一种胰激肽原酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种胰激肽原酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 胰激肽原酶原料药系自猪胰中提取的蛋白酶，为类白色或淡褐色粉末，无臭，易溶 于水。胰激肽原酶是胰激肽释放酶的前体，在体内可激活生成胰激肽释放酶。胰激肽释放 酶为内切性蛋白水解酶，具有高度的专一性，对于高分子量或低分子量的激肽原均有作用， 胰激肽原酶在体内作用于激肽原释放出激肽，从而释放出胰激肽，胰激肽具有非常强的生 理效应，能使微血管舒张，有舒展毛细血管和小动脉作用，使冠状动脉、脑、视网膜等处的血 流供应量增加，血压下降。舒张微小动脉和毛细血管，改善微循环。激活磷酸脂酶4，促使 肾髓质分泌前列腺素E2，抑制氧化应激，增加血流量。促进前列环素（PGI2)分泌，抑制血栓 素（TXA2)生成，避免血小板过度聚集，降低血粘度，预防血栓形成，避免加重肾脏微循环损 害。胰激肽原酶作为一种国际公认的微循环改善剂，是一种疗效确切、不良反应轻微的酶类 药物，适宜于长期服用，适用于各种微血管循环障碍疾病的治疗。胰激肽原酶对早期肾病的 治疗效果显著，能有效地改善肾脏的微循环，与其它药物配合治疗，能降低肾小球入球动脉 压，具有促使肾小球基底膜早期损伤修复等作用，该产品的市场前景十分广阔。临床主要用 于高血压、冠状血管及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、肢端感觉异常、冻疮等症有 减轻症状作用。
[0003] 胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中经提取纯化而得到的，即从胰脏本身、胰酶粉 以及胰激肽原酶粗品（中间体）中提取，并通过纯化而制得。现有胰激肽原酶的纯化方法 包括使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换 纤维素上并分离（见日本专利发行No. 11697/62);或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激 肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交 联葡聚糖（Sephadex)上，并分离之（见日本公开专利发行No. 56886/73);另一种已知的纯 化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原 酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之（见日本公开专利No. 103715/73)。然而， 利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进 行大规模制备。而离子交换树脂法不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。因此，上述方 法得到产品的纯度还有待于进一步提高。
[0004] 亲和层析技术的基本原理蛋白质与配体之间有一种特殊的亲和力，在一定的条件 下，先将提纯的某种蛋白质的配体通过适当的化学反应，共价的连接在载体颗粒表面的功 能团上，可从溶液中专一性地分离和提纯蛋白质，达到较高的纯度。只需一步就能提纯百 倍，甚至千倍，从而得到纯的产品。
[0005][0006][0007] 发明人公开号为CN102787111A的中国发明专利是通过HS-S印harose亲和柱层析 纯化胰激肽原酶粗品，纯化得到的胰激肽原酶效价增加70单位/mg以上，比活达600单位/ mg蛋白以上。但是原有的亲和层析偶联固定相与大分子胰激肽原酶的亲和面积以及亲和专 一性还需要做进一步的改进，制备的胰激肽原酶的比活和效价增加还有待进一步的提高。
【发明内容】
[0008] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种胰激肽原酶的制备方 法，采用Aminoacids-Sepharose亲和柱层析进行分离纯化，制备的胰激肽原酶纯度高达 95 %以上，效价增加360单位/mg以上，比活达到920单位/mg蛋白以上，产品收率在90. 0 % 以上。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0010] 一种胰激肽原酶的制备方法，步骤如下：
[0011] ⑴配制：配制浓度为20~30% (g/ml)的无机盐平衡液，调整pH为4. 0 ;配制浓 度为20~30% (g/ml)的无机盐洗脱液，调整pH为6.0,检测溶液的电导值；
[0012] 配制无机盐平衡液和无机盐洗脱液所用的无机盐均选自硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾， 硫酸镁、氯化钠或氯化铵中的一种或多种。
[0013] (2)亲和柱层析：
[0014] 1)平衡：将制备的Aminoacids-Sepharose亲和层析偶联固定相填入层析柱中， 用步骤（1)配制的pH4. 0、浓度20~30% (g/ml)的无机盐平衡液平衡，直至进出层析柱的 溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
[0015] 2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于 平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上 样；
[0016] 3)洗涤：用pH4. 0、浓度20~30% (g/ml)的无机盐平衡液冲洗柱子，同时用紫 外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0. 5时停 止；
[0017] 4)洗脱：用pH6. 0、浓度20~30% (g/ml)的无机盐洗脱液洗脱柱子，流速300~ 340ml/min，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得 收集液；
[0018] 5)除菌：收集液用微孔滤膜进行除菌过滤，得无菌滤液；
[0019] 6)冻干：加入辅料进行冻干，即得胰激肽原酶，纯度95%以上，效价增加360单位 /mg以上，比活920单位/mg蛋白以上，收率90%以上。
[0020] 步骤1)中，所述Aminoacids-Sepharose亲和层析偶联固定相为八找：[11；[116-Sepharose，Histidine-Sepharose，或Lysine-Sepharose中的一种或多种。
[0021] 步骤1)中，所述Aminoacids-Sepharose亲和层析偶联固定相制备方法为：
[0022] ①将琼脂糖（S印harose)用5-10重量倍（g/g)的纯化水溶涨，加入质量浓 度为2 %~5 %的硫酸溶液，搅拌均匀；2 %~5 %硫酸溶液加入量为S印harose湿重 ("Sepharose湿重"即为加入纯化水溶胀后Sepharose的重量）30%~60%。
[0023] ②向步骤①搅拌均匀后的溶液中滴加质量浓度为3%~6%硝酸钠溶液，3%~ 6%硝酸钠溶液的加入量为S印harose湿重的30%~60%，搅拌，放置30分钟，水洗涤；
[0024] ③将组氨酸（Histidine)、精氨酸（Arginine)或赖氨酸（Lysine)用纯化水溶解， 得氨基酸水溶液，缓缓滴加到步骤②的Sepharose上，搅拌均匀；氨基酸水溶液的加入量为 Sepharose湿重的 6%~10%;
[0025] ④调整pH值至5. 0~7. 0,放置3~4小时，抽滤，纯化水洗至中性，即得。
[0026] 步骤1)③中，氨基酸水溶液的质量浓度为10%。
[0027] 步骤1)④中，调整pH值所用的溶液为碳酸钠溶液。
[0028] 步骤2)中，所述胰激肽原酶粗品液的制备方法为：取胰脏粉或胰脏，加20~30倍 量（重量倍数）纯化水溶解提取，搅拌均匀后调整pH为7. 0~8. 0,静置沉淀进行粗提纯， 冷冻静置沉淀，虹吸上清液，下层沉淀压滤得粗品液。
[0029] 步骤2)①中，pH调整采用氨水调节，冷冻静置沉淀温度为零下20°C以下，离心转 速为大于3000转/分。
[0030] 步骤2)②中，草酸盐溶液的组成为：每100ml草酸盐溶液中含1~1. 75g的草酸 铵，1~1. 75g的草酸钾。
[0031] 步骤（2)亲和柱层析步骤中，所用层析柱直径为q> 4〇cm，体积为50L;以洗脱液效 价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点。
[0032] 步骤5)中，所述微孔滤膜为0. 22ym的微孔滤膜。
[0033] 步骤6)中，所述加辅料冻干的具体步骤如下：辅料用注射用水加热溶解后过 0. 2