良是重要推动力。然而，工业菌株的高产、高耐性等优良特性是由大量基因共同决定的，而大多数工业微生物菌株改良所面临的问题。虽然理化诱变等传统育种手段在工业微生物菌种改良中发挥了重要作用，但它们需要与现代育种手段相结合才能发挥更高的育种工作效率。
[0004]基因组改组技术(Genome shuffling)是一种典型的全面组合技术手段，是全基因组代谢工程的延伸，可以快速、高效地筛选出优良菌株，作为的重要基因组工程技术在进化工程得到广泛的应用。Stemmer等提出了全基因组改组技术，它是一种建立在传统诱变育种、细胞融合与高通量筛选基础之上的体内分子育种新技术，使诱变过程中产生的丰富的基因组(多种突变表型)，由原生质体融合而发生大片段改组。随后，经过选择，使多种正向突变在融合菌株中积累，加速获得目的性状的突变菌株，消除传统诱变步步积累的繁琐、低效以及积累大量有害突变的缺点。
【发明内容】
[0005]本发明属生物技术领域，构建了一种新型高效的产糖醇酵母基因组重排技术，并成功应用于产糖醇酵母的菌种改造，提高了重组与筛选效率。
[0006]在前期研宄中，我们获得一株产糖醇PicAia anomala TIB-x229 (CGMCC N0.5482)，可以高效利用不同糖底物生产D-阿拉伯糖醇，木糖醇和核糖醇。为了进一步提高该菌株的糖醇生产性能，首先构建了基于高通量的高碘酸盐-糖醇比色法筛选技术和荧光染料标记的酵母原生质体融合子筛选技术的高效基因组重排技术，将其应用于对产糖醇异常毕赤酵母的改造，极大地提高了基因组重排效率，加速了菌株性能的改良，获得一株高产糖醇异常毕赤酵母重组菌株{Pichia anomala TIBG2-3)，其糖醇产量提高34%，已于2014年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.10260，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0007]本发明与现有技术比，有如下特点:
1.构建优化了糖醇比色检测方法，实现了高通量筛选。糖醇检测浓度在0-16 g/L时具有良好的线性关系，并且残余底物和副产品如葡萄糖，乙醇对糖醇检测无干扰。此外，显色法与高效液相色谱法一致性较好，适合于产糖醇菌株的高效准确筛选。因此，该显色方法具有操作简单，高效筛选，安全系数高，成本低等优点，在多羟基醇的高效筛选中具有实际应用价值。
[0008]2.构建优化了荧光染料标记的酵母原生质体融合子筛选策略，实现酵母融合子的高效融合筛选，为缺少遗传标记的天然酵母原生质体融合提供高效方法。
[0009]3.整合上述构建的两种方法，构建高效的产糖醇酵母基因组重排技术，并在天然异常毕赤酵母中得到成功的应用，短时间内提高糖醇产量34%以上。
【附图说明】
[0010]附图1:高碘酸盐-糖醇比色法标准曲线及干扰实验结果A.比色法糖醇筛选流程图；B.比色法标准曲线；C.不同浓度底物与代谢产物对糖醇检测的干扰；D.比色法与高效液相色谱法在糖醇检测中的比较
附图2:基于荧光染料标记的原生质体融合流式分析分选。A.空白酵母原生质体；B.红色荧光核酸染料标记的原生质体；C.绿色荧光核酸染料标记的原生质体；D.双荧光染料标记的原生质体。R表示不同激发光与发射光的筛选通道附图3:—种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术流程图附图4:野生型，突变体与重组异常毕赤酵母菌产糖醇性能评价具体实施
以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。
[0011]实施例1:
高效糖醇比色筛选方法的构建与优化:
分别配制4，6，8，10，12，14，16 (g/ L) D-阿拉伯糖醇标准溶液，分别取20 μ I标准溶液加入深孔板，然后加入500 μ I高碘酸钾溶液。混合后室温放置10分钟，然后加Λ 400 μ I 1% L-鼠李糖溶液，中和多余的高碘酸盐离子。经过进一步混合后，加入600 μ INash试剂，在63°C条件下反应20分钟。冷却后，转移200 μ I反应液至浅孔板，检测其在412nm处的吸光值，制作标准曲线。根据上述方法，取20 μ I待测样品进行检测，可根据OD412判断糖醇积累。
[0012]多元糖醇在酸性条件下(pHl.0)被高碘酸盐氧化生成甲醛，残余高碘酸被L-鼠李糖中和。然后Nash试剂与甲醛反应，产生黄色3，5-二乙酰-1，4-脱氢二甲基吡啶，其最大在吸收峰值在412nm处(图la)。结果表明，当D-阿拉伯糖醇浓度在0_16 g/L时，标准曲线具有良好的线性关系(图lb)。而当D-阿拉伯糖醇浓度达到20 g/L时，糖醇线性关系有一定影响，但是仍存在正相关性，因此，该比色法糖醇筛选浓度范围为0-20 g/L,极大的拓展了显色法筛选的应用范围。
[0013]为了分析底物与副产物对糖醇筛选的影响，我们进行了对不同浓度葡萄糖和乙醇的干扰实验。结果表明:不同浓度的葡萄糖和乙醇(1-30 g/L)对检测值并没有干扰。此夕卜，为了进一步评估显色法在生物转化检测中的应用，将该方法和高效液相色谱法进行了比较。结果表明，两种检测方法的一致性较好，从而进一步证明了优化后的比色法是适合于产糖醇菌株的高效筛选。由于在96深孔培养板的条件限制，糖醇产量整体偏低，浓度范围低于10 g/L，因此，