用于常温等温快速检测核糖核酸的蛋白酶及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明是核酸等温扩增技术的一项新应用，涉及在生物体外利用多种基因工程酶和化学组分进行模拟，通过它们之间的相互作用，实现在常温等温条件下，快速、一步法地完成核糖核酸(RNA)的扩增与检测过程，从而使病毒类病原体的检测更快速和更简便，因而今后能更有效地应用于MiCT0RNA检测或现场快速检验检疫领域当中。
【背景技术】
[0002]在聚合酶链式反应(PCR)帮助实现脱氧核糖核酸(DNA)的体外扩增之后，RNA的体外扩增也随之引起了科学家们的关注，因此衍生技术反转录PCR(RT-PCR)也就孕育而生。最初的反转录PCR以两步法，即由RNA反转录成cDNA，之后再以cDNA为模板进行常规PCR扩增，从而实现RNA的扩增或检测。然而随着发展的需要，繁琐的两步法已不能很好地满足检验检疫任务的需求，随之出现的一步法RNA扩增，将反应所需组分进行了深度优化，在同一反应管中实现了从RNA模板到产物DNA的扩增检测。尽管如此，PCR高度依赖精密的温度循环仪进行检测的缺点，已将RNA的检测局限于中心实验室中，很大程度上也限制了其在现场快速检测病毒类病原体的能力。
[0003]近些年不断壮大的核酸等温扩增技术中，也不乏有些技术具备现场检测RNA方面的优势与能力，但因检测原理的不同，都各有侧重点与优劣势:1)环介导等温扩增技术(LAMP)利用4对引物特异识别6个靶位点和具有链置换活性的Bst酶，可在60-65度条件下实现核酸，包括DNA和RNA的快速检测(〈60分钟)；2)依赖于核酸序列的扩增(NASBA)法，利用三种酶(AMV逆转录酶、RNaseH和T7RNA聚合酶)和两个特异性引物的介导，在一恒定温度下温育1.5-2小时，即可完成RNA模板快速增长的酶促过程；3)滚环扩增技术(RCA)，利用DNA连接酶和DNA聚合酶，以滚环复制的模式，从一条或多条引物处进行环形模板的链置换合成，从而可实现部分病毒的环状基因组的扩增，但是RCA的反应时间偏长(>4小时)使其在现场检测领域中的优势就不甚明显；4)单引物等温扩增技术(SPIA)，通过一条DNA-RNA杂合的引物、RNaseH和强链置换活性的DNA聚合酶可在55-65度下，于30分钟内实现DNA的体外线性等温扩增；在此基础上添加的逆转录酶可帮助实现RNA模板的等温扩增，名为Ribo-SPIA ；5)依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA)，则利用解旋酶、DNA单链结合蛋白、DNA聚合酶和热稳定的逆转录酶共同作用，在37或65度(温度取决于使用的DNA聚合酶)条件下，以两步法或一步法的形式，可以实现RNA模板的快速扩增(?120分钟)；6)链替代扩增(SDA)技术，是基于酶促反应衍生而得的DNA体外等温扩增技术，利用限制性内切核酸酶和具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下实现核酸的扩增。
[0004]因病毒引发的疾病感染性和传染性都非常强，因此如有一种快速且准确的方法或技术能在现场帮助完成病毒(含DNA或RNA病毒)的检出，将能有效且及时地预防病毒疾病的扩散与传播。鉴于此，核酸等温扩增技术应该是当前最适合的技术种类，然而现有的成熟技术或者因孵育温度，例如60-65度，仍需依赖特定温育设备，或者因孵育时间仍相对长等因素，在离真正实现现场检测仍存在一定的差距。因此，本发明意在提供一种更快速、更准确的适合现场检测RNA的技术。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种能在常温等温条件下，快速、一步法地完成核糖核酸(RNA)的扩增与检测的方法。
[0006]本发明的第一个目的是提供用于常温等温快速检测核糖核酸的蛋白酶。
[0007]用于常温等温快速检测核糖核酸的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包括:(I)逆转录酶；(2)重组酶；(3)单链结合蛋白；(4) DNA聚合酶；(5)辅助蛋白；所述逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.17所示；重组酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.18所示；单链结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.19所示；DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.20所示；辅助蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.21所示。
[0008]本发明所述的常温等温，是指在某一恒定温度下进行孵育，温度为40-42? (优选为40°C )，接近常温，并且是均一恒定的温度。
[0009]逆转录酶，是一种经过采用点突变进行基因改造后的蛋白酶，其特点是:1)具有DNA聚合酶活性，以RNA为模板，催化dNTP聚合生成互补(cDNA) ；2)通过点突变将原本具有的RNaseH活性失活，从而避免将DNA-RNA杂合链中的RNA进行水解；3)该酶序列来源于鼠白血病逆转录酶(M-MLV)，后经点突变改造；4)在反应体系中的用量约8-12单位/ul。
[0010]重组酶，是一种基因工程蛋白酶，其特点是:1)具有结合单链DNA分子的能力，因此能与引物寡核苷酸单链形成起始复合体；2)具有和双链DNA分子结合的能力，因此才能在形成起始复合体的同时也结合DNA双链或DNA-RNA杂合链，从而形成结构特异的三链DNA中间体；3)具有同源重组活性，当单链DNA侵入双链DNA或杂合链，沿链寻找到同源序列区后，可将同源的单链排挤出去，形成所谓的局部气泡区，进而方便后续DNA聚合酶的介入；4)该酶序列可来源于大肠杆菌(E.coli)的RecA，或T4噬菌体重组酶uvsX，后经进一步基因工程改造；5)在反应体系中的用量约100-150ng/ul。
[0011]单链结合蛋白，是一种DNA结合蛋白，其特点是:1)沿形成的局部气泡区，局部结合被替换出来的同源单链，避免其被核酸酶降解；2)不具备酶活性，因此不和ATP结合；3)具有协同效应，因此可多个单链结合蛋白相邻结合于DNA单链上，便于气泡区的DNA合成；4)这种结合具有短时性，因此才能沿着“复制叉”不断结合，又不断重新组配；5)该酶序列可源于E.coli或T4的gp32蛋白；6)在反应体系中的用量约700_1000ng/ul。
[0012]DNA聚合酶，是一种依赖DNA模板进行互补DNA序列合成的基因工程蛋白酶，其特点是:1)具有较高的连续合成能力；2)具有链置换活性，在合成新链的同时，能通过链置换能力配合单链结合蛋白将局部气泡区沿“复制叉”方向持续推进，从而将同源链替换出；3)具有3’-5’外切酶(校正能力)活性，从而保证合成的保真性；4)不耐高温，因此非常适合在常温等温条件下反应，并完成DNA链的合成；5)该酶的序列可源于E.coli的DNA聚合酶I Klenow大片段、Bst聚合酶、Ph1-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌Poll (Bsu) ；6)在反应体系中的用量约60-90ng/ul。
[0013]辅助蛋白，是一种协助或增强重组酶活性的蛋白，其特点是:1)促进并稳定起始复合体与DNA双链间的结合；2)序列可选T4噬菌体的uvsY蛋白；3)在反应体系中的用量约 20_40ng/ul。
[0014]本发明的第二个目的是提供用于常温等温快速检测核糖核酸的试剂。
[0015]用于常温等温快速检测核糖核酸的试剂，其特征在于，所述试剂主要包括Tris、RNase抑制剂、dNTP、ATP、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、乙酸钾、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、二硫苏糖醇、扩增引物和逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶和辅助蛋白。
[0016]所述试剂中，5种蛋白(酶)与其它化学组分按一定比例配制后形成的最适反应环境:5%PEG35000，6%海藻糖，115ng/ul的重组酶，35ng/ul的辅助蛋白，830ng/ul的单链结合蛋白，78ng/ul的Bsu聚合酶，12单位/ul的逆转录酶，0.15单位/ul的RNase抑制剂，
3.5mM的ATP，490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液，12mM的二硫苏糖醇，12mM的磷酸肌酸二钠盐，114ng/ul的磷酸肌酶，75mM的乙酸钾和7%甘露醇；350_450nM的扩增引物；总体积为50ul ο检测试剂经冷冻干燥处理，去除液相，保留固相物质，可制成白色干粉状，便于现场快速检测时进行重悬。冻干处理后的反应试剂是白色干粉状，无任何粘性物质附着于管壁，当用缓冲液重悬后，能完全溶解，无任何明显颗粒状物质存在；冻干后反应体系的检测活力可维持半年。
[0017]本发明的用于常温等温快速检测核糖核酸的试剂利用功能不同的基因工程酶、特定化学组分和引物，可实现RNA常温扩增。具有以下特点:1)其中的基因工程酶或蛋白包括5种，分别是逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶和辅助蛋白；2)化学组分包括RNase抑制剂；提供持续ATP能量的三磷酸腺苷(ATP)、磷酸肌酸二钠盐(PCr)和磷酸肌酶(CK)组合；提供合成单元的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP);维持反应离子与酸碱度环境的乙酸钾(KAc)、二硫苏糖醇(DTT)和聚乙二醇(PEG);以及保持冷冻干燥过程中蛋白活性的海藻糖(Trehalose)和甘露醇(Mannitol) ；3)引物是一对长度约30_35nt的寡核苷酸单链，分别特异性识别目标区域的上下游。
[0018]本发明的第三个目的是提供一种常温等温快速检测核糖核酸的方法。
[0019]一种常温等温快速检测核糖核酸的方法，其特征在于，在检测试剂加入模板后，置于一温控设备中维持孵育温度为40-42°C，孵育20-40分钟，孵育过程中保持均一恒定温度；再通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化检测；所述检测试剂主要包括Tris、RNase抑制剂、dNTP、ATP、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、乙酸钾、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、二硫苏糖醇、扩增引物、逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶和辅助蛋白。
[0020]本发明可实现现场RNA快速检测。用缓冲液重悬冷冻干燥反应试剂体系后，在常温下进行的一系列检测操作。用于重悬的组分包括缓冲液(5-6% PEG)、350-450nM引物、模板、双蒸水与12-15mM醋酸镁(MgAc)。总反应体积为50ul ;孵育温度可选40-42度，最优为40度；孵育时间为20-40分钟；还可以选择添加入一荧光探针或荧光染料，实现常温实时RNA快速检测。
[0021]本发明所述温控设备是为反应提供合适温育环境的仪器，具有温度控制模块、时间设置功能和样品孔。例如金属浴、水浴锅、孵育箱或其它小型便携式温育设备等。
[0022]本发明具有以下技术特点:
[0023]I)常温等温:由5种工程酶和化学组分一起创造出一个最大程度模拟生物体内核酸扩增的环境，而且每种工程酶都各司其职，在其最适的反应温度上工作，因此工作效率最尚O
[0024]2)快速:由于每种酶在最适反应温度上进行工作，因此高效的活性保证了反应的快速。此外，逆转录酶催化基于RNA模板生成了与之互补的cDNA，并与之形成不被降解的DNA-RNA杂合链，随后该杂合链作为后续扩增的模板。这比RT-PCR法先由逆转录酶的RNaseH活性消化生成单链cDNA，并以单链再进行后续扩增要更迅速，更节省时间，因此反应也更快速。
[0025]3) 一步法:从RNA到DNA的所有扩增或反应都在同一反应管中进行，也只通过一次性加样完成，因此操作更简单。
【附图说明】
[0026]图1是三对弓丨物分别以总DNA (gDNA)或大豆RNA为模板扩增时电泳图；图中，泳道I为gDNA扩增产物，大小为343bp，泳道2为RNA扩增产物，大小是25Ibp ;泳道3为gDNA扩增产物，大小为444bp，泳道4为RNA扩增产物，大小是352bp ;泳道5为gDNA扩增产物，大小为449bp，泳道6为RNA扩增产物，大小是1