一种用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗，本发明还提供了该疫苗 的制备方法，属于疫苗制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种世界范围内广泛分布的人兽共患病。其宿主 范围非常广，能够感染人及大多数动物。弓形虫感染对畜牧业生产危害严重，主要造成流 产、畸胎、死产等。弓形虫的危害巨大，但对该病的防治至今尚未找到理想的药物。尽管抗 寄生虫药物非常有效、廉价并且易于用药，但弓形虫耐药性的产生以及人们普遍关注的药 物残留问题日益严重。相比而言，疫苗比较安全，无化学残留且无污染。有学者通过对弓形 虫抗原及免疫效应的深入研宄后认为有效的疫苗对该病的防治具有显著的意义。弓形虫疫 苗的研宄经历了灭活疫苗、减毒活疫苗等多种探索，前者刺激机体产生的抗感染能力弱，后 者虽能较好地产生保护作用，但由于经突变后恢复毒力，故不适用。卡介苗（BCG)是全世界 应用最广的预防结核病的疫苗，也是表达外源基因的活菌疫苗载体，它本身是一种免疫佐 剂和非特异免疫增强剂，能提高机体的免疫力。重组卡介苗（rBCG)集佐剂和载体于一身， 兼外源基因与活疫苗于一体，接种后可诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。多种病 毒、细菌、寄生虫抗原以及细胞因子等蛋白，均可以在rBCG中表达。因此，采用基因工程方 法研发一种高效、廉价的新型动物弓形虫病重组卡介苗是当务之急。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗，为穿梭表达载体用于动物 弓形虫病预防的重组卡介苗和整合表达载体用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗。
[0004] 本发明还公开了用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法，适用于工业化 生产。
[0005]本发明用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗的解决方案如下： 将获得动物的细胞因子基因和刚地弓形虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正 确后将二者连接为组合体，然后再将二者组合体连接体与大肠杆菌_分枝杆菌穿梭表达载 体PMV261和整合表达载体pMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和PCR筛选得到用于 动物弓形虫病预防的重组卡介苗。
[0006]本发明所提供的用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗制备方法 本发明以刚地弓形虫保护性抗原Rhomboid(Rho)基因和犬白介素2 (IL-2)基因为例， 进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建，分别制成疫苗。
[0007] 、穿梭表达载体用于犬弓形虫病预防的重组卡介苗疫苗的制备： 根据Genbank公布犬白介素2 (DIL-2)基因序列的开放阅读框、刚地弓形虫Rhomboid基因序列的开放阅读框以及PMV261穿梭表达载体酶切位点设计引物分别对犬白介素2 (DIL-2)基因和刚地弓形虫Rhomboid基因PCR，TA克隆。测序鉴定正确后进行双酶切，切 胶回收，与进行同样酶切的PMV261穿梭表达载体进行连接为pMV26l-DIL2-Rho，转入DH5a中，将重组质粒pMV261-DIL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，37°C培养至对数生长期后，筛选 BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45°C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电 泳分析及Westernblotting鉴定，命名为rBCGpMV261_DIL2_Rho。
[0008] 疫苗免疫效果检测：将制备好的穿梭表达载体用于犬弓形虫病预防的重组卡介苗 rBCGpMV261-DIL2-Rho以106CFU/只的剂量通过皮下注射免疫途径免疫宠物犬，并同时设 BCG组和空白对照组，三免二周后腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子进行攻虫试验， 通过存活时间、存活率、体液免疫水平和细胞因子水平检测等指标进行综合评价。
[0009] 穿梭表达载体用于犬弓形虫病重组卡介苗疫苗rBCGpMV261-DIL2-Rh0可对抗 一定剂量刚地弓形虫对犬的攻击，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高，且差异极 显著（P〈0.01) ;IL-2、IFN-y、TNF-a等细胞因子浓度均明显升高，且与对照组相比差异 极显著（P〈〇. 01);经腹腔接种弓形虫1〇5个/只，犬存活时间与对照组相比均差异显著 (P〈0. 05)〇
[0010] 、整合表达载体用犬弓形虫病预防的重组卡介苗疫苗的制备： 根据犬白介素2 (DIL-2)基因序列的开放阅读框、刚地弓形虫Rhomboid基因序列的开 放阅读框以及PMV361穿梭表达载体酶切位点设计引物分别对犬白介素2 (DIL-2)基因和 刚地弓形虫Rhomboid基因PCR，TA克隆。测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同 样酶切的PMV361穿梭表达载体进行连接为pMV361-DIL2-Rho,转入DH5 a中，将重组质粒 pMV261-DIL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，37°C培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证 实为阳性克隆后进行45°C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定，命名为rBCGpMV361-DIL2-Rho。
[0011] 疫苗免疫效果检测：将制备好的整合表达载体用于犬弓形虫病预防的重组卡介苗 rBCGpMV361-DIL2-Rho以106CFU/只的剂量通过皮下注射免疫途径免疫宠物犬，并同时设BCG组和空白对照组，三免二周后腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子进行攻虫试验， 通过存活时间、存活率、体液免疫水平和细胞因子水平检测等指标进行综合评价。
[0012] 整合表达载体用于犬弓形虫病预防重组卡介苗疫苗rBCGPmv361-DIL2-Rho可对 抗一定剂量刚地弓形虫对犬的攻击，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高，且差异 极显著（P〈〇. 01) ;IL_2、IFN-y、TNF-a等细胞因子浓度均明显升高，且与对照组相比差 异极显著（P〈〇. 01)。经腹腔接种弓形虫1〇5个/只，犬存活时间与对照组相比均差异显著 (P〈0. 05)〇
[0013]Rhomboid蛋白作为一类膜内丝氨酸蛋白酶，是参与EGF和EGFR信号转导过程的 调节器。Rhomboid蛋白最先在果幡体内发现，近年来在许多原核和真核生物体内也发现 了该蛋白，在寄生虫领域，恶性疟原虫、柔嫩艾美尔球虫、微小隐孢子虫、弓形虫中均发现了 Rhomboid蛋白。最近的研宄已经确立了Rhomboid蛋白在顶器门原虫侵入宿主细胞过程中 水解微线蛋白致使虫体进入靶细胞的重要地位。研宄发现弓形虫入侵宿主细胞的完整过程 需要粘附蛋白配体与宿主细胞受体之间的解聚作用，Rhomboid蛋白是一种新发现的丝氨酸 蛋白酶，在弓形虫体内有分解黏附素的作用。因此本发明选择使用Rhomboid基因作为保护 性抗原基因进行重组卡介苗的构建。IL-2又称T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor， TCGF)主要是有⑶4+和⑶8 +T淋巴细产生的一种糖蛋白。有研宄表明IL-2基因可以诱导 感染弓形虫的鼠IFN-Y分泌增加，使小鼠的存活时间显著延长。另有研宄表明IL-2基因 可以有明显的增强Rhomboid蛋白的保护作用。因此本发明选择使用Rhomboid基因作为保 护性抗原基因进行重组卡介苗的构建，并将白介素2 (DIL-2)插入到载体中以增加疫苗效 果。
[0014] 这样的活载体疫苗既能发挥卡介苗本身较强的细胞免疫佐剂作用，又能使表达的 蛋白发挥免疫保护作用，达到更好的预防弓形虫病的目的。因此这两种疫苗的研制具有非 常广阔的前景和应用价值。
[0015] 将本发明提供的两种用于犬弓形虫病预防的重组卡介苗通过皮下注射途径免疫 犬，以腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子进行攻虫试验，通过存活时间、存活率、体液 免疫水平和细胞因子水平检测等指标进行综合评价。结果显示，用于犬弓形虫病预防的重 组卡介苗rBCGpMV261-DIL2-Rho和rBCGpMV361-DIL2-Rho组均具有明显的免疫促进作用， 各指标均强于阴性对照组，具有较好的抗刚地弓形虫效果。
[0016] 本发明的积极效果在于： 利用重组卡介苗（rBCG)集佐剂和载体于一身，兼外源基因与活疫苗于一体，接种后可 诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫，而且又能表达细胞因子和弓形虫抗原蛋白，表 达的细胞因子能使表达的蛋白发更好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防弓 形虫病的目的。
[0017] 本发明疫苗热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化，可直接 用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农 村。
【附图说明】
[0018] 图1为pMV261-IL2-Rho载体构建示意图； 图2为pMV(361)-IL2-Rho载体构建示意图； 图3为pMV261 (361)-IL2-Rho在卡介苗表达SDS-PAGE结果； 图4为pMV2(