优化后比色法可用于高效的高产糖醇菌株筛选。
[0014]接下来，通过高效的显色法筛选到一株产D-阿拉伯糖醇菌株TIB-X229，其菌落具有以下特征:圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，较粘稠，呈不透明乳白色，菌落颜色和质地均一，可形成子囊孢子。光学显微镜下观察发现:细胞呈球形或椭球形，体积较小，出现类似于液泡组织，具有典型的酵母菌特征。
[0015]将筛选得到的高产糖醇酵母菌TIB-X229进行进一步地18S rDNA分子生物学鉴定，与NCBI数据库中PicAia anomala KCTC7104 (登录号AY251638)序列相似性达到了99%。菌落外观、细胞形态及其分子生物学特征均表明，菌株TIB-X229的分类应属于异常毕赤酵母Pichia anomala,并保存于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC5482。
[0016]实施例2
构建基于双荧光染料标记的酵母原生质体融合筛选方法:
在酵母原生质体融合中，当两个含有互补遗传标记的酵母菌株融合后，它们的融合子可以在选择性培养基上生长。然而，许多工业酵母菌株，由于缺乏选择性遗传标记，不能实现遗传标记的互补筛选[12]。为了解决这个问题，荧光激活细胞分选(fluorescenceactivated cell sorting, FACS)作为一种有效的方法被应用于融合细胞筛选。在这种方法中，亲本菌株被不同荧光染料标记，然后利用流式细胞仪筛选含有重叠荧光染色的融合子。该技术目前得到一些应用，但尚未形成系统性的方法[13 -15] ο
[0017]在本发明中，首先制备不同亲本酵母原生质体各1.0ml，分别利用0.25 μΜNuclear Green和0.1 μΜ Nuclear Red进行染色，室温放置15min，然后使用高渗缓冲液洗涤两次，然后混合于无菌离心管中，1500rpm/min离心lOmin，弃去上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二次，除酶。向菌体沉淀中加入0.2ml原生质体稳定液，混合后加入1.8ml 40% PEG，轻轻摇匀，30°C水浴保温5-15min，离心去除上清PEG，用原生质体稳定液稀释后迅速通过流式细胞仪，利用488蓝激光器与FLl，641红激光器与FL8进行双阳性分析并分选，结果如图(图2)。将获得双阳性细胞分选后混合涂布于固体再生基本培养基，30°C培养96h后，挑选单菌落进行显色法糖醇初步筛选。
[0018]菌株目标表型是通过递归原生质体融合获得的，而原生质体高效融合是整个过程的关键步骤。为了简化融合子的筛选，营养缺陷型，耐药性等遗传标记在构建融合子库的过程中往往是必要的[24，25，21]。但是营养缺陷型等遗传标记又会影响菌株生理和新陈代谢，造成在生产过程中菌株性能的下降。在本发明中，荧光激活细胞流式分选发展为一个重要的方法，实现了无遗传标记条件下的基因组重排。此外，该方法还可用于其它微生物的基因组改组。特别是在遗传背景不清楚和缺少成熟遗传操作的非传统菌株。
[0019]实施例3
一种新型基因组重排技术在产糖醇菌株异常毕赤酵母改良中的应用:
为了进一步有效提高酵母糖醇生产性能，以传统诱变育种方法获得的菌株(U-7，9与A_l，4)为出发菌，利用构建的新型基因组重排技术，将不同高产糖醇菌株进行组合重排，筛选优良性能菌株，具体流程如图3。首先，菌种在YPD液体培养基活化培养12h至对数生长期后，进行去除细胞壁，选择2.5%的蜗牛酶溶液30°C处理3h后，通过镜检和涂板观察，此时具有较好的原生质体形成率与再生率。接下来，将制备好的原生质体细胞进行了不同荧光染料标记(Nuclear Green与Nuclear Red)，使双亲原生质体分别带上不同的焚光色素，以PEG6000为促融剂条件下，进行原生质体融合。融合完成后，利用流式细胞仪快速筛选，筛选进行到双阳性融合子涂板培养。通过高效的显色法糖醇初筛和高效液相法复筛，获得高糖醇产量菌株，进行下一轮融合筛选，最终获得优良性状的目标菌株。
[0020]本发明中，我们通过构建高效的糖醇显色筛选与荧光标记融合子筛选方法，发展了新型的高效基因组重排技术。以传统诱变育种筛选到的4株菌株为出发菌，通过两轮重组后，共得到6株糖醇产量明显提升的菌株，对其进行了综合评价。结果显示:第一轮原生质体融合后，通过筛选，获得糖醇产量提高的3株重组菌，其中最大产量达到43.7g/l，较野生型菌株提高24.9%，较出发菌株提高10.8% ;通过第二轮重组后，糖醇产量提高到47.lg/1，较野生型提高34.6%，较第一轮重组菌株也有7.8%的提高(图4)。因此，相比较传统诱变育种方法，本发明中的基因组改组技术实现了更为快速高效的菌株进化。
【主权项】
1.一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术及其应用，其特征为构建了基于高通量糖醇比色筛选与荧光标记流式分选技术，实现天然产糖醇酵母的高效基因组重排，获得高效菌种，提高糖醇生产能力和效率。
2.如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于可以用于产糖醇酵母的优化选育，并且也可以应用于其它产多元醇微生物的优化选育。
3.如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于首先通过传统的紫外照射和低温等离子体诱变方法，处理野生型产糖醇酵母，构建突变体库。
4.如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于分别利用高碘酸盐-糖醇比色法和高效液相色谱法对产糖醇酵母突变体库进行高通量初筛和复筛，筛选构建高产糖醇亲本库。
5.如权利要求4所述的高碘酸盐-糖醇比色筛选方法，其特征在于高碘酸盐与多羟基醇室温条件下反应10-20min生成甲醛，甲醛与Nash试剂在50_55°C条件下发生显色反应，利用酶标仪测定其多羟基醇含量，整个过程均在微孔板内进行，操作简便快速。
6.如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于以亲本库酵母为出发菌株，制备原生质体，利用不同核荧光染料分别进行染色标记处理，将标记后的原生质体进行诱导融合，通过流式细胞仪实现融合子高效筛选，利用糖醇比色法对融合子进行筛选。
7.如权利要求6所述的产糖醇酵母菌株荧光标记流式融合分选技术，其特征在于荧光标记流式分选技术中所用为微量活细胞核染料，并且可以应用于其它天然无遗传筛选标记酵母的原生质体融合与筛选。
8.如权利要求1所述，应用构建的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，通过多轮递归重组，获得一株高产糖醇重组菌株Z7ZcAia anomala TIBG2-3，糖醇产量提高32%以上，其特征在于所用含糖底物为葡萄糖，木糖，混合糖或玉米芯水解液。
9.其中生物转化条件为:反应温度为18-45°C，最适温度为25-40 °C ;反应时间为12-200小时，最适时间为18-120小时。
【专利摘要】一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术主要包括基于显色法的产糖醇菌株高通量筛选和基于双荧光染色的融合细胞高效流式分选。该技术可以实现产糖醇酵母的高效基因组重排与筛选，具有简便，低成本，高效，实用等特点。应用该技术成功实现了对天然产糖醇异常毕赤酵母高效快速地改造，糖醇产量提高34%以上。CGMCC No.1026020141229
【IPC分类】C12R1-84, C12N1-19, C12N15-04, C12N13-00, C12N1-16, C12N15-01
【公开号】CN104830829
【申请号】CN201510070962
【发明人】王钦宏, 张国强, 贺鹏
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年2月11日