专利名称：一种在大肠杆菌中生产重组血管抑素的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程生物技术领域。
背景技术：
血管生成对实体瘤的生长和转移是必须的。为了促进血管生成，肿瘤组织生成一系列的血管生成因子(如bFGF)，同时许多肿瘤也会产生抗血管生成蛋白。Vasostatin是钙网蛋白(calreticulin)N端1-180个氨基酸组成的血管生成抑制因子，它能够呈剂量依赖性地抑制内皮细胞的增殖，抑制新生血管生成，在实验动物上能够防止或减小肿瘤的生长。近来的研究发现calreticulin的抗肿瘤活性主要位于其第120-180氨基酸的结构域。本发明中，我们称calreticulin第120-180氨基酸的结构域为血管抑素。
人们试图生产具有生物活性的血管抑素，但重组血管抑素蛋白在大肠杆菌表达时容易形成包涵体。因此，高效、大量、低成本地生产具有生物活性的血管抑素，是其作为抗肿瘤药物的开发和应用的一个重要的瓶颈环节，也是目前血管抑素研究中的一个难点。
二
发明内容
本专利发明建立在中国发明专利申请200410065733.X《一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用》的基础上，和中国发明专利申请200410065733.X配套使用效果最佳。
本发明专利需要解决的问题是建立适用、简便、廉价地在大肠杆菌中生产可溶性的、有生物活性的重组人血管抑素的工艺和方法、并建立相应的重组人血管抑素纯化工艺，为重组人血管抑素作为抑制血管新生和肿瘤转移的治疗药物用于治疗肿瘤和其它血管生成相关疾病建立大规模、廉价生产的方法和工艺。本发明对于重组人血管抑素作为治疗肿瘤和其它血管生成相关疾病药物的开发和研究具有重要的实用意义。
本发明的目的可以通过以下措施来达到将人血管抑素cDNA基因克隆在大肠杆菌表达质粒中，分别构建和GST或His-tag融合表达的人血管抑素表达质粒，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，其表达产物几乎全部为包涵体产物。将具有分子伴侣活性的蛋白质或一组分子伴侣蛋白质(如大肠杆菌Trigger Factor(TF)和分子伴侣GroEL/ES，DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL/ES)分别在不同温度和不同诱导时间下与人血管抑素共表达，结果显示低温和分子伴侣都分别能够促进可溶性人血管抑素的产量，当将人血管抑素表达菌株在低温(35℃～16℃)下生长和表达，同时结合共表达分子伴侣能够更有效防止人内皮抑素包涵体形成(见中国发明专利申请200410065733.X)。在大肠杆菌中融合表达的人血管抑素，可溶性表达产物经亲和层析纯化、肠激酶去除融合蛋白，分离纯化获得人血管抑素，纯化的人血管抑素能够特异性、剂量依赖性地抑制人内皮细胞的增殖，在鸡胚尿囊绒膜(CAM)上，具有抑制新生血管生成的作用。在肿瘤动物模型中具有明显的抑制肿瘤的生物活性。
本发明提供了一种简便、经济的生产具有生物活性的重组人血管抑素纯化工艺和方法。本发明工艺生产的重组人血管抑素可在制备治疗肿瘤和血管生成相关性疾病药物中应用。
同已有的重组人人血管抑素生产工艺相比，本发明的特色和创新之处在于(1)本发明建立了在大肠杆菌中以GST形式融合表达人血管抑素的方法，可溶性表达产物经谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析、肠激酶降解、SephadexG-50凝胶过滤得以分离纯化获得人血管抑素。
(2)本发明建立了在大肠杆菌中以His-tag形式融合表达人血管抑素的方法，可溶性表达产物经Ni2+亲和柱层析、肠激酶降解、Ni2+亲和柱分离纯化获得人血管抑素。
以上所用方法都是分子生物学中最常用的、成熟的分离纯化方法，方法简便、价廉，具有很好的适用性，推广方便，适于生产。。
四
图1.纯化的重组人GST-血管抑素和血管抑素
1a.SDS-PAGE分析结果1GST-VAS；2VAS；3分子量标准；1b.Western blot分析结果1GST-VAS；2VAS。
图2.重组人血管抑素抑制b-FGF刺激的血管内皮细胞增殖实验。
图3.重组人血管抑素抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性实验。
对孵育8天的鸡胚尿囊膜施以不同剂量的VAS及其它蛋白质。48小时后，观察并测定每个尿囊膜上的无血管区域，无血管区域内径大于8mm的确定为阳性。鸡胚尿囊膜血管生成抑制率(％)定义为无血管区域内径大于8m的鸡胚数占每个VAS剂量参试鸡胚总数的比例(3B)。例如3/7所表示的意思是在VAS的剂量为0.5μg/鸡胚的时候，参试的7个鸡胚中有3个鸡胚呈阳性抑制。3A上和下图分别图示的是5μg GST和5μg VAS处理的结果。正方形表示加样部位，只有VAS的处理组观察到了无血管区域的出现。
图4.纯化的重组人His-VAS和VAS。
4a.SDS-PAGE分析结果1His-VAS；2VAS；3分子量标准；4b.Western blot分析结果1His-VAS；2VAS。
图5.重组人VAS抑制b-FGF刺激的血管内皮细胞增殖实验。
图6.重组人VAS抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性实验。
5μg GST和5μg VAS处理的结果。正方形表示加样部位，只有VAS的处理组观察到了无血管区域的出现。
图7.小鼠黑色素瘤动物模型肿瘤抑制实验。
五具体实施例方式实施例1重组人血管抑素基因的合成、克隆、表达、分离纯化和性质鉴定1.人血管抑素基因的合成、克隆及其表达载体的构建参照大肠杆菌偏爱的密码字，化学合成了十条寡核苷酸，寡核苷酸的长度为28-35碱基，相邻的寡核苷酸有5-8碱基相互配对，寡核苷酸的序列以及它们之间的重叠模式参见图。首先将所有的寡核苷酸稀释至100pmol/μl，而后按照以下的步骤依次处理T4多聚核苷酸激酶磷酸化，30℃退火，Klenow大片段补平缺口，T4 DNA连接酶连接所有缺刻(nick)，最后得到编码人calreticulin 120至180位氨基酸的183bp的双链DNA片断。用PCR的方法将该片断进行扩增，所用的正向引物为5’-CGGGATCCTGGACGACGACGACAAGATGACTGACATGCACGGTGAC-3’，反向引物为5’-CCCTCGAGTCATTAGTTGTCTGGACGAATCAG-3’。在正向引物中有一个BamH I的酶切位点(黑体)以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列(下划线部分)，反向引物中有一个Xho I的酶切位点(黑体)。PCR反应的条件为94℃热变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸30秒，共进行25个循环。纯化的PCR产物采用BamH I和Xho I进行双酶切，然后插入pALEX的多克隆位点。pALEX是一个T7启动子控制下的GST融合表达的原核表达载体(Christos，A.，Panagiotidis，Silverstein，S.J.Gene 16445-47，1995)。对重组表达载体pALEX-VAS进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。
2.融合蛋白GST-VAS的表达分别将GST-VAS融合蛋白表达载体pALEX-VAS和对照载体pALEX转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，和分子伴侣一起在低温下共表达，表达条件见中国发明专利申请200410065733.X《一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用》。IPTG终浓度为0.6mM。
3.重组人血管抑素的分离纯化1升表达菌体用40ml磷酸缓冲液悬浮，冰浴超声20分钟(5秒超声，5秒间隔)。超声后的混合物12000rpm，4℃下离心30分钟。在超声上清液中加入终浓度为3％的谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析介质(Amersham Pharmacia Biotech)，4℃保温2小时，每隔20分钟混匀一次，然后收集谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析介质并用10倍体积的冷磷酸缓冲液洗涤3次，再将洗涤后的层析介质悬浮于切割缓冲液中(20mM Tris-HCl，100mMNaCl，5mM EDTA，2μg肠激酶/mg融合蛋白质，pH8.0)，16℃孵育10小时，收集酶切缓冲液，冻干浓缩，再将样品进行Sephadex G50凝胶过滤层析(AmershamPharmacia Biotech)，洗脱缓冲液为20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH7.4。
用MicroBCA试剂盒和SDS-PAGE凝胶灰度扫描的方法确定GST-VAS和人血管抑素的产率，并用western blotting的方法验证二者的分子属性。一抗使用的是羊抗人calreticulin多抗(1∶300稀释)(Santa Cruz)，二抗使用的是过氧化物酶交联的兔抗羊IgG多抗(1∶1000稀释)。
4.血管内皮细胞增殖抑制试验将3-5代的HUVEC接种到明胶包被的24孔板中，每个孔约1×104细胞，细胞培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清，2ng/ml bFGF，90μg/ml肝素，1％抗生素)，温度为37℃，CO2浓度为5％，培养24h后，将不同浓度的GST-VAS，人血管抑素和GST加入相应的孔中，继续培养72小时后，胰酶消化后，重悬细胞并计数。每个实验，每个样品均重复三次。
5.鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验为了确认人血管抑素在活体内的对新血管生成的抑制作用，我们进行了鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验。实验选用的是孵化八天的非免鸡胚。具体做法如下首先用小钻子在鸡胚的气室上凿一小洞，然后用小镊子将气室上方的部分蛋壳去除，进而剥去气囊膜，然后将带有不同剂量人血管抑素的滤膜覆于尿囊膜的血管密集处，用封口膜封闭气室。将鸡胚置于37.5℃和相对湿度为80-90％的培养箱中培养，48小时后，用甲醇和丙酮(1∶1)的溶液固定滤膜覆盖处尿囊膜，15分钟后，用小剪刀剪下固定部位，用PBS洗涤，而后在解剖镜下观察并用数码相机拍照，无血管区域内径大于或者等于8mm的处理确定为阳性。
实施例2重组His-人血管抑素基因的克隆、表达、分离纯化和性质鉴定1.重组His-VAS原核表达载体pET28-VAS的构建以实施例1中构建的pALEX-VAS为模板，用PCR反应扩增VAS编码序列，所用的正向引物为5’CGGGATCCGACGACGACGACAAGATGACTGACATGCACGGTGAC-3’，反向引物为5’-CCCTCGAGTCATTAGTTGTCTGGACGAATCAG-3’。在正向引物中有一个BamH I的酶切位点(黑体)以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列(下划线部分)，反向引物中有一个Xho I的酶切位点(黑体)。PCR反应的条件为94℃热变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸30秒，共进行25个循环。纯化的PCR产物采用BamH I和Xho I进行双酶切，然后插入pET28a的多克隆位点。pET28a是一个T7系列的N端融合有6个组氨酸组成的His-tag的原核表达载体。对重组表达载体pET28-VAS进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。
2.融合蛋白His-VAS的表达分别将His-VAS融合蛋白表达载体pET28-VAS和对照载体pET28a转入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，和分子伴侣一起在低温下共表达，表达条件见中国发明专利申请200410065733.X《一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用》。
3.重组His-VAS蛋白的纯化收集1升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的缓冲液A(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4)重新悬浮，超声裂解细胞，离心取上清，硫酸铵盐析至50％饱和度，离心收集沉淀，用缓冲液B(50mM Na3PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH7.4)溶解沉淀的蛋白，进行缓冲液B预平衡的Ni2+亲和柱层析，上样完毕后用缓冲液B充分洗涤至基线，而后用缓冲液C(50mM Na3PO4，300mM NaCl，50mM咪唑，pH7.4)洗涤杂蛋白，最后用缓冲液D(50mM Na3PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4)洗脱目的蛋白。
4.重组VAS蛋白的纯化对于完整的61个氨基酸的VAS的纯化，将上述目的蛋白洗脱液进行G25凝胶过滤层析去除咪唑并换成Tris缓冲液(20mMTris-HCl，200mM NaCl，pH8.0)，按照肠激酶His-VAS等于1∶250的比例加入本室纯化的His-EK，混匀后16℃孵育10小时，最后再经过Ni2+亲和柱，收集穿过峰。
用MicroBCA试剂盒和SDS-PAGE凝胶灰度扫描的方法确定His-VAS和VAS的产率，并用western blotting的方法验证二者的分子属性。一抗使用的是羊抗人calreticulin多抗(1∶300稀释)，二抗使用的是过氧化物酶交联的兔抗羊IgG多抗(1∶1000稀释)。
5.血管内皮细胞增值抑制试验将3-5代的HUVEC接种到明胶包被的24孔板中，每个孔约1×104细胞，细胞培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清，2ng/ml bFGF，90μg/ml肝素，1％抗生素)，温度为37℃，CO2浓度为5％，培养24小时后，将不同浓度的His-VAS，VAS和PBS加入相应的孔中，继续培养72小时后，胰蛋白酶消化后，将细胞重新悬浮并计数。每个样品处理重复三次。
6.鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验为了确认VAS在活体内的对新血管生成的抑制作用，我们做了鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验。试验选用的是孵化八天的非免鸡胚。具体做法如下首先用小钻子在鸡胚的气室上凿一小洞，然后用小镊子将气室上方的部分蛋壳去除，进而剥去气囊膜，然后将带有不同剂量VAS的滤膜覆于尿囊膜的血管密集处，用封口膜封闭气室。将鸡胚置于37.5℃和相对湿度为80-90％的培养箱中培养，48小时后，用甲醇和丙酮(1∶1)的溶液固定滤膜覆盖处尿囊膜，15分钟后，用小剪刀剪下固定部位，用PBS洗涤，而后在解剖镜下观察并用数码相机拍照，无血管区域内径大于或者等于8mm的处理确定为阳性。
7.小鼠黑色素瘤模型体内抗肿瘤活性测定将培养的黑色素瘤细胞B16F10用胰酶消化、吹匀，加血清中止消化，而后离心，PBS洗涤细胞，调整至浓度为1×107细胞/ml，在6-7周龄C57/BL6雌性小鼠右侧皮下接种5×105细胞，当肿瘤达到100mm3-400mm3(细胞接种后约8天左右)，小鼠随机分成5组(11只/组)。
第一组注射灭菌PBS作为阴性对照；第二至第四组依次给不同剂量的VAS(VAS1的剂量为2mg/kg/天，VAS3为8mg/kg/天)，PBS和VAS给药方式为皮下，每只小鼠100μl；第五组设置环磷酰氨作为阳性对照，CTX的用量和用法为30mg/kg/2天，腹腔注射，每只鼠200μl，共计给药十五次。
使用游标卡尺测量肿瘤，每两天测量一次，分别在肿瘤的垂直方向测量肿瘤的长和宽，肿瘤体积计算采用以下公式长×宽2×0.52，抑瘤率＝(对照肿瘤体积-处理体积)/对照肿瘤体积×100％。
在实施例1中，重组GST-VAS经谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析、肠激酶降解、Sephadex G-50凝胶过滤得以分离纯化，纯化后的重组人血管抑素在SDS-PAGE上的分子量约为7.0kDa，产量为7.2mg/升培养基，纯化后的GST-VAS和人血管抑素也为western blotting所证实。重组GST-VAS和人血管抑素都可以抑制血管内皮细胞的增殖，并且呈剂量依赖关系(见附图)，其ED50＝60nM，高达300nM的人血管抑素对于其它细胞(如NIH3T3等)的细胞增殖没有抑制活性。重组人血管抑素具有明显的抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性和明显的血管抑制作用，在0.5-10μg/鸡胚范围内，重组人血管抑素呈剂量依赖性地抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成。
在实施例2中，重组His-VAS通过硫酸铵沉淀、Ni2+亲和层析、G25凝胶分子筛、His-EK酶切以及第二次Ni2+亲和层析，我们方便地得到了野生型的VAS蛋白。硫酸铵沉淀去除了核酸和部分杂蛋白、Ni2+亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白、经过SephadexG25凝胶分子筛去除咪唑、用His-肠激酶酶切后，不带任何冗余氨基酸的VAS与His标签分离开，最后第二次Ni2+亲和层析去除了His-tag和His-EK，我们从1升发酵液中得到了约21mg纯度高的野生型VAS，用该工艺生产的VAS产量显著高于实施例2中使用的GST-VAS的生产方法。
His-VAS和VAS对bFGF刺激的HUVEC增殖都表现出很好的抑制作用，而且呈明显的剂量依赖性，达到最大抑制效率一半的剂量(ED50)为60nM。300nM的高剂量VAS对NIH3T3细胞的增殖并没有什么影响，显示出该分子对血管内皮细胞作用的特异性。在鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验中，剂量范围在0.5-10μg/鸡胚之间的VAS蛋白对鸡胚尿囊膜新血管的生成抑制呈剂量依赖性。实验中未观察到VAS的任何毒性作用。
肿瘤动物实验结果显示治疗16天后，当VAS剂量为2mg/kg/天时，抑瘤率为50％；当VAS剂量为8mg/kg/天时，抑瘤率为69％；而阳性对照CTX(30mg/kg/2天)的抑瘤率为58％。重组VAS显示出良好的体内抗肿瘤活性。
权利要求
1.一种在大肠杆菌中生产有生物活性的重组血管抑素蛋白质的方法，其特征是将重组血管抑素表达菌株在低温下和分子伴侣共表达。
2.根据权利要求1所述的在大肠杆菌中生产有生物活性的重组血管抑素蛋白质的方法，其特征是将血管抑素基因克隆在GST融合表达载体中，融合表达GST-血管抑素。
3.根据权利要求2所述的生产有生物活性的重组血管抑素蛋白质的方法，其特征是重组GST-血管抑素融合蛋白质可以在35℃-10℃的温度中和一组分子伴侣或者分子伴侣样的蛋白质一起共表达。
4.一种分离纯化可溶性重组血管抑素的方法，其特征是将以可溶性的GST-血管抑素融合蛋白质吸附在谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析上，经肠激酶降解、Sephadex G-50凝胶过滤分离纯化获得人血管抑素。
5.根据权利要求1或2或4所述方法生产的重组人血管抑素在制备治疗肿瘤和血管生成相关疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的在大肠杆菌中生产有生物活性的重组血管抑素蛋白质的方法，其特征是将血管抑素基因克隆在His-tag融合表达载体中，融合表达组氨酸标签的重组血管抑素。
7.根据权力要求6所述方法，其特征是重组His-tag-血管抑素融合蛋白质可以在35℃-10℃的温度中和一组分子伴侣或者分子伴侣样的蛋白质一起共表达。
8.一种分离纯化可溶性重组血管抑素的方法，其特征是将可溶性的His-血管抑素融合蛋白质进行硫酸铵沉淀、Ni2+亲和层析、G25凝胶分子筛、His-EK酶切以及第二次Ni2+亲和层析，分离纯化获得血管抑素。
9.根据权利要求6或8所述方法生产的重组人血管抑素在制备治疗肿瘤和血管生成相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域。本发明提供了一种在大肠杆菌中生产可溶性的、有生物活性的重组人血管抑素的工艺和分离纯化方法。利用本发明表达和纯化的重组人血管抑素能够特异性、剂量依赖性地抑制内皮细胞的增殖，在鸡胚尿囊绒膜动物实验中具有抑制新生血管生成的作用，在肿瘤动物模型体内具有明显的肿瘤抑制活性。本发明适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
文档编号C12N15/70GK1648247SQ20051003812
公开日2005年8月3日 申请日期2005年1月18日 优先权日2005年1月18日
发明者华子春, 孙启明 申请人:南京大学