一种重组人血管舒缓素的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组人血管舒缓素、其制备方法及应用。更具体地，本发明涉及利 用分子生物学和宿主细胞生产方法制备重组蛋白，并通过特定纯化工艺首次获得高分子量 重组人血管舒缓素。本发明获得的高分子量重组人血管舒缓素能显著延长体内半衰期和减 少副作用，本发明还涉及重组人血管舒缓素在治疗脑梗塞的应用研宄。
【背景技术】
[0002] 人血管舒缓素（Kininogenase)是一种含有238个氨基酸的糖蛋白，它能使激肽原 降解成激肽，激肽与靶器官上特定受体结合能产生一系列生物效应，如扩张血管增加血流 量、改善血液循环的作用。
[0003]目前世界上仅有中国批准上市了人尿来源的血管舒缓素产品，众所周知，从人尿 中提取的产品具有潜在的病毒污染及生产质量不可控等缺陷，在欧美日等发达国家普遍不 接受人尿来源产品上市。日本企业最早从人尿中分离提取血管舒缓素并用于人的临床研 宄，但人尿血管舒缓素药物副作用大，特别是血压下降明显，因此日本最终没能批准人尿血 管舒缓素上市。
[0004] 相比而言，重组蛋白在其纯度、抗原性、安全性、无自身尿源性病毒感染等方面具 有尿源产品无法比拟的优点，展示出广阔的医用前景，但迄今国内外尚未有重组人血管舒 缓素药物上市。
[0005] 用基因重组技术来获得重组人血管舒缓素成为更好的选择，而要制备具有体内活 性的重组糖蛋白，现有的原核细胞（如大肠杆菌）和酵母细胞表达系统均无法实现，只有在 哺乳动物宿主细胞中表达重组蛋白才能实现较完整的糖基化，事实上，蛋白的糖基化程度 与蛋白体内活性和半衰期等功能密切相关，重组蛋白糖基化水平又取决于细胞培养条件和 纯化工艺。
[0006] 另一方面，现有的尿来源人血管舒缓素及重组人血管舒缓素由于其均采用的特殊 纯化工艺步骤（60°C恒温加热10小时）易导致其蛋白脱酰胺化程度较高，蛋白在体内易进 一步水解、异构化，从而影响蛋白整体的稳定性及产生副反应，进一步放大了其半衰期短和 副作用大等缺点；基于须去除潜在的病毒污染风险等考虑，已上市的尿来源人血管舒缓素 及重组人血管舒缓素均采用了 60°C恒温加热10小时的加热灭活病毒的方法，此工艺方法 导致蛋白脱酰胺反应会相当剧烈，而我们的实验也印证了这一点，市售尿来源的人血管舒 缓素脱酰胺水平接近50 %。由传统方法生产的尿来源人血管舒缓素或重组人血管舒缓素导 致N糖链的天冬酰胺位点脱酰胺化，影响蛋白纯度及稳定性，对于人血管舒缓素这种带有 复杂糖链的蛋白具有潜在的风险，因此，现有的尿来源人血管舒缓素或重组人血管舒缓素 存在半衰期短和副作用大等缺点。基于高温（60°C恒温加热10小时）加热灭方法的缺陷， 现代主流技术对含多个糖链蛋白纯化采用深层膜过滤等温和方法去除病毒。前期已发表的 诸多文献已证实多个糖链蛋白脱酰胺化与温度和PH具有密切关系，在重组人血管内皮抑 制素和抗体等生物工程领域前期研宄都证明了温度越高，脱酰胺作用越明显，目前上市的 抗体药物已经将脱酰胺水平作为一个重要的质控标准，因为其对产品潜在的安全性、副作 用等方面具有重要意义。
[0007] 有报道重组人血管舒缓素与人尿血管舒缓素分子量相近，迄今国内外尚未有高分 子量重组人血管舒缓素的研宄报导。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供一种高分子量重组人血管舒缓素、制备方法及其应用，该重组人 血管舒缓素脱酰胺水平不到10%，显著减少了副作用并延长了半衰期。优选，本发明提供一 种SDS-PAGE电泳测定分子量为43-49KD的高分子量重组人血管舒缓素、制备方法及其在治 疗脑梗塞中的应用。本发明的高分子量重组人血管舒缓素能显著延长体内半衰期和减少降 血压等副作用。
[0009] 本发明的一个目的是提供一种高分子量重组人血管舒缓素。该重组人血管舒缓素 是由238个氨基酸残基组成一条单链（见序列1)，N-末端和C一末端氨基酸残基分别为异 亮氨酸和丝氨酸，通过SDS-PAGE电泳测定，其分子量为43 - 49KDa。该重组人血管舒缓素 是一种糖蛋白，含3个N-Link糖基化结合位点，分别位于Asn78、Asn84及Asnl41，该重组 人血管舒缓素分子中含有5对S-S键，分别为Cys7 -Cysl50,Cys26 -Cys42,Cysl29 - Cysl96,Cysl61 -Cysl75 以及Cysl86 -Cys211，等电点约为 4. 0。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种高分子量重组人血管舒缓素的制备方法。该制备 方法包括：
[0011] 1.构建编码重组人血管舒缓素的基因表达载体：
[0012] 采用人工合成方法获得编码人血管舒缓素的前导肽和成熟蛋白基因（序列 No. 1)，插入到哺乳动物细胞表达载体（如pCMV/ZEO)或改进的表达载体（如pCMV-DHFR)， 获得含有人血管舒缓素目的基因表达载体PCMV-人血管舒缓素-DHFR。
[0013] 2.重组人血管舒缓素在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：
[0014] 将含有人血管舒缓素蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目 的蛋白的细胞株。
[0015] 3.高密度细胞培养生产重组人血管舒缓素：
[0016] 将上述筛选到的稳定细胞株转入细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到 1X107个/mL时，将温度由37°C降至33°C，在该温度下培养直至表达产量不再增加。
[0017] 4.高分子量重组人血管舒缓素的纯化：
[0018] (1)上层析柱前预处理：将上述含有重组人血管舒缓素的培养液进行离心去除细 胞碎片，收集细胞上清液调节pH并离心去除沉淀。
[0019] (2)阴离子交换柱层析：用同一根阴离子层析柱，使用不同NaCl浓度的Tris-HCl 缓冲液，〇. 2-0.4MNaCl穿柱，0.05-0. 15MNaCl挂柱，先后使重组人血管舒缓素蛋白穿柱和 挂柱，所述的阴离子交换柱包括：QSepharoseH.P，QSepharoseF.F，QSepharose4F.F， QS印haroseXL，QAES印hadexA-25,QAESephadexA-50,STREAMLINEQXL。优选，QAE SephadexA-25,QAESephadexA-50。
[0020] (3)亲和层析柱分步洗脱：采用亲和层析柱（BenzamidineSepharose4Fast Flow，GE)纯化，通过不同盐浓度的洗脱条件，在0.3-0. 8MNaClpH7. 5低盐浓度下，得到 含有高分子量重组蛋白的洗脱液，优选低盐浓度为0. 5MNaClpH7. 5 ;在1. 0-2.OMNaCl pH7. 5高盐浓度下，去除低分子量重组蛋白，优选1. 5MNaClpH7. 5高盐浓度，该方法可有 效分离高分子量和低分子量重组人血管舒缓素。
[0021] (4)疏水层析柱纯化：采用疏水层析柱，处理上述（3)中得到的高分子量重组人血 管舒缓素，利用高低分子量的差别，采用GE-AKTA系统梯度洗脱的方法，进一步去除低分子 量重组人血管舒缓素及其他杂质。
[0022] 所述的疏水柱包括ButylSepharose4FastFlow，OctylSepharose4Fast Flow,PhenylSepharose6FastFlow,Butyl-SSepharose6FastFlow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharoseCL-4B，PhenylSepharoseCL_4B〇 优选，Phenyl Sepharose6FastFlow。
[0023] (5)低PH灭火病毒：将上述含有高分子量重组蛋白溶液调节PH至3.8, 4°C恒温静 置1小时，实现病毒的灭活。
[0024] (6)阴离子交换柱层析：调节上述含有高分子量重组蛋白溶液的pH，使之带负电 荷，使目标蛋白结合到阴离子交换柱，实现高分子量重组蛋白的浓缩。
[0025]所述的阴离子交换柱包括QSepharoseH.P，QSepharoseF.F，QSepharose4 F.F，QS印haroseXL，QAES印hadexA-25，QAES印hadexA-50，STREAMLINEQXL。优选， QAESephadexA-25,QAESephadexA-50。
[0026] (7)分子筛凝胶柱纯化：通过凝胶柱纯化，使得高分子量重组人血管舒缓素蛋白 得到充分分离。
[0027] (8)将上述凝胶柱所得溶液通过深层过滤膜，去除病毒残留。
[0028] 最后将分离得到的高纯度高分子量重组人血管舒缓素蛋白用0.22ym微孔滤膜 除菌过滤。所述的凝胶柱包括SephadxG75，SephadxG100，Superdex30prepgrade， Superdex75prepgrade,Superdex200prepgrade,Superose6prepgrade,Superose12 prepgrade,SephacrylS-100HR,SephacrylS-200HR,SephacrylS-400HR,Sepharose2B, Sepharose4B，Sepharose6B〇 优选，SephadexG75〇
[0029] 本发明方法中步骤1中，构建编码重组人血管舒缓素