血管发生的蛋白激酶c肽调节剂的制作方法

专利名称：：血管发生的蛋白激酶c肽调节剂的制作方法
技术领域：
：本公开的发明涉及蛋白激酶c同种型的肽调节剂用于防止或抑制血管发生和/或防止或抑制血管渗透的应用。
背景技术：
：血管发生在损伤或侵害后发生在健康的机体中，用以愈合伤口并且用以恢复流向组织的血流。血管发生还与许多疾病状态，如癌症、糖尿病失明、湿性年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样化、卡波西肉瘤、血管瘤、急性和慢性肾病、动脉再狭窄、自体免疫疾病、急性炎症、淋巴水肿、子宫内膜异位、功能紊乱性子宫出血和大于70种其它病况相关。在这些以及其它疾病状态中，不适当的新血管生成，也叫作不需要的血管发生，可以提供给养患病的组织，破坏正常组织，并且在癌症的情形中，新的血管可以促进肿瘤转移。血管发生过程血管发生的过程典型地起始于血管生成生长因子在损伤位点的产生和释放，其扩散进入邻近的组织。这些生长因子结合并且激活邻近的现存血管的内皮细胞。通过复杂的信号级联系统，激活的内皮细胞开始增殖，并且改变与它们接近的环境。这些增殖的内皮细胞移向血管生成生长因子的来源，建立新血管的基础。所述内皮细胞最终形成作用为分泌所述血管生成生长激素的区域供血的管和血管。关于血管发生调控的治疗在医学上变得越来越重要。通过一次估算，己经有超过40亿美元投入到基于血管发生的医药的研究和开发中，这使得其成为人类历史上最大资助的医学研究领域之一。蛋白激酶C蛋白激酶C(PKC)是参与各种细胞功能的信号传导的关键酶，所述细胞功能包括细胞生长、基因表达和离子通道活性的调控。PKC同工酶家族包括至少11种不同的蛋白激酶，基于它们的同源性和对激活剂的敏感性，它们可以分成至少三个亚族。经典或cPKC亚族的成员，ct，(3((V卩u)和y同工酶，包含四种中间间隔以同工酶-特异性(可变的或V)区域的同源结构域(Cl，C2，C3和C4)，并且激活需要钙、磷脂酰丝氨酸(PS)、和二酰甘油(DG)或佛波酯。新的或nPKC亚族的成员，S，e，r|，和e同工酶，缺少C2同源结构域，并且激活不需要钙。最后，非典型的或aPKC亚族的成员，C，xa同工酶，缺少C2和一半C1同源结构域，并且对DG、佛波酯和钙不敏感。关于PKC同工酶亚细胞分布的研究证明，PKC的激活导致其在细胞中的重新分布(也称为易位)，以致激活的PKC同工酶与血浆膜、细胞骨架元件、核以及其它亚细胞区室相关。似乎不同PKC同工酶的独特的细胞功能是由它们的亚细胞定位决定的。例如，发现活化的^PKC在核内，而活化的PuPKC发现在心肌细胞的核周围和细胞外周。此外，在相同的细胞中，sPKC结合交叉-成纹的结构(可能是收縮元件)，并且在激活后或在加入外源激活的sPKC后细胞-细胞接触固定细胞。不同的PKC同工酶在细胞的不同区域的定位又似乎是由于激活的同工酶与特异性锚定分子的结合，所述特异性锚定分子叫作激活的C-激酶受体(RACKs)。认为RACKs通过将激活的PKC同工酶选择性锚定在它们各自的亚细胞位点而起作用。RACKs只结合激活的PKC，并且不必是所述酶的底物。与RACKs的结合也不是通过所述激酶的催化结构域调节。PKC的易位反映所述激活的酶与锚定在细胞微粒部分的RACKs的结合，并且与RACKs的结合是PKC产生其细胞应答所需要的。抑制PKC与RACKs的结合在体内抑制PKC易位和PKC-介导的功能。已经鉴定了编码RACK1和RACK2的cDNA克隆。二者都是G蛋白(3亚基的同系物，所述G蛋白是另一种易位蛋白激酶，(3-肾上腺素能受体激酶，卩-ARK，的受体。与G蛋白相似，RACK1和RACK2具有7个WD40重复序列。最近的数据表明，RACK1是用于激活的(311PKC的选择锚定蛋白。PKC的易位是PKC同工酶的正确功能所需要的。模拟在RACKs上的PKC-结合位点或在PKC上的RACK-结合位点的肽是同工酶-特异性PKC易位抑制剂，其在体内选择性地抑制所述酶的功能。
发明内容本发明涉及抑制分离的蛋白激酶C(PKC)P或S抑制肽，所述肽具有抑制血管发生和/或抑制血管渗透性的活性。在某些实施方案中，所述肽包括与选自由SEQIDNOs:6，8,10，14，16，17,18，20,21,22,23，24,25,26,27,和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述肽具有选自由SEQIDNOs:6，8,10，14,16，17,18，20,21,22,23，24,25，26,27,和28组成的组的序列。在其它实施方案中，所述肽与载体缀合，所述载体包括，但不限于，聚-Arg，TAT和果蝇(Drosophila)触角同源域。与载体缀合的肽包括具有鉴定为SEQIDNO:7，9,11和15的序列的那些。本发明还包括一种分离的线性肽，其与选自由SEQIDNOs:18，和20-28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性。所述肽可以选自由SEQIDNOs:18，和20-28组成的组。本发明还包括分离的PKC(3IV5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:6，18，23,25,26,27,28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为(3PKC拮抗剂的活性；还包括分离的PKCpnV5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:8，21和24组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列；并且还包括分离的PKCSV5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:16和17组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为5PKC拮抗剂的活性。这样的肽可以化学合成或重组生成。本发明还涉及包含药用赋形剂和本发明的肽的药物制剂。本发明包括使用所公开的肽的方法。在某些实施方案中，所述肽用于抑制血管发生和/或血管渗透性。一种抑制血管发生的方法包括将血管生成内皮细胞用抑制量的分离的蛋白激酶C(PKC)抑制肽处理，由此抑制血管发生。另一种抑制血管渗透性的方法包括将内皮细胞用抑制量的分离的蛋白激酶C(PKC)抑制肽处理，由此抑制血管渗透性。在其它实施方案中，将细胞直接与抑制肽接触。所述PKC抑制肽可以抑制经典PKC同工酶，PI或PIIPKC，或新PKC同工酶，诸如5PKC。在某些方法中，所述PKC抑制肽与载体缀合，并且与选自由CKLFIMN(SEQIDNO:7),CQEVIRN(SEQIDNO:9),和CSLNPEWNET(SEQIDNO:ll)组成的组的肽具有大于50%的序列相同性，或者是选自由CKLFIMN(SEQIDNO:7),CQEVIRN(SEQIDNO:9),和CSLNPEWNET(SEQIDNO:1l)组成的组。在另一些方法中，所述PKC抑制肽与选自由SEQIDNOs:6,8,10,14，16,17，18,20,21:22,23，24,25,26,27,和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性，或者是选自由SEQIDNOs:6,8,10,14,16,17,18,20,21,22,23,24,25，26,27,和28组成的组。所述PKC抑制肽可以是CYSDKNLIDSM(SEQIDNO:17)。另外，所述PKC抑制肽可以与缀合到载体上的CSFNSYELGSL(SEQIDNO:15)具有大于50%的序列相同性，或者可以包含缀合到载体上的SEQIDNO:15。可以使用所述肽治疗的代表性疾病包括癌症、糖尿病失明、黄斑变性、类风湿性关节炎或银屑病。所述肽可以以各种途径施用，所述途径取决于要治疗的疾病。在一个实施方案中，将所述肽施用给受试者的眼组织，特别用于治疗黄斑变性。所述方法可以进一步包括将细胞用抗血管生成的药剂处理，在某些实施方案中，其抑制由下列各项组成的组中的至少一种VEGF,FGF,PDGFB，EGF,LPA,HGF,PD-ECF，IL-8,血管生成素，TNF-a,TGF-卩，TGF-a,增殖素，禾口PLGF。附图简述图1显示在角膜血管发生测定中得分的实例。图2A-D显示表明当在第7和10天测量时，用(3PKC特异性抑制剂处理的兔角膜基本上防止VEGF-诱导的新血管生成的照片。图3A-C显示与合成的对照肽和PKC调节剂比较，^和(3PKC特异性抑制剂和a、(3、yPKC抑制剂在角膜系统中的作用。本附图表示随着时间(A和B)和在第12天(C)的血管发生得分。图4显示与对照肽或PKC调节剂比较，SPKC同工酶特异性抑制剂对血管发生的作用。图5A-C显示两种(3PKC抑制剂在迈尔斯测定中的结果，表明与单独的赋形剂相比，这两种肽减少血管的渗透性。图6A-D显示与对照肽相比较两种(3PKC抑制剂和一种经典PKC抑制剂在迈尔斯测定中的结果。实施发明的最佳模式本公开的发明涉及各种蛋白激酶C同工酶的肽调节剂用于防止或抑制血管发生，和/或防止或抑制不需要的血管渗透性的应用。PKC同工酶的肽调节剂是一种促进或者抑制一种或多种PKC同工酶活性的肽。在一个优选的实施方案中，所述肽调节剂特异性地作用在单一PKC同工酶上。本发明还涉及非特异性的PKC调节肽。本发明特别涉及分离的蛋白激酶C(PKC)(3或5抑制肽，所述肽具有抑制血管发生和/或抑制血管渗透性的活性。在某些实施方案中，所述肽包含与选自由SEQIDNOs:6，8,10,14,16,17,18,20,21,22,23,24，25,26,27和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述肽具有选自由SEQIDNOs:6，8,10,14,16,17,18,20,21,22,23,24，25,26,27和28组成的组的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述肽与载体缀合，所述载体包括，但不限于，聚-Arg，TAT，和果蝇触角同源域。本发明特别涉及具有鉴定为SEQIDNO:7,9,11和15的序列的肽与载体的缀合。本发明还包括一种分离的线性肽，其与选自由SEQIDNOs:18，和20-28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性。所述肽可以选自由SEQIDNOs:18，和20-28组成的组。本发明还包括分离的PKC|31V5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:6，18，23,25,26,27，和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为(3PKC拮抗剂的活性；还包括分离的PKC(3IIV5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:8,21和24组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为PIIPKC拮抗剂的活性；并且还包括分离的PKC5V5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:16和17组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为5PKC拮抗剂的活性。这样的肽可以化学合成或重组生成。本发明还涉及包含药用赋形剂和本发明的肽的药物制剂。此处描述的本发明涉及将一种或多种PKC活性调节肽施用给受试者，以抑制不需要的血管发生活性和/或防止或抑制不需要的血管渗透性。癌症，包括肿瘤、糖尿病-相关的新血管生成、湿性年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样化、卡波西肉瘤、血管瘤、急性和慢性肾病、动脉再狭窄、自体免疫疾病、急性炎症、淋巴水肿、子宫内膜异位和功能紊乱性子宫出血只是特征在于由不需要的血管生成活性和/或不需要的血管渗透性导致的疾病状态的一些实例。本发明包括使用所公开的肽的方法。在某些实施方案中，所述肽用于抑制血管发生和/或血管渗透性。一种抑制血管发生的方法包括将血管生成内皮细胞用抑制量的分离的蛋白激酶C(PKC)抑制肽处理，由此抑制血管发生。另一种抑制血管渗透性的方法包括将内皮细胞用抑制量的分离的蛋白激酶C(PKC)抑制肽处理，由此抑制血管渗透性。在其它实施方案中，将细胞直接与抑制肽接触。所述PKC抑制肽可以抑制经典PKC同工酶，(3I或(3IIPKC，或新PKC同工酶，诸如5PKC。在某些方法中，所述PKC抑制肽与载体缀合，并且与选自由CKLFIMN(SEQIDNO:7),CQEVIRN(SEQIDNO:9)，和CSLNPEWNET(SEQIDNO:ll)组成的组的肽具有大于50%的序列相同性，或者是选自由CKLFIMN(SEQIDNO:7),CQEVIRN(SEQIDNO:9),和CSLNPEWNET(SEQIDNO:ll)组成的组。在另一些方法中，所述PKC抑制肽与选自由SEQIDNOs:6,8，10,14,16，17,18,20,21,22,23,24,25，26,27，和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性，或者是选自由SEQIDNOs:6,8,10,14,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27,和28组成的组。所述PKC抑制肽可以是CYSDKNLIDSM(SEQIDNO:17)。另外，所述PKC抑制肽可以与缀合到载体上的CSFNSYELGSL(SEQIDNCU5)具有大于50%的序列相同性，或者可以包含缀合到载体上的SEQIDNO:15。可以使用所述肽治疗的非限制性和代表性疾病包括肿瘤、糖尿病-相关的新血管生成、湿性年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样化、卡波西肉瘤、血管瘤、急性和慢性肾病、动脉再狭窄、自体免疫疾病、急性炎症、淋巴水肿、子宫内膜异位和功能紊乱性子宫出血。所述肽可以以许多途径施用，所述途径取决于要治疗的疾病，并且在本文中进一步描述。在一个实施方案中，将所述肽施用到受试者的眼组织，特别用于治疗黄斑变性。所述方法可以进一步包括将细胞用抗血管生成的药剂处理，在某些实施方案中，其抑制选自由下列各项组成的组中的至少一种VEGF,FGF,PDGFB，EGF，LPA，HGF,PD-ECF，IL-8，血管生成素，TNF-a,TGF-J3,TGF-a,增殖素，禾QPLGF。在本申请中，除非另外阐述，本申请的术语定义和技术举例说明可以在任何一些公知的参考文献中找到，如.*Sambrook,J.,等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)(1989);Goeddel,D.,编，GeneExpressionTechnology(基因表达技术),MethodsinEnzymology(酶学方法)，185，AcademicPress(学院出版社),SanDiego，加利福尼亚(1991):"GuidetoProteinPurification(蛋白纯化指导)"在Deutshcer,M.P.,编，MethodsinEnzymology(酶学方法)，AcademicPress(学院出版社)，SanDiego,加利福尼亚(1989)中；Innis,等，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(PCR流程方法和应用指导)，AcademicPress(学院出版社),SanDiego,加利福尼亚(1990);Freshney,R丄,CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique(动物细胞培养基础技术手册)，第二版，AlanLiss,公司，纽约，纽约(1987);Murray,E丄，编，GeneTransferandExpressionProtocols(基因转移和表达流程)，第109-128页，TheHumanaPressInc.(人类出版公司)，Clifton,NJ和Lewin,B,，GenesVI,OxfordUniversityPress(牛津大学出版社)，纽约(1997)。通过参考下述本发明的优选实施方案和本文包含的实施例的详细描述，可以更容易地理解本发明。然而，在公开和描述本方法之前，应该理解，本发明不限于具体的核酸、具体的多肽、具体的细胞类型、具体的宿主细胞、具体的条件或具体的方法，等等，原因当然在于这些可以变化，并且其中的许多修改和变化对于本领域的技术人员应该是显而易见的。还应该理解，本文所用的术语只是用于描述具体的实施方案的目的，并不意欲进行限制。还应该理解，除非在本文特别定义，本文所用的术语给出其在相关领域中己知的常规意思。PKC同工酶在血管发生中的作用PKC活性在血管发生中起作用。应答低氧条件的内皮细胞调节PKC同工酶的活性。这些作用已经在参考文献中得到描述，例如在心脏组织中的作用。使用糖尿病性视网膜病作为模型，举例说明PKC同工酶在血管发生中的作用。升高的高血糖水平的病况(糖尿病)导致二酰甘油和高级糖化末端产物(AGEs)的生成。AGEs是由还原糖与蛋白质、脂质和核酸的游离氨基的非酶促反应而形成的异源的分子组。某些AGEs可以结合细胞表面AGE-结合受体，可能导致细胞激活和VEGF，一种血管发生的重要成分的生成。这些病况还在视网膜中导致自由基的形成，和各种PKC同工酶如a、j3、5和s同工酶的激活。增加的PKC活性与ET-1的表达相关，所述ET-1是血管收縮剂。例如，认为抑制PKC活性减少VEGF生成，并且因此减少或抑制血管发生和新血管生成。周细胞的程序性细胞死亡，视网膜血管基底膜的增厚和渗透性过高也在糖尿病性视网膜病中起作用，并且PKC在不健康的新血管生成的发展中起作用。周细胞对于保护内皮细胞抗脂质-过氧化物-诱导的损伤是重要的。PKC活性可以增加TGF-p、ECM蛋白(纤维蛋白原、IV型胶原蛋白)的产生，从而导致基底膜增厚。还已经表明，PPKC的激活增加血管渗透性。此外，在高葡萄糖条件下在RPE细胞中，SPKC己与VEGF分泌联系起来。干扰PKC功能影响糖尿病型视网膜病的证据包括在转基因动物和在大鼠模型中进行的工作。例如，过表达|3PKC的转基因小鼠具有"糖尿病样"症状一应答局部缺血增加的新血管生成。敲除pPKC的小鼠应答局部缺血具有减少的新血管生成。与未治疗的糖尿病大鼠比较，用LY333531(购自EliLilly的|3PKC-选择性抑制剂)治疗的糖尿病大鼠具有改善的视网膜血流。并且已经表明，在糖尿病模型中，PPKC上调并且激活(易位)。注射VEGF的动物可以增加视网膜血管渗透性一用LY333531预治疗表明防止这种结果。此外，使用大鼠的角膜血管发生模型，系统给与LY317615(也是购自EliLilly的卩-PKC选择性抑制剂)能够防止新血管生长。湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)和PKC的作用'已经推定PKC活性在湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)中起作用。在这种疾病状态中，认为对视网膜色素上皮细胞(RPE)的损伤引起促进或诱导血管生成反应的血管生成生长因子、细胞因子和蛋白酶的分泌。具有脉络膜新血管生成(CNV)的膜的临床样品已经表现出升高的血管内皮生长因子(VEGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)的水平，已知所有这些因子都促进血管发生或新血管生成。由细胞如RPEs、血管内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞组成的新血管结构侵入眼内空间。这些结构可以使视网膜不稳定，引起损伤和视觉敏锐性的减小。可能更重要地，新血管结构倾向于较差地形成，并且通常是脆弱的。因此，这些新血管结构倾向于出血进入眼内空间，使得通常透明的玻璃体液变得不透明。PKE同工酶的肽调节剂先前已经描述了PKC同工酶的许多肽调节剂。例如，美国专利号5，783，405描述了许多调节PKC同工酶包括p、e、5、s和y同工酶的活性的肽。正在审理中的美国专利申请号10/843,271描述了5PKC调节肽及其衍生物。美国专利号6,165,977描述了sPKC调节肽及其衍生物。美国专利号6,855,693描述了来自a、(3n、y、5、s、ti、p、9、G)和；同工酶的各种调节肽和修饰的片段。每一专利和专利申请通过引用完全结合于此。上文讨论的肽可以单独使用或者彼此组合使用。例如，作用于P:和卩PKC同工酶的肽抑制剂与另一种对SPKC特异的抑制剂组合的施用是特别考虑的。在本发明的某些实施方案中，所述化合物可以与治疗有效量的抗癌药剂一起施用，其中所述抗癌药剂选自由化学治疗剂、放射治疗剂、抗血管生成剂和程序性细胞死亡诱导剂组成的组。当用于此处时，"治疗有效量"是对血管发生或肿瘤生长具有副作用的量。还当用于此处时，"抗癌药"是指对血管发生、转移或肿瘤生长具有副作用的分子。在一个实施方案中，所述抗癌药是一种抗血管生成药，其抑制选自由下列各项组成的组的血管生成因子的表达或活性VEGFs,FGFs，PDGFB,EGF，LPA,HGF,PD-ECF,IL-8,血管生成素，TNF-a,TGF-P,TGF-a，增殖素，禾BPLGF。在另一个实施方案中，所述抗癌药是选自由下列各项组成的组的抗血管生成药抑制基质金属蛋白酶的表达或活性的药剂；与细胞粘附分子相互作用的药剂；和抑制尿激酶活性的药剂；和通过其它机制抑制血管发生的药剂。在特别的实施方案中，本公开的发明的化合物可以与其它抗血管发生治疗如MACUGEN,LUCENTIS,RETAANE,EVIZON，AVASTIN和ARXXANT联合使用。当用于本文时，"肽"和"多肽"可互换地使用，并且是指由通过肽键连接的氨基酸残基链组成的化合物。除非另外指明，肽的序列以从氨基端到羧基端的顺序给出。在特别的实施方案中，所述肽抑制剂包含通过分子间二硫键连接的两种或多种肽，其中所述肽是相同的或不同的。在其它实施方案中，所述肽抑制剂在长度上是3-25，6-20,或6-15,或6-12个氨基酸。在某些实施方案中，所述肽中的一个或多个氨基酸是d-氨基酸。在一个实施方案中，例如尽管也考虑对RACK与其它PKC结构域如PKCC2结构域的相互作用的抑制,但是所述抑制肽抑制RACK与PKCV5结构域的结合。PIPKCV5结构域具有序列EFVINV(SEQIDNO:1);(3IIPKCV5结构域具有序列KPKACG-(SEQIDNO:2);并且5PKCV5结构域具有序列KFEHLLED(SEQIDNO:3)。在某些实施方案中，所述抑制肽包含SEQIDNOs:l,2或3的3-25,6-20,6-15，或6-12个连续的残基，或者与包含SEQIDNOs:l,2或3的3-25,6-20,6-15，或6-12个连续残基的肽具有大于50%的序列相同性。基本上与可变结构域互补的抑制肽还可以重叠保守结构域。为了确定两种氨基酸序列的同源性百分数，将所述序列进行最佳比较目的的比对(例如，可以将缺口引入到一种肽的序列中，以与另一种肽进行最佳比对)。然后比较在相对应的氨基酸位置的氨基酸残基。当在一种序列中的位置被与在另一种序列中相对应位置相同的氨基酸残基占据时，那么所述分子在该位置是相同的。当用于此处时，氨基酸或核酸"同源性"等价于氨基酸或核酸"相同性"。因此，两种序列之间的序列相同性百分数是所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，序列相同性百分数=相同位置的数目/位置总数X100)。优选地，在本发明中包含的分离的氨基酸变体与在SEQIDNOs:6，8,10,14,16,17,18，20,21,22，23，24,25,26,27和28中任一种中所示的完整的氨基酸序列，或者与包含SEQIDNOs.l,2或3的3-25,6-20,6-15,或6-12个连续残基的肽具有至少约50-60%，优选地至少约60-70°/。，并且更优选地至少约70-75%,75-80%,80-85%,85-90%,或90-95%,并且最优选地至少约96%,97%,98%，99%，或者更多的相同性。在另一个实施方案中，在本发明中包含的分离的氨基酸变体与在SEQIDNOs:7，9,11或15中所示的完整的氨基酸序列具有至少约50-60%，优选地至少约60-70%，并且更优选地至少约70-75%，75-80%,80-85%,85-90%,或90-95%,并且最优选地至少约96%,97%,98%,99%，或者更多的相同性，其中所述肽与载体缀合。为了本发明的目的，使用载体NTI6.0(PC)软件包(InforMax.7600WisconsinAve.,Bethesda，MD20814)确定在两种多肽序列之间的序列相同性百分数。使用缺口开口罚分10和缺口延长罚分0.1而确定两种多肽之间的相同性百分数。所有其它的参数设置为默认的设置。如果它具有与亲本肽或多肽的至少5个氨基酸残基的连续序列相同或相似的氨基酸序列，那么肽或肽片段"衍生于"亲本肽或多肽。当它作用于参与血管发生途径的具体的PKC同工酶时，肽具有"同工酶-特异的活性"，这与不能区分PKC同工酶的非特异性肽或化合物相反。当用于本文时，"保守氨基酸取代"是不引起所选择的多肽或蛋白质的活性或三级结构的显著变化的取代。这样的取代典型地包括将所选择的氨基酸残基用具有相似的物理化学性质的不同的残基替换。通过物理化学性质对氨基酸分组是本领域的技术人员已知的。例如，在本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，并且其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，P-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。本发明的另一个方面涉及分离的PKC多肽及其生物活性部分的应用，并且在一个实施方案中，涉及PKCV5结构域多肽的应用。当通过重组DNA技术产生时，"分离的"或"纯化的"多肽或其生物活性部分没有一些细胞物质，或者当化学合成时，没有化学前体或其它化学品。表述"基本上没有细胞物质"包括这样的PKC结构域多肽的制备物，其中所述多肽与它在其中天然或重组产生的细胞的一些细胞成分分离。在一个实施方案中，表述"基本上没有细胞物质"包括具有小于约30%(干重)的非PKC物质(此处也称为"污染多肽")，更优选地小于约20%的非PKC物质，还更优选地小于约10%的非PKC物质，并且最优选地小于约5%的非PKC物质的PKC结构域多肽的制备物。当所述PKC多肽或其生物活性部分重组产生时，它还优选地基本上没有培养基，即，培养基具有小于约20%，更优选地小于约10%，并且最优选地小于约5%的所述肽制备物的体积。表述"基本上没有化学前体或其它化学品"包括这样的PKC结构域多肽的制备物，其中所述多肽与参与所述多肽合成的的化学前体或其它化学品分离。在一个实施方案中，表述"基本上没有化学前体或其它化学品"包括具有小于约30%(干重)的化学前体或其它化学品，更优选地小于约20%的化学前体或其它化学品，还更优选地小于约10%的化学前体或其它化学品，并且最优选地小于约5%的化学前体或其它化学品的PKC结构域多肽的制备物。在优选的实施方案中，分离的多肽、或其生物活性部分不含来自所述PKC结构域多肽来源的同一生物体的污染多肽。所述PKC多肽可以与载体缀合。用于将所述肽与载体缀合的非限制性方法包括通过二硫键缀合，以及作为单链或线性多肽合成。所述载体可以通过接头与所述PKC多肽缀合。在一个实施方案中，所述接头是1-5个氨基酸肽，或2-4个氨基酸肽，或者2-3个氨基酸肽。所述载体是允许细胞渗透的任何化合物。载体的非限制性实例包括聚-Arg，TAT，和果蝇触角同源域。TAT的序列是YGRKKRRQRRR(SEQIDN0.4)。TAT序列还可以具有与肽CYGRKKRRQRRR(SEQIDNO:5)联合使用的N-端半胱氨酸。在特定的实施方案中，所述载体在长度上包含3-25个残基，4-20个残基，5-15个残基或6-12个残基。载体的选择是本领域的技术人员公知的。制剂制备这些制剂或组合物的方法包括使得本发明的化合物与载体和任选地，一种或多种附加成分缔合的步骤。通常，所述制剂通过均匀地并且紧密地使得本发明的化合物与脂质载体或细分的固体载体或二者相缔合，并且然后，如果需要，将所述产物定形而制备。适合肠胃外施用的本发明的药物组合物包括一种或多种本发明的化合物，其与一种或多种药用无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液、或无菌散剂组合，所述无菌散剂可以恰好在使用前重构成无菌的可注射溶液或分散体，其可以包含糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得所述制剂与目的受体的血液等渗的溶质、或混悬剂或增稠剂。可以用于本发明的药物组合物中的适宜的水性和非水性载体的实例包括水，醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及它们的适当的混合物，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。可以保持恰当的流动性，例如，通过使用涂层物质，如磷脂酰胆碱，在分散体的情形中通过保持需要的颗粒大小，并且通过使用表面活性剂而进行。这些组合物还可以包含佐剂，如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。防止微生物在本发明的化合物上的作用可以通过包含各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等而得到保证。还可以需要地在所述组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶而导致。在一些情形中，为了延长药物的作用，需要减缓从皮下或肌内注射的药物吸收。这可以通过使用具有很小的水溶性的晶态或非晶态的物质的液体混悬液而实现。那么药物的吸收速率取决于它的溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体大小和晶体形式。备选地，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将所述药物溶解或悬浮在油性赋形剂中而实现。可注射的长效制剂形式通过在生物可降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成本发明化合物的微胶囊基质而制备。取决于药物与聚合物的比例，和所用的特别的聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。长效注射制剂还通过将药物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳液中而制备。适于口服施用的本发明的制剂可以是下列形式胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味成分，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、粒剂或作为在水性或非水性液体中的溶液或混悬液、或者作为水包油或油包水液体乳状液、或者作为酏剂或糖浆、或者作为软锭剂(使用惰性成分，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为洗口液等，每一种包含预先确定量的本发明的化合物作为活性组分。本发明的化合物还可以作为大丸剂、舐剂(electuary)或糊剂施用。当本发明的化合物作为药物施用给人和动物时，它们可以自身给药或者作为药物组合物给药，所述药物组合物包含，例如，0.1到99%(更优选地，10到30%)的活性成分与药用载体的组合。这些化合物可以通过任何适当的施用途径施用给人和其它动物用于治疗，所述施用途径包括口服，鼻，例如通过喷雾剂进行，直肠，阴道内，肠胃外，静脉内，皮下，池内(intracistemally)和局部，例如通过散剂、或油膏或滴剂进行，包括口腔和舌下。不管所选择的施用途径，可以以适当的水合形式应用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物，通过本领域的技术人员已知的常规方法配制成药用剂型。活性组分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可以不同，以便获得有效实现对于具体的患者、组合物和施用模式的理想的治疗反应而对患者没有毒性的活性组分的量。选择的剂量水平将取决于各种因素，包括本发明所用的特别的化合物、或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所用的特别的化合物的排泄或代谢速率，吸收的速率和程度，治疗的持续时间，与所用的特别的化合物组合应用的其它药物、化合物和/或物质，治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、综合健康情况和已有的医药史，以及医药领域公知的类似因素。在本领域内具有普通技术的医生或兽医可以容易地确定并且开出所需要的有效量的药物组合物。例如，医生或兽医可以从低于需要的水平的用于所述药物组合物中的本发明的化合物的剂量开始，以获得理想的治疗作用，并且逐渐增加剂量直到获得理想的作用。通常，本发明化合物的适合的日常剂量应该是有效产生治疗作用的最低剂量的所述化合物的量。这样的有效剂量通常取决于上述因素。一般地，当用于指定的止痛作用时，本发明的化合物对于患者的口服、静脉内、脑室内(intracerebroventricular)和皮下的剂量，将在从约0.0001到约100mg/kg体重/天的范围内。如果需要，所述活性化合物的有效每日剂量可以在一整天当中以适当的间隔作为分开施用的两次、三次、四次、五次、六次或更多的分剂量进行施用，任选地，以单位剂型施用。优选的给药是每天施用一次。尽管本发明的化合物可以单独施用，但是优选地将所述化合物作为药物制剂(组合物)进行施用。通常接受这种治疗的受试者是需要其的任何动物，包括灵长类，特别是人，以及其它哺乳动物，如马、牛、猪和羊；以及家禽和宠物。本发明的化合物可以按原样或者与药用载体的混合物进行施用，并且还可以与抗微生物药剂如青霉素、头孢菌素类、氨基糖苷和糖肽联合施用。因此，联合治疗包括以在后续施用时先施用的活性化合物的治疗作用没有完全消失的方式，顺序、同时和分开施用活性化合物。用于所公开的化合物的可能的施用途径这些化合物可以通过任何适当的施用途径施用给人和其它动物，用于治疗。当用于此处时，术语施用"途径"意欲包括，但不限于，皮下注射，静脉内注射，眼内注射，皮肤内注射，肌内注射，腹膜内注射，气管内施用，硬膜外施用，吸入，鼻内施用，口服施用，舌下施用，口腔施用，直肠施用，阴道施用，池内施用和局部施用。当系统施用时，所公开的化合物具有功效。如上文所述，所述化合物可以与治疗有效量的抗癌药一起施用，其中所述抗癌药剂是选自由化学治疗剂、放射治疗剂、抗血管生成剂和程序性细胞死亡诱导剂组成的组。要用于组合方案的具体的治疗(疗法或步骤)组合应该考虑需要的疗法和/或步骤与要获得的需要的治疗效果的相容性。还应该理解，所用的治疗可以对于同一种疾病获得需要的效果(例如，本发明化合物可以与用于治疗同一种疾病的另一种药剂同时施用)，或者它们可以获得不同的效果(例如，任何不利作用的控制)。当用于本文时，已知通常施用来治疗或预防特别的疾病或病况的额外的治疗药剂是"适合所述被治疗的疾病或病况"的。本文定义的本发明的组合治疗可以通过同时、顺序或分开施用所述治疗的单个成分的方式而实现。本发明的化合物或其药用组合物还可以结合到用于涂敷移植的医学装置的组合物中，所述移植的医学装置如假体、人造阀、血管移植物、斯滕特印模和导管。因此，在另一个方面中，本发明包括用于涂敷移植装置的组合物，其包含如上文综合描述的本发明的化合物，和适合涂敷所述移植装置的载体。在另一个方面中，本发明包括用包含如上文综合描述的本发明的化合物和适合涂敷所述移植装置的载体的组合物涂敷的移植装置。例如，血管斯滕特印模已经用于克服再狭窄(损伤后的血管壁再狭窄)。然而，使用斯滕特印模或其它移植装置的患者具有形成血块或血小板激活的危险。这些不需要的作用可以通过将所述装置用包含激酶抑制剂的药用组合物预先涂敷而防止或减轻。适当的涂层和涂敷的移植装置的一般制备在美国专利号6,099,562;5,886,026;和5,304,121中描述，其通过引用完全结合于此。所述涂层典型地是生物相容性聚合物物质，如水凝胶聚合物、聚甲基二硅氧垸、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯乙酸乙烯酯、以及它们的混合物。所述涂层可以任选地进一步由适宜的氟硅氧垸、多糖、聚乙二醇、磷脂或它们的组合的顶部涂层(topcoat)覆盖，以赋予所述组合物控制释放的特征。治疗眼科疾病的施用眼用制剂，和滴眼剂涉及在本发明的范围内。在特别的实施方案中，玻璃体内注射和眼周施用是可接受的施用途径。还涉及单一或重复的剂量或持续不变释放的施用。对于湿性黄斑变性的治疗，本发明的化合物可以与抗血管生成剂组合施用，或者与医药或手术方法如光凝固法、光动力学治疗和黄斑易位手术组合。治疗癌症的施用本发明的治疗方法的抗癌作用包括，但不限于，抗肿瘤作用，反应速率，疾病发展的时间，和存活率。本发明的治疗方法的抗肿瘤作用包括但不限于，抑制肿瘤生长，肿瘤生长延迟，肿瘤衰退，肿瘤縮小，在治疗停止时肿瘤再生长的增加的时间，疾病发展的减缓。预计当本发明的治疗方法施加给需要癌症治疗的受试者时，所述治疗方法将产生作用，如例如，通过下列各项中的一种或多种而测量抗肿瘤作用的程度，反应速率，疾病发展的时间和存活率。抗癌作用包括预防治疗以及已有疾病的治疗。关于组合治疗，例如，化学治疗剂，其它抗增殖药剂，或手术或医药技术可以与本发明的化合物组合，以治疗增殖性疾病和癌症。例如，可以与本发明的创造性抗癌药剂组合使用的其它治疗或抗癌药剂包括手术，放射治疗(但是在一些实例中，Y射线、中子束放射治疗、电子束放射治疗、质子治疗、近距治疗和系统放射性同位素，仅举几例)，内分泌治疗，生物应答调节剂(干扰素、白介素和肿瘤坏死因子(TNF)，仅举几例)，高热和冷冻治疗，减轻任何不利作用的药剂(例如，止吐药)，和其它已核准的化学治疗药，包括，但不限于，垸化药(氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺)，抗代谢药(甲氨蝶吟)，嘌呤拮抗剂和嘧啶拮抗剂(6-巯基嘌呤，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷(Cytarabile)，吉西他滨)，纺锤体毒物(长春碱，长春新碱，长春瑞滨、紫杉醇)，鬼臼毒素(依托泊苷，伊立替康，托泊替康)，抗生素(多柔比星，博来霉素，丝裂霉素)，亚硝基脲(卡莫司汀，洛莫司汀)，无机离子(顺铂，卡铂)，酶(天冬酰胺酶)，和激素(他莫昔芬，亮丙立德，氟他胺和甲地孕酮)，甲磺酸伊马替尼TM.，多柔比星，地塞米松，和环磷酰胺。对于最新癌症治疗的更全面的讨论，参见，例如，TheMerckManual(默克手册)，第十七版.1999,其全部内容通过引用结合于此。对于治疗肿瘤，例如，本发明的化合物可以口服、系统、内窥镜地、气管内、病灶内、经皮地、静脉内、皮下、腹膜内或肿瘤内施用。生物有效的分子可以用共价键或非共价相互作用可操作地与本发明的肽连接。在特别的实施方案中，所述可操作地连接的生物有效分子可以通过赋予肽作为所连接的分子的部分的特点的优点而改变在本发明上述实施方案中的肽的药物代谢动力学。所述生物有效的分子可以赋予肽的一些特点包括，但不限于将肽递送到机体内的分离的地点；将肽的活性集中在机体中需要的位置，并且减少其在其它地点的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽的生物利用度或递送到机体的速率；改变用肽治疗的效果的持续时间；改变肽的稳定性；改变发作的频率和肽作用的延迟；通过允许肽具有作用而提供允许的作用。使用公开的化合物筛选本发明还提供使用所公开的PKC抑制肽的筛选方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用所公开的PKC抑制肽鉴定调节血管发生和/或血管渗透性的化合物。所述方法备选地用于鉴定调节PKC的抑制作用的化合物。所述方法可以包括在测试化合物的存在和不存在下，测量本文公开的PKC抑制肽的活性；并且如果当与存在对照肽时的活性比较，存在测试化合物时肽的活性改变，那么选择所述测试化合物作为有效调节血管发生和/或血管渗透性的化合物。测量步骤可以包括在存在测试化合物时在竞争结合测定中测量所述肽的活性。所选择的步骤可以包括，如果在存在所述测试化合物时肽的结合减少，那么选择所述测试化合物为有效的。所述方法可以在细胞内发生，或者在没有细胞的环境中发生。在某些实施方案中，所述测试化合物是一种有机化合物。本发明还涉及制备调节PKC抑制肽对一种或多种PKC同工酶的抑制作用的化合物的方法，其包括进行如本文所述的方法，以鉴定调节PKC抑制肽对一种或多种PKC同工酶的抑制作用的化合物；并且制备所述化包括公开的化合物的试剂盒本发明还提供施行本发明的治疗方案的试剂盒。这样的试剂盒包括治疗有效量的具有对于PKC卩和/或S的同工酶-特异性抑制活性的肽，其以药用形式，单独的或与其它以药用形式的药剂组合。优选的药物形式包括与无菌盐水、右旋糖溶液、缓冲液或其它药用无菌流体组合的肽。备选地，所述组合物可以是冻干的或干燥的。在这种情形中，所述试剂盒可以进一步包括药用溶液，优选是无菌的，以形成用于注射目的的溶液。在另一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括针头或注射器，优选是以无菌形式包装的，用于注射所述组合物。在其它实施方案中，所述试剂盒进一步包括将所述组合物施用给受试者的使用说明方式。所述使用说明方式可以是书面插入物、录音磁带、视听带或任何其它指导将所述组合物施用给受试者的方式。在一个实施方案中，所述试剂盒包括(i)第一容器，其包含具有对PKC(3具有同工酶-特异的抑制活性的肽；(ii)第二容器，其包含对PKCS具有同工酶-特异的抑制活性的肽；和(iii)关于使用的使用说明方式。在另一个实施方案中，所述试剂盒包括(i)第一容器，其包含具有对PKC(3或5结构域的同工酶-特异的抑制活性的肽；(ii)第二容器，其包含抗血管生成药；和(iii)关于使用的使用说明方式。在一个实施方案中，所述肽具有对于PKC|3或SV5结构域的同工酶-特异的抑制活性。在另一个实施方案中，所述肽具有对于非V5结构域的同工酶特异的抑制活性。在一个实施方案中，所述抗血管生成药剂抑制由下列各项组成的组中的至少一种VEGF，FGF,PDGFB,EGF，LPA,HGF,PD-ECF，IL-8,血管生成素，TNF-a，TGF-P,TGF-a,增殖素，禾BPLGF。在相关方面，本发明提供包括上述试剂盒的内容物的制品。例如，本发明提供这样的制品，其包括有效量的具有对PKC(3和/或5的同工酶-特异的抑制活性的肽，所述肽单独的或与其它药剂组合，和指示治疗本文所述的疾病的应用的使用说明。提供下述实施例进行举例说明，而不是限制本发明。实施例1抑制PKC影响VEGF产生PKC还参与VEGF在血管平滑肌细胞和视网膜内皮细胞中的表达的调节。(分别参见，Soucy等，C7z柳W仏7^dco/.^毒激学游众学,秀；17:555-63禾口Mamputu等，《/Z)/a6efeyQ附;〃ca^ra(^^^^i^7^Jfe^^^^V16:284-93(2002))。在原代大鼠视网膜色素上皮细胞(RPEs)中进行的实验表明，在暴露于PMA24小时后，在RPEs中的PKC-5显著下调。在用PMA处理24小时后，VEGF在正常或高葡萄糖、或缺氧条件下的分泌显著减少，但是使用PKC《特异的抑制剂的情况中没有减少。这些实验表明，在高葡萄糖和缺氧条件下，PKC同工酶被激活，并且是VEGF表达必需的。VEGF的分泌在缺氧时增加，并且似乎受PKC-S调节。RPE细胞可以通过由PKC同工酶调节的VEGF的表达和分泌而在由高葡萄糖和缺氧引起的视网膜病的发病机理中起作用。(Young等，Exp.EyeRes.(眼研究实验)，80:651-62(2005))。为了确定PKC-S肽抑制剂的功效，使用大鼠RPEs进行了相似的实验。对于S-PKC的肽抑制剂按上述使用，并且当将RPEs暴露于高葡萄糖和缺氧条件时表现出对VEGFmRNA生产和VEGF分泌的抑制作用。实施例2两种(3PKC同工酶是血管发生必需的角膜血管发生模型用来证明两种卩PKC同工酶是血管发生必需的。将含有单独的VEGF(对照)或VEGF和PKC同工酶的肽抑制剂(检测)的ELVAX小丸(DUPONT(杜邦))移植到邻近边缘毛细管的兔角膜中。新的血管从边缘向移植位点生长。定期对检测和对照角膜指定血管生成得分。所述得分是新血管长度和密度的产物。'计分角膜血管发生测定血管生成得分=血管密度X血管长度血管密度=新形成的血管数目(得分0-6)血管长度=新血管生成的范围(mm，从所述边缘到所述小丸)，并且通过0-5的得分计算。图1显示所述计分的实例。在本研究中，在每个小丸中使用200ngpPKC抑制剂(^V5-3，(SEQIDNO:6),其包含通过二硫键与TAT(SEQIDNO:5)缀合的CKLFIMN(SEQIDNO:7)，或(3nV5-3，(SEQIDNO:8),其包含通过二硫键与TAT(SEQIDNO:5)缀合的CQEVIRN(SEQIDNO:9))和200ngVEGF165。^PKC特异的抑制剂防止新血管生长当在第7天和第10天测量时，用(3uPKC特异的抑制剂处理的兔角膜基本上防止新血管生成，如在图2A-D中所示。BPKC抑制剂防止新血管生长在角膜系统中检测上述P,和PnPKC特异的抑制剂和a、p、yPKC抑制剂(pC2-4,(SEQIDNO:10)的作用，其包含通过二硫键与TAT(SEQIDNO:5)缀合的CSLNPEWNET(SEQIDNO:11))。测量血管生成的得分。结果显示在图3A-C中，其中A和B显示随着时间的得分，且C显示在第12天的得分。对于A的对照肽是合成的对照1肽，其具有序列CPDYHDAGI(SEQIDNO:12)，而在B中的PKC调节剂是\|/sRACK，CHDAPIGYD(SEQIDNO:13)，二者都与TAT(SEQIDNO:5)缀合。这些实验的结果表明，两种卩PKC同工酶的至少丝毫的活性是新血管生成所必需的。实施例3抑制SPKC减少VEGF-诱导的血管发生上述角膜模型用来检测SPKC同工酶特异性抑制剂对血管发生的作用。在本研究中，将200ngVEGF(VEGF121或VEGF165)在与TAT(SEQIDNO:5)缀合的对照肽，\|/sRACK，CHDAPIGYD(SEQIDNO:12)存在下，或与500ngSPKC抑制剂，KAI-9803((SEQIDNO:14),其包含通过二硫dV5，((SEQIDNO:16),其包含通过二硫键与TAT(SEQIDNO:5)缀合的CYSDKNLIDSM(SEQIDNO:17))—起，插入到兔角膜中。这些实验的数据显示在图4中。对于两种不同的SPKC同工酶特异性肽，在每一时间点观察到强抑制反应。实施例4PKC抑制剂影响血管渗透性迈尔斯测定用来证明PKC调节剂影响VEGF诱导血管渗透性。在本研究中，将动物静脉内注射Evans蓝染料。将动物皮肤内施用与PKC调节剂一起的增加剂量的VEGF。血浆外渗液导致在受试者皮肤上的可见的蓝色斑点。将所述点取下，提取染料，并且通过分光光度计测量定量。亲本化合物，^V5-3(SEQIDNO:6)和肽变体一一肽的线性形式，线性卩!，其具有序列GKLFIMNGGYGRKKRRQRRR(SEQIDNO:18)—一在迈尔斯测定中进行检测。结果在图5A-C中显示，并且表明所述测定允许两种(3PKC抑制肽的直接比较，并且因此是用于确定肽调节剂在减少血浆外渗液中的相对功效的有用的测定。与单独的赋形剂相比，两种肽都减少血管渗透性。使用&PKC(^V5-3(SEQIDNO:6))抑制剂，(3PKC(f3V5-3(SEQIDNO:8))抑制剂，经典的(卩-,a-,丫PKC)PKC抑制剂((3C2-4(SEQIDNO:IO)),和来自实施例2(SEQIDNO:12)的与TAT(SEQIDNO:5)缀合的合成的对照1肽，类似地进行迈尔斯测定。这些测量的结果显示在图6A-D中，并且表明，与单独的赋形剂相比，两种^PKC(卩!V5-3(SEQIDNO:6》和卩nPKC(卩nV5匿3(SEQIDNO:8》抑制剂都减少VEGF-诱导的渗透性。此夕卜，经典PKC抑制剂(pC2-4(SEQIDNO:10))也减少VEGF-诱导的渗透性。相反，合成的对照肽没有减少VEGF-诱导的渗透性。在兔中的施用将放射性标记的TAT肽["C]-YGXaaRKKRRQRRR(SEQIDNO:19)(10^Ci)以5次滴注施加到每只眼睛中(总共50^Ci—4只兔，每只兔2只眼睛，n8只眼睛，每只眼睛总共施加3mg)。每次施加间隔1小时，在最后施加后15分钟将动物处死。采取组织样品，并且测定，以确定局部分布。结果显示如下。局部分布数据玻璃体一365ng/g组织(+/-203)—施加总剂量的0.006%。脉络膜一3,4pg/g组织(+/-3.1)—施加总剂量的0.003%。视网膜一1.6吗/g组织(+/-0.6)—施加总剂量的0.001%。巩膜一28.4吗/g组织(+/-28.1)—施加总剂量的0.134%。这些结果表明非常少的化合物到达后部。实施例6在大鼠中的施用将0.8mg与TAMRA缀合的KAI-9706-TAMRA,CHDAPIGYD(SEQIDNO:13)通过IPV递送到大鼠。注射后10分钟，将动物安乐死并且用甲醛灌注。收集器官用于免疫荧光分析。红色表示来自TAMRA的荧光，蓝色表示核(DAPI染色)。检查眼睛的许多不同部分的荧光，其表现出红色荧光，表明PKC调节肽可以通过IPV注射递送到眼睛。实施例7眼内稳定性通过将注射器直接原位插入到眼睛中并且吸出液体，而将玻璃体流体从刚刚处死的猪的眼睛中取出。然后使用KAI-9803(SEQIDNO:14)将这种流体用于"体外"玻璃体稳定性研究。将固定浓度的肽加入到含有玻璃体流体的3个管中，并且在加入之后的不同时间，加入5%的三氯乙酸，将管离心去除沉淀的物质，并且通过HPLC分析上清。在这三个时间点采集色谱。肽的峰大小不同，这表明肽在眼中的稳定性可以在体外测量和追踪，并且这种方法提供用于确定PKC调节肽的玻璃体稳定性的体外测定。实施例8PCK抑制肽变体研究并且计分许多肽的稳定性、迈尔斯测定活性和角膜血管发生活性。数据显示如下<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>'+1%'0-"未测试权利要求1.一种分离的蛋白激酶C(PKC)β或δ抑制肽，所述肽具有抑制血管发生和/或抑制血管渗透性的活性。2.权利要求1的肽，其中所述肽具有包含SEQIDNOs:l,2或3的6到15个连续残基的氨基酸序列。3.权利要求1的肽，其中所述肽具有选自由SEQIDNOs:6，8,10,14,16,17,18,20，21,22,23，24,25,26,27和28组成的组的序列。4.权利要求l的肽，其中所述肽与载体缀合。5.权利要求4的肽，其中所述肽具有鉴定为SEQIDNO:7，9,11或15的序列。6.权利要求4的肽，其中所述载体选自由聚-Arg、TAT、和果蝇(Drosophila)触角同源域组成的组。7.权利要求1的肽，其中所述肽包含与选自由SEQIDNOs:6，8,10,14,16，17，18,20，21,22，23,24,25,26,27和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列。8.权利要求1的肽，其包括具有与选自由SEQIDNOs:18和20-28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的分离的线性肽。9.权利要求8的肽，其中所述肽是化学合成的。10.权利要求8的肽，其中所述肽是重组产生的。11.权利要求8的肽，其中所述肽选自由SEQIDNOs:18和20-28组成的组。12.—种分离的PKC卩IV5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:6，18，23,25,26,27和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为PIPKC拮抗剂的活性。13.—种分离的PKC卩IIV5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:8，21和24组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为(3IIPKC拮抗剂的活性。14.一种分离的PKCSV5肽，其包含与选自由SEQIDNOs:16和17组成的组的肽具有大于50%的序列相同性的氨基酸序列，并且具有作为SPKC拮抗剂的活性。15.—种药物制剂，其包含药用赋形剂和权利要求1的肽。16.—种药物制剂，其包含药用赋形剂和权利要求8的肽。17.—种药物制剂，其包含药用赋形剂和权利要求12的肽。18.—种药物制剂，其包含药用赋形剂和权利要求13的肽。19.一种药物制剂，其包含药用赋形剂和权利要求14的肽。20.—种抑制血管发生和/或血管渗透性的方法，其包括将血管生成内皮细胞用抑制量的分离的蛋白激酶C(PKC)抑制肽处理，由此抑制血管发生和/或血管渗透性。21.权利要求20的方法，其中所述PKC抑制肽抑制经典PKC同工酶。22.权利要求21的方法，其中所述经典PKC同工酶是(3IPKC。23.权利要求21的方法，其中所述经典PKC同工酶是卩IIPKC。24.权利要求20的方法，其中所述PKC抑制肽与载体缀合，并且与选自由CKLFIMN(SEQIDNO:7),CQEVIRN(SEQIDNO:9)和CSLNPEWNET(SEQIDNO:ll)组成的组的肽具有大于50%的序列相同性。25.权利要求20的方法，其中所述PKC抑制肽与选自由SEQIDNOs:6，8,10，18，21,22，23,24，25,26,27和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性。26.权利要求20的方法，其中所述PKC抑制肽与选自由SEQIDNOs:6,8,10,14，16,17,18,20,21,22,23,24，25，26，27和28组成的组的肽具有大于50%的序列相同性。27.权利要求20的方法，其中所述PKC同工酶是新PKC同工酶。28.权利要求27的方法，其中所述新PKC同工酶是SPKC。29.权利要求20的方法，其中所述PKC抑制肽是CYSDKNLIDSM(SEQIDNO:17)。30.权利要求20的方法，其中所述PKC抑制肽与缀合到载体上的CSFNSYELGSL(SEQIDNO:15)具有大于50%的序列相同性。31.权利要求20的方法，其中所述肽与载体缀合。32.权利要求31的方法，其中所述载体选自聚-Arg、TAT、和果蝇触角同源域。33.权利要求20的方法，其中所述肽施用到受试者的眼组织。34.权利要求33的方法，其中所述受试者患有黄斑变性。35.权利要求20的方法，其中所述受试者患有癌症、糖尿病性失明、黄斑变性、类风湿性关节炎或银屑病。36.权利要求20的方法，其中所述受试者患有类风湿性关节炎。37.权利要求20的方法，其进一步包括将所述细胞用抗血管生成药剂处理。38.权利要求37的方法，其中所述抗血管生成药剂抑制由下列各项组成的组中的至少一种VEGF,FGF，PDGFB，EGF,LPA,HGF，PD-ECF,IL-8,血管生成素，TNF-a,TGF-(3,TGF-a，增殖素，禾口PLGF。全文摘要本发明提供抑制各种蛋白激酶同工酶的肽。所述肽可以针对蛋白激酶C同工酶的任何区域，并且在一个实施方案中，针对V5结构域。所述肽可以以可释放的或不释放的方式缀合到载体上。所述肽可以用于抑制血管发生和/或血管渗透性。例如，所述肽可以用于治疗患有癌症、糖尿病性失明、黄斑变性、类风湿性关节炎或银屑病的受试者。文档编号A61K38/45GK101305092SQ200680042279公开日2008年11月12日申请日期2006年9月19日优先权日2005年9月19日发明者德里克·麦克莱恩,莱昂·E·陈,萨拉·瓦尔特申请人:凯制药公司