一种来源于沙门氏菌噬菌体的内溶素及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于沙门氏菌噬菌体的内溶素及其应 用。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌为革兰氏阴性直杆菌，是一种重要的人畜共患病原菌。国内外研究表明， 由沙门氏菌引起的食源性疾病屡居前位。随着抗生素的大量和长期使用，在食品和环境中， 日趋严重的耐药型沙门氏菌已影响人类感染沙门氏菌疾病的治疗，能否研究出新型的生物 抑菌剂来替代化学抗生素是目前科研人员面临的一个挑战。
[0003] 噬菌体内溶素是一类能够裂解细菌细胞壁的裂解酶。尽管在1957年噬菌体内溶 素裂解细菌的能力就被首次报道，但直到2001年Nelson等才证实纯化的重组内溶素可以 作为抗菌剂有效控制大鼠感染A族链球菌。到目前为止，内溶素已被用来防控和检测食品 中的食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌和梭状芽孢杆菌。与使用小分子抗生素用 于抗菌治疗或预防相比，专一性的内溶素不易导致抗性菌株的快速出现。在细菌耐药性日 益严重的现在，尤其在市场对新型抗菌剂的需求空前提高，内溶素不易产生抗性且裂解专 一性的特点，使其作为新型抗菌剂具有一定的优势。
[0004] 虽然国内利用基因工程技术构建内溶素生产菌株的工作已经有了一定的进展，但 是在研究和生产过程中存在的重要的问题是，制备的内溶素大多数都集中在革兰氏阳性细 菌的防治和检测，对于革兰氏阴性细菌尤其是沙门氏菌的防控研究仍较少。所以，针对沙门 氏菌的耐药性日趋严重及相关内溶素缺乏的问题，本发明开发出能够高效裂解沙门氏菌的 内溶素或内溶素基因。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种来自沙门氏菌噬菌体的具有显著抑菌效果的内溶素。
[0006] 本发明还提供所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] -种来源于沙门氏菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQ ID No :1所示的全部 或部分氨基酸序列。经过序列结构分析，显示该酶为噬菌体中的能够裂解细菌细胞壁的裂 解酶，经试验证实，该氨基酸序列形成的蛋白具有较好的杀菌活性。
[0009] 编码所述的内溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示。
[0010] 含有所述的基因的表达载体、工程菌或细胞系。
[0011] 所述原核细胞表达载体为pET-30a(+)。
[0012] 所述工程菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明的内溶素通过市场上已有的适合表达载体表达、纯 化后，体外对沙门氏菌表现出显著的杀菌效果，可用于沙门氏菌抑菌剂的制备。
【附图说明】
[0014] 图1为内溶素蛋白进行结构域分析预测图；
[0015] 图2为内溶素蛋白在大肠杆囷中_效表达图谱；
[0016] 图3为内溶素蛋白裂解沙门氏菌ATCC14028的吸光值变化图谱；
[0017] 图4为内溶素蛋白裂解沙门氏菌ATCC14028的浊度变化图谱。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。
[0019] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。
[0020] 本发明试验涉及的菌株：两株鼠伤寒沙门氏菌（保藏号分别为ATCC14028和 ATCC13311)，甲型副伤寒沙门氏菌（保藏号为CMCC(B)50001)，肠炎沙门氏菌（保藏号 为CMCC50041)，伤寒沙门氏菌（保藏号为CMCC50071)和乙型伤寒沙门氏菌（保藏号为 CMCC50094)分别购于美国ATCC中心和中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0021] 本发明涉及的沙门氏菌噬菌体，该噬菌体STP4-a保存于中国典型培养物保藏中 心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2014145,保藏日期为2014年4月24 日，分类学命名：沙门氏菌噬菌体STP4_a(SalmonellabacteriophageSTP4_a)。
[0022] 营养肉汤培养基（NutrientBroth,NB)，北京陆桥技术有限责任公司；
[0023]LB液体培养基，北京陆桥技术有限责任公司；
[0024]质粒pET30a和大肠杆菌BL21 (DE3)，Novagen公司；
[0025]NiSepharose? 6FastFlow填料，美国GE公司；
[0026] 异丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)，北京索莱宝科技有限公司。
[0027] 实施例1 :内溶素蛋白功能预测
[0028] 本发明人从污水中分离出一株沙门氏菌的烈性噬菌体STP4_a。经全基因组测序和 分析，鉴定该噬菌体gpl93编码的蛋白在氨基酸序列上与大肠杆菌噬菌体T4溶菌酶有65% 的相似度。使用InterProScan软件对gpl93编码的蛋白LysSTP4进行结构域预测分析。结 构域预测结果如图1所示，LysSTP4的24~150氨基酸区间为高度保守的功能区域，属于 Phage_lysozyme家族（PF00959)。该家族能够裂解原核细胞细胞壁肽聚糖中糖苷键，释放 出子代噬菌体。
[0029] 实施例2:内溶素在大肠杆菌中的高效表达
[0030] 1、重组质粒的构建
[0031] 根据内溶素基因序列（SEQIDNo:2)，设计引物，上游引物：CGGGATCCATGAACATTT ITGACATGCTTCG(SEQIDNo:3)，下游引物：CCGCTCGAGTCATATGmTCATATGCITTCCAA(SEQID N〇:4)，在上下游引物端分别设定限制性内切酶BamHI和XhoI。利用PCR进行内溶素 基因扩增，将25iiLPCR回收产物克隆入pET-30a载体的多克隆位点BamHI和XhoI之 间，得到重组质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取单克隆至LB液体培养基中过夜振 荡培养，提取质粒作为模板进行PCR鉴定，结果表明质粒中具有SEQIDNo:2所示的核苷酸 序列，将该基因表达的蛋白命名为LysSTP4,该基因编码SEQIDN〇:l所示的氨基酸残基序 列。将鉴定正确的重组质粒命名为pET-30a-LysSTP4。
[0032] 2、重组蛋白的制备
[0033]重组质粒命名为pET-30a_LysSTP4转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选得到可表达内 溶素的工程菌BL21 (LysSTP4)，接种单菌落于10mLLB液体培养基（含50yg/mL卡那霉 素）中，37°C，150r/min，过夜振荡培养，次日，按照1:100的比例将菌液加入到新鲜的900mL LB液体培养基（含50iig/mL卡那霉素）中，37°C培养3h，加入IPTG(至终浓度为lmmol/ L)，在37°C条件下进行诱导表达，150r/min振荡培养4h后，3381g、4°C条件下离心15min 获得细胞。每300mL菌液所得的细胞沉淀悬于30mL缓冲液（20mmol/LpH8.0Tris-Cl，含 300mmol/LNaCl)，充分混匀后，用超声波破碎仪进行破碎，离心去除不溶性细胞碎片，上清 液过0. 45iim无菌滤膜，获得粗酶液。米用NiSepharose? 6FastFlow进行纯化，利用3kD 超滤离心管进行脱盐处理获得纯度较高的重组蛋白。结果如图2所示，重组蛋白LysSTP4 得到高效表达。图2中泳道M为蛋白标准分子量，泳道1、2分别为未经IPTG诱导和经诱导 的BL21 (LysSTP4)的细菌总蛋白，泳道3为纯化后的融合蛋白，泳道4为超滤浓缩脱盐后的 融合蛋白。
[0034] 实施例3:以沙门氏菌ATCC14028为靶细菌测试内溶素LysSTP4抑菌效果
[0035] 挑取沙门氏菌ATCC14028单菌落至300mL营养肉汤培养基中，过夜培养，菌液中加 入终浓度为5%的氯仿，15min，细胞离心用纯水清洗两次，然后-80°C保存，测定活性之前， 将细菌沉淀用 50mmol/LpH8. 2 的Tris-HCl，含 0. 1%TritonX-100 复融。将 100iiL重组 蛋白LysSTP4溶液（100iig/mL)加入到900iiL细菌复融液中，37°C培养至裂解效果明显。 将Tris缓冲液和溶菌酶（lOOyg/mL)作为空白组和阳性对照组分别同细菌复融液混合，相 同条件下培养，用酶标仪测定0D450值，吸光值的下降反映细菌被裂解。
[0036] 结果如图3所示，重组蛋白LysSTP4试验组和阳性对照组的吸光值在5min内迅速 降低，并且，LysSTP4溶液将细菌的浊度在10min内降低约0. 43,溶菌酶溶液降低0. 52左 右。通过图4所示，37°C培养15min后，LysSTP4试验组和阳性对照组的菌液明显比空白组 澄清。证明通过克隆表达获得的内溶素LysSTP4具有体外抗菌活性。
[0037]实施例4:以不同血清型沙门氏菌和大肠杆菌为靶细菌测定内溶素LysSTP4抑菌 效果
[0038] 挑取细菌单菌落至300mL营养肉汤培养基中，过夜培养，菌液中加入终浓度为5% 的氯仿，15min，细胞离心用纯水清洗两次，然后-80°C保存，测定活性之前，将细菌沉淀用 50臟〇1/1卩118.2的1'1^8-11(：1，含0.1%1'1'行〇11父-100复融。100111重组蛋白1^851?4溶液 (100 iig/mL)和Tris缓冲液分别加入到900 y L细菌复融液中，37°C培养30min，测定0D450 值。LysSTP4酶活力值=A 450nm(LysSTP4实验组降低值）-A 450nm(Tris缓冲液空白组降 低值）。
[0039] 以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为抑菌阳性标准，检测LysSTP4_a对多株菌株的抑 菌活性，表1所示，LysSTP4能够裂解其余5种不同血清型的沙门氏菌，并对大肠杆菌也有 高效裂解作用。
[0040] 表1内溶素LysSTP4抑菌效果分析
[0041]
【主权项】
1. 一种来源于沙门氏菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQ ID No :1所示的全部或 部分氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述的内溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示。
3. 含有权利要求2所述的基因的表达载体、工程菌或细胞系。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述原核细胞表达载体为pET-30a (+)。
5. 根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
6. -种权利要求1所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于沙门氏菌噬菌体的内溶素及其应用。一种来源于沙门氏菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQIDNo：1所示的全部或部分氨基酸序列。经过序列结构分析，显示该蛋白酶为噬菌体中的能够裂解细菌细胞壁的裂解酶，经试验证实，该氨基酸序列形成的蛋白具有较好的杀菌活性。本发明的内溶素通过市场上已有的适合表达载体表达、纯化后，体外对沙门氏菌表现出显著的杀菌效果，可用于沙门氏菌抑菌剂的制备。CCTCC NO：M 201414520140424
【IPC分类】C12R1-19, C12N9-88, C12N15-70, A01P1-00, A01N47-44, C12N1-21, C12N15-60
【公开号】CN104830825
【申请号】CN201410510641
【发明人】王静雪, 林洪, 李萌, 李梦哲
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2014年9月28日