专利名称：带有人lgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特别涉及带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途。
癌症在全世界已成为仅次于的脑血管疾病的人类第二大杀手，是目前世界上最难征服的疾病之一。目前实体肿瘤临床疗法绝大部分是针对肿瘤细胞进行的，从根本上用抑制剂或阻断剂来阻断或抑制实体肿瘤血管再生及血液供应方面的疗法却很少，用带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白进行抗肿瘤血管再生治疗在国内外尚未见报道。另外重组人的血管内皮细胞生成抑制因子大多是在大肠肝菌中表达，其表达量仅为15-20mg/升菌液，且可溶性差，生物活性低。
本发明的目的在于提供一种在酵母菌中高效表达的、可溶性的、无需复性、修饰及糖基化的、高活性带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子，用于抗肿瘤治疗。
本发明方法步骤如下a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到人胶原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成两种引物分别为CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因片段；b.将所得基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到576bp基因片段；c.然后再合成两种引物GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到人IgG1Fc基因片段；d.将所得的基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的729bp基因片段；e.将克隆得到的两个基因片段用连接酶连接后再克隆入pPICZαA质粒的两种内切酶位点中，构成PLW205基因载体；f.将得到的基因载体PLW205转入X--33酵母菌中，构成基因工程菌株，用平板培养得到抗性菌株，经筛选得到高效表达的基因工程酵母菌株；g.经发酵诱导表达的菌液采用生物分离技术等手段纯化得到带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子蛋白质；h.将纯化得到的带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法，测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。
上述得到的制品具有以下特性a.其基因载体为PLW205质粒，其质粒表达启动子为醇氧化酶AOX1，替换酵母天然的醇氧化酶基因；b.PLW205内构建α-因子带有分泌信号肽序列，目的蛋白分泌于细胞外；c.其基因工程宿主酵母菌为甲醇诱导型；d.其制品为可溶性、无需复性和修饰的具有生物活性的蛋白质。
带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin蛋白，其制品作为单制剂制备成生物制品用于抗肿瘤治疗。
本发明与现有技术相比较具有如下优点(1)采用带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin的基因产物用于治疗人实体肿瘤属于同源性，而不易被人体所排斥，其效果优于用鼠重组Endsotatin蛋白。
(2)带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因是在酵母菌中表达，属甲醇诱导型，表达量高达60-80mg/升菌液，其蛋白产物属分泌型，为可溶性无需复性和修饰的高活性天然状态蛋白质。
(3)带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白专一性抑制增殖的毛细血管内皮细胞，使肿瘤血管不能再生，导致肿瘤组织在没有血管供给血液和营养物质的状态下不断的死亡和萎缩，而对人体其它细胞无抑制作用，实验已证实了这种结论。
(4)与不带人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮生成抑制因子Endostatin相比较可增加Endostatin半衰期，减少Endostatin用量的10倍，使其更具有药理学、药效学、药代动力学等意义，对多种肿瘤具有治疗作用。
图1小鼠S180肉瘤对照组、治疗组治疗效果曲线图。
实施例本发明的制备方法主要是经过基因克隆、酵母菌发酵、纯化过程得到的制品，其步骤如下a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选而得到人胶原蛋白十八--human type XVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成两种引物分别为CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以1微升人胎儿肾脏细胞cDNA为模板，加入上述两种引物各2微升(浓度为每微升0.1微克)，加入5微升2.5MdNTP、5微升10×PCR缓冲液，各1微升Taq或PwoDNA聚合酶，在PCR仪上94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共计30个循环，然后用15％琼脂糖凝胶电泳分离得到重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin基因片段b.将上述所得基因片段克隆入TA Vectobk质粒中，通过xhol，BamHl两种内切酶酶切，经电泳纯化得到576bp基因片段c.然后再合成两种引物GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG各1微升Taq或PwoDNA聚合酶，在PCR仪上94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共计30个循环，而得到人IgG1Fc基因片段；d.将上述所得基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过BamHl，NotI两种内切酶酶切，然后用15％琼脂糖凝胶电泳分离得到729bp基因片段；e.将克隆得到的两个基因片段用T4连接酶连接后形成一条新的基因片段，将该基因片段克隆入pPICZαA质粒两个酶切位点中形成PLW205新的基因载体；f.将基因载体PLW205转入X-33酵母菌中，使用YPD平板培养得到抗性菌株，经筛选得到高效表达的基因工程酵母菌株-LW205；g.经发酵诱导表达的菌液采用生物分离技术等手段纯化而得到带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子蛋白质(蛋白质氨基酸序列及基因片段见附表一带有人IgG1Fc片段分子结构的人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因，氨基酸全序列)。
h.采用牛肾上腺毛细血管内皮细胞(BCE)培养至24孔培养板上，细胞浓度为12500个细胞/孔，每孔加入1纳克bFGF和不同浓度的带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法来测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。
上述所得制品具有以下特性a.其基因载体为PLW205，其基因载体表达启动子为醇氧化酶(AOX1)，替换酵母天然的醇氧化酶基因；b.PLW205基因载体内构建α-因子带有分泌信号肽序列，可使目的蛋白分泌于细胞外；c.其基因工程宿主酵母菌为甲醇诱导型；d.其制品为可溶性的、无需复性和修饰的具有生物活性的蛋白质；将上述制品用于抗肿瘤血管生成治疗，以动物实验为例将小鼠皮下接种肿瘤细胞，使肿瘤长至100mm3左右时，将小鼠随机分组，分别皮下注射高、中、低三种不同剂量的带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白及生理盐水(对照组)，连续注射20天，实验结果表明带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin对多种肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，肿瘤组织明显萎缩，与不带人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin相比较可增加Endostatin半衰期，减少Endostatin用量的10倍使其更具有药理学、药效学、药代动力学等意义，对多种肿瘤具有治疗较明显的效果。结果如下小鼠Lewis肺癌治疗效果 带有人IgG1Fc片段分子结构的人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin基因，氨基酸全序列 ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCT GTT TTA TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT CGT CCATAC TCT AAA GGA AGT TAA AAA TGA CGA CAA AAT AAG CGT CGT AGG AGG CGT AAT CGA CGA GGT Met Arg Pho Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala ProGTC AAC ACT ACA ACA GAA GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCACAG TTG TGA TGT TGT CTT CTA CTT TGC CGT GTT TAA GGC CGA CTT CGA CAG TAG CCA ATG AGT Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp 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权利要求
1.一种带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin的制备方法是经过基因克隆、酵母菌发酵和纯化过程制备而得，其步骤如下a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到人胶原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成两种引物分别为CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因片段；b.将新基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的576bp基因片段；c.然后再合成两种引物GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到的人IgG1Fc基因片段；d.将上述基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的729bp基因片段；e.将克隆得到的两个基因片段用连接酶连接后再克隆入pPICZαA质粒两种内切酶位点中，构成PLW205基因载体；f.将上述基因载体PLW205转入X--33酵母菌中，使用平板培养得到抗性菌株后，经筛选得到高效表达的基因工程酵母菌株-LW205；g.经发酵诱导表达的菌液采用生物分离技术等手段纯化得到的带有IgG1Fc重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白质；h.将纯化得到的带有IgG1Fc重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法，测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。
2.根据权利要求1所述得到的制品具有以下特性a.其基因载体为PLW205质粒，其质粒表达启动子为醇氧化酶AOX1，替换酵母菌天然的醇氧化酶基因；b.PLW205质粒内构建α-因子带有分泌信号肽序列，可使目的蛋白分泌于细胞外；c.其基因工程宿主酵母菌为甲醇诱导型；d.其制品为可溶性、无需复性和修饰的具有生物活性的蛋白质。
3.一种带有人IgG1Fc分子结构片段的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin其制品作为单制剂制备成生物制品用于治疗实体肿瘤。
全文摘要
本发明属于基因工程领域,涉及一种带有人IgG
文档编号C12N15/12GK1354186SQ0012334
公开日2002年6月19日 申请日期2000年11月30日 优先权日2000年11月30日
发明者陈林生, 李忠义, 刘秋江, 孙亦红, 汪军远, 徐璐, 李宁 申请人:辽宁卫星生物制品研究所(有限公司)