替考拉宁在制备抗中东呼吸综合征冠状病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗病毒药物的新应用，更具体地，涉及一种替考拉宁类化合物在制备 抗中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV)以及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV)药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 中东呼吸综合征，是2012年发现的一种由新型冠状病毒引起的急性呼吸道疾病， 2013年5月23日，世界卫生组织将这种新型冠状病毒感染命名为"中东呼吸综合征"。该 病毒首现于沙特，继而在中东其他国家及欧洲等地区蔓延，2015年初在韩国报告了首例确 诊病例，并引起进一步传播。5月29日，根据我国国家卫生和计划生育委员会通报，广东省 惠州市出现首例输入性中东呼吸综合征确诊病例。
[0003] 中东呼吸综合征冠状病毒是从动物传染给人的人兽共患病毒，然后该病毒的起源 尚不完全清楚。就目前的报告病例统计发现，该病毒的感染病死率约为36%。然而，目前世 界上仍缺乏有效的抗中东呼吸综合征冠状病毒的疫苗和药物。目前针对中东呼吸综合征冠 状病毒，市场没有现成的抗病毒药物可以使用。
[0004] 替考拉宁，又名太古霉素，1975年被首次发现。它是特定的游动放线菌，经发酵、提 取后得到的一种万古霉素族糖肽类抗生素，为多个化学结构非常相似的化合物组成的抗生 素混合物。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种药物替考拉宁新的应用，一种替考拉宁类化合物在制备抗中东呼 吸综合征冠状病毒（MERS-CoV)以及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV)药物中的应 用，所述的替考拉宁类化合物的结构式如式I所示：
其中1?为1?1、1?2、1?3、1?4和1?5中的任一种，所述1?1~1?5结构式如下：
所述替考拉宁由上述R1~R5所构成的结构式I的化合物混合而成。
[0006] 所述的替考拉宁类化合物抑制中东呼吸综合征冠状病毒的包膜蛋白MERS-CoV-S 中的应用。
[0007] 所述的考拉宁类化合物抑制中东呼吸综合征冠状病毒进入宿主细胞中的应用。
[0008] 更具体地，提供一种替考拉宁类化合物在制备抑制中东呼吸综合征冠状病毒包膜 蛋白MERS-CoV-S药物中的应用，所述的替考拉宁类化合物的结构式如式I所示：
其中1?为1?1、1?2、1?3、1?4和1?5中的任一种，所述1?1~1?5结构式如下： II、初示Si :
本发明利用pHIV-luciferase、pCMV-AR8. 2和MERS-CoV-S质粒转染至293T细胞，包 装出可以表达中东呼吸综合征冠状病毒包膜蛋白的假病毒，再用这些假病毒来感染相应的 靶细胞，从而模拟中东呼吸综合征冠状病毒感染宿主细胞的一种状态。
[0009] 本发明的优点在于： 本发明运用此种假病毒包装的细胞模型，通过筛选千个以上已经上市使用的化合物 库，从而发现了抗菌素替考拉宁可以有效的抑制中东呼吸综合征冠状病毒感染293T细胞 的现象，经多个试验证实，该抗菌素替考拉宁具有良好的抗病毒作用，IC50约为940nM。另 外，本发明发现，替考拉宁也能够抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV)，其通过抑 制SARS病毒进入宿主细胞发挥作用，IC50约为1. 18剛。
[0010] 此药物对人体的安全性已经通过临床实践的检验，我们目前确定了替考拉宁抗中 东呼吸综合征冠状病毒的明显药效，避免了新药研发的漫长周期，这为我们进一步的研发 抗中东呼吸综合征冠状病毒提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的开发价值和 推广意义。根据本发明的研宄发现替考拉宁类化合物对中东呼吸综合征冠状病毒的包膜蛋 白有抑制作用。
[0011] 本发明所使用的化合物替考拉宁均采购自上海蓝木化工有限公司（其是美国 SelleckChemicals在上海设立的子公司）。
【附图说明】
[0012] 图1是不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV )包膜蛋白S的抑制效果。
[0013] 图2是不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对水疱性口炎病毒包膜VSV-G的抑制效 果。
[0014] 图3是不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)包膜蛋白S的抑制效果。
[0015] 图4是不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对A型流感病毒的抑制效果。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除特别说明外，本发明采用 的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0017] 实施例1 不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV)包膜蛋白S的抑制效果 (1)包病毒：将 4. 5ygpHIV-luciferase、4. 5ygpCMV-AR8. 2 和 10ygMERS-CoV-S质粒转染至293T细胞（10cmdish)，48小时后，收集病毒上清，测p24。
[0018] (2)针对1^1?-(：〇￥-3的化合物筛选：将口24-11〇1'11^1126(1]\^1?-(：〇￥-3假病毒上清 (含8μg/mlPolybrene)感染96孔板中的293T细胞，同时加入不同浓度的替考拉宁化合 物。
[0019] (3)换液：感染12小时后，更换新鲜的DMEM培养基。
[0020] (4)检测luciferase活性：感染48小时后，每孔用PBS洗一次，然后加入100y1 裂解液，震荡30min，取10y1裂解液检测luciferase活性。
[0021] 根据实施例1的结果图1说明，抗菌素替考拉宁可以特异性的作用于中东呼吸综 合征冠状病毒（MERS-CoV)包膜蛋白S，抑制MERS-CoV病毒的进入，并由此计算出替考拉宁 抑制MERS-CoV-S的IC50 约为 940nM。
[0022] 实施例2不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对水疱性口炎病毒包膜VSV-G的抑 制效果 (1)包病毒：将 4.5ygpHIV-luciferase、4.5ygpCMV-AR8.2 和 10ygVSV-G质 粒转染至293T细胞（10cmdish)，48小时后，收集病毒上清，测p24。
[0023] (2)针对VSV-G的化合物筛选：将p24-normalizedVSV-G假病毒上清(含8yg/ mlPolybrene)感染96孔板中的293T细胞，同时加入不同浓度的替考拉宁化合物。
[0024] (3)换液：感染12小时后，换新鲜的DMEM培养基。
[0025] (4)检测luciferase活性：感染48小时后，每孔用PBS洗一次，然后加入100ul 裂解液，震荡30min，取10ul裂解液检测luciferase活性。
[0026] 根据实施例2的结果图2说明，抗菌素替考拉宁对VSV-G的包膜蛋白没有任何抑 制作用。
[0027] 实施例3不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)包膜蛋白S的抑制效果 (1)包病毒：将 6.5ygpHIV-luciferase、8ygpCMV-AR8.2 和 20ygSARS-CoV-S质粒转染至293T细胞（10cmdish)，48小时后，收集病毒上清，测p24。
[0028] (2)针对SARS-CoV-S的化合物筛选：将p24-normalizedSARS-CoV-S假病毒上清 (含8μg/mlPolybrene)感染96孔板中的293T细胞，同时加入不同浓度的替考拉宁化合 物。
[0029] (3)换液：感染12小时后，更换新鲜的DMEM培养基。
[0030] (4)检测luciferase活性：感染48小时后，每孔用PBS洗一次，然后加入100y1 裂解液，震荡30min，取10y1裂解液检测luciferase活性。
[0031] 根据实施例3的结果图3说明，抗菌素替考拉宁可以特异性的作用于严重急性呼 吸综合征冠状病毒（SARS-CoV)包膜蛋白S，抑制SARS-CoV病毒的进入，并由此计算出替考 拉宁抑制SARS-CoV-S的IC50约为1. 18剛。
[0032] 实施例4 不同浓度的化合物抗菌素替考拉宁对A型流感病毒的抑制效果 (1)加药与感染：将5X104A549细胞铺于24孔板中，于37°C培养12小时后，加入不 同浓度的化合物，并且每孔以M0I=0. 1的A型流感病毒进行感染，感染4小时后换液，24小 时后收取上清液。
[0033] (2)测定空斑形成单位（Plaque-formingunit,PFU):准备细胞融合度彡95%的 MDCK细胞12孔培养板，弃去细胞培养液，用PBS洗2遍，将收取的上清液10倍梯度稀释至 需要的稀释度，每个细胞孔接种500沿上清稀释液，置于37°C孵育1小时。将2XMEM培养 基置于37°C下预热，同时配置2%低熔点琼脂糖凝胶，完全溶解后置于50°C水浴锅中防止凝 固。1小时后弃去病毒上清液，用PBS清洗2次，2%低熔点琼脂糖凝胶和2XMEM培养基1:1 混合并加入终浓度为2l^g/ml的TPCK胰酶、0. 2%牛血清白蛋白（BSA)及100U/ml的青-链 霉素，混匀。每孔加入1ml琼脂糖-MEM培养基，待其完全凝固后，倒扣放置于37°C的C02 培养箱，48小时后对空斑进行观察计数。
[0034] 根据实施例4的结果图4说明，抗菌素替考拉宁对A型流感病毒没有任何抑制作 用。
【主权项】
1. 替考拉宁类化合物在制备抗中东呼吸综合征冠状病毒药物中的应用； 其中，所述的替考拉宁类化合物的结构式如式I所示：所述替考拉宁由上述Rl~R5所构成的结构式I的化合物混合而成。2. 根据权利要求1所述的替考拉宁类化合物在制备抗中东呼吸综合征冠状病毒药物 中的应用，其特征在于，所述的替考拉宁类化合物抑制中东呼吸综合征冠状病毒的包膜蛋 白S中的应用。3. 根据权利要求1所述的替考拉宁类化合物在制备抗中东呼吸综合征冠状病毒药物 中的应用，其特征在于，所述的替考拉宁类化合物抑制中东呼吸综合征冠状病毒病毒进入 宿主细胞中的应用。4. 根据权利要求1所述的替考拉宁类化合物在制备抗严重急性呼吸综合征冠状病毒 药物中的应用。5. 根据权利要求4所述的替考拉宁类化合物在制备抗严重急性呼吸综合征冠状病毒 药物中的应用，其特征在于，所述的替考拉宁类化合物抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒 进入宿主细胞中的应用。6. -种抑制中东呼吸综合征冠状病毒的包膜蛋白S的药物，其特征在于，包括一种替 考拉宁类化合物，所述的替考拉宁类化合物的结构式如式I所示：
【专利摘要】一种替考拉宁类化合物在制备抗中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）药物中的应用，本发明发现替考拉宁类化合物在体外能够有效治疗中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）。
【IPC分类】A61K38/14, A61P31/14
【公开号】CN104958755
【申请号】CN201510343520
【发明人】潘婷, 周南, 张辉
【申请人】中山大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月19日