专利名称：：一种弓形虫感染早期检测的方法
技术领域：
：本发明涉及一种专性细胞内寄生的机会致病性原虫的检测方法，具体地说是涉及弓形虫感染早期检测的方法。
背景技术：
：弓形虫(7b^^7as/z忍是一种专性细胞内寄生的机会致病性原虫，它在人和动物的有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病。弓形虫病呈世界性分布，人类弓形虫的平均感染率达33%。健康成人感染后一般都不会出现明显的临床症状，但却会在体内持续很多年。当机体免疫力降低或严重感染时，这种隐性感染则可表现出显著的弓形虫病症状，如弓形虫眼病、弓形虫肝炎、弓形虫淋巴结炎等。免疫功能低下或严重缺损的机体(如AIDS、先天性丙种球蛋白缺乏症、多发性骨髓瘤及其它恶性肿瘤患者)，弓形虫感染常常呈致死性病变。弓形虫位列孕妇宫内感染致胚胎畸形的五大病原体(TORCH)之首，感染的孕妇除自身患病外，平均约40%可通过胎盘将弓形虫传染给胎儿，造成流产、死胎、畸形或婴儿先天性弓形虫病。胎儿受损程度与胎龄呈负相关，感染发生的越早，胎儿受损程度会越严重，目前还尚未有弓形虫病早期诊断的有效方法。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种弓形虫的早期诊断方法。为达到上述目的，本发明公开了一种弓形虫感染早期检测的方法，所述弓形虫感染早期检测的方法由以下步骤组成1)用碳酸缓冲液稀释纯化后的NTPase-II制成5pg/ml的包被液，10(^1/孔包被96孔酶标板，4'C包被过夜；2)PBST洗板3-5次，2—3min/次，拍干;3)加5%的脱脂奶粉，37"封闭2h;4)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；5)加入稀释度为h100的被检血清，10(^1/孔，37'C孵育1.5h;6)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；7)加入稀释度为l:4000的羊抗鼠酶标二抗IgM，10(^1/孔，37。C孵育lh，PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；8)加入底物显色液A液和B液，37'C避光显色10—15min，加终止液，50pl/孔；9)酶标仪读数，450nm处空气调零后测0D值，以阴性血清的0D45。^平均值和3倍标准差之和作为阴性血清的上限，当血清的0D45。nra^X+3S者即判断为阳性血清，反之则为阴性。本发明的弓形虫感染早期检测的方法还可以由以下步骤组成1)用碳酸缓冲液稀释纯化后的NTPase-II帝lj成5吗/ml的包被液，100pl/孔包被96孔酶标板，4'C包被过夜；2)PBST洗板3次，2—3min/次,拍干；3)加5%的脱脂奶粉，37'C封闭2h;4)PBST洗板5次，2—3min/次，拍干;5)加入稀释度为1:200的被检血清，lOO^il/孔，37。C孵育1.5h;6)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；7)加入稀释度为1:4000的羊抗鼠酶标二抗IgG,10(Hil/孔，37。C孵育lh，PBST洗板7次，2—3min/次，拍干;8)加入底物显色液A液和B液，37。C避光显色10—15min,加终止液，50^1/孔；9)酶标仪读数，450nm处空气调零后测0D值，以阴性血清的004^平均值和3倍标准差之和作为阴性血清的上限，当血清'的0D45。^又+3S者即判断为阳性血清，反之则为阴性。由于NTPase-II(三磷酸核苷水解酶-IInucleosidetriphosphatehydrolase)是弓形虫可以在宿主体内寄生的关键性酶，也是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，因此利用弓形虫融合蛋白NTPase-ll对弓形虫病的早期诊断具有较高的准确性。下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。具体实施方式下面为NTPase-II(nucleosidetriphosphatehydrolase,即弓形虫融合蛋白三磷酸核苷水解酶-II)在弓形虫病早期诊断中的应用具体实施例。实施例1本检测方法中弓形虫的融合蛋白NTPase-II的制备方法包括以下步骤(1)弓形虫基因组DNA的制备；(2)弓形虫NTPase-II基因的扩增；(3)弓形虫NTPase-II基因插入克隆质粒；(4)弓形虫NTPase-II基因插入表达质粒；(5)将(4)所得的重组子转入宿主细胞；(6)诱导表达融合蛋白NTPase-II;(7)分离纯化(5)的产物得到NTPase-II表达蛋白。具体制备过程如下(一)弓形虫基因组DNA的制备弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液，800rpm离心8min后加速至2000rpm离心10min，收集中层虫体，按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA,用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。(二)弓形虫NTPase-II基因的扩增根据弓形虫NTPase-II参考核苷酸序列和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，采用PrimerDesigner引物设计软件自行设计引物，由上海基康生物技术公司合成，引物序列如下上游引物5'—GAAGATCTACAGACTCATCGTCACTCCG—3，(下划线为BglII酶切位点)，下游引物5'—GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC—3'(下划线为HindIII酶切位点)。采用2xPCRMasterMix试剂盒扩增NTPase-II基因，PCR反应总体积为50^1:其中含有模板DNA5pl(200ng),上下游引物各(终浓度为0.4pmol/L)。同时设立空白对照。PCR反应参数:95。C5minxl;95。C45s，58。C45s，72。C60sx30;72°C10minxl。1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。(三)T-A克隆及测序回收的PCR产物与pGEM-TEasy载体16。C过夜连接。连接体系为lOpl:纯化的PCR产物3^1，2xbuffer5|al，pGEM-TEasy载体l^d，T4DNA连接酶lpl。连接产物转化感受态五co//DH5a，吸取200|al转化后的感受态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，筛选阳性克隆。阳性重组子经培养和提取质粒后，分别进行BglII和HindIII双酶切及PCR鉴定，并送上海基康生物技术公司测序。测序结果采用DNAMAN软件与Genbank公布的弓形虫NTPase-II基因序列进行比较。(四)重组表达质粒的构建将重组克隆质粒及pBAD-HisB用BglII和HindIII双酶切，酶切体系为40^1:重组克隆质粒(pGEM-TEasy-NTPase-II)或pBAD-HisB20(il、10xbuffer4pl、BglII2jJ、HindlII2j^1、nuclease-freewater12pl;按胶回收试剂盒说明回收目的片段；16X:连接过夜，连接体系为10(xl:pBAD-HisB1^1、回收后目的片段3pl、T4DNA连接酶ljil、2xbuffer5(xl。(五)重组表达质粒转入宿主细胞。将构建好的重组表达质粒加入大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min;迅速放入42'C水浴中热击90s;再迅速冰浴5min;加无抗生素的LB，混匀后37。C200rpm振荡培养45—60min;取一定量在含氨苄青霉素的固体LB培养基上涂布，室温下干燥，然后倒置放于37"C培养箱中培养过夜。(六)诱导表达。从平板上挑取白色菌落，在3mlLB液体培养基(含50Kig/mlAmp)中于37°C，200rpm过夜振荡培养。取50nl过夜培养的菌液加入5mlLB-Amp液体培养基，37°C，200rpm振荡培养3h;取lml菌液作为诱导前对照，12000rpm离心30秒收集菌体，4t保存。剩余菌液加20%的卜阿拉伯糖至终浓度为0.2%诱导表达，37°C，200rpm振荡培养4h。12，000rpm离心30秒收集菌体，-2(TC保存。收集的菌体中加30u1蒸馏水和等体积的2X蛋白上样缓冲液，混匀后IO(TC煮沸3min，12，OOOrpm离心10min，取上清适量做SDS-PAGE电泳分析。(七)重组蛋白的纯化纯化加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0Buffer(20mmol/LTris-HClpH7.9，0.5mol/LNaCl，纖Glycerol，6mol/LGuanidiumHQ)和PMSF。重悬后超声破碎。超声破碎菌离心后取上清，置于-20。C保存。层析将5mlNTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0Buffer平衡；将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况；层析用5倍NTA体积的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/h左右；分别用5倍NTA体积的GuNTA-20，GuNTA-40,GuNTA-60，GuNTA-100,GuNTA-500洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液；确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。用SDS-PAGE分析蛋白质的分布，取各段收集的洗涤液和洗脱液各20pl，以5pl的5X蛋白上样缓冲液混匀，沸水煮5min后，5000rpm，离心5min，10%SDS-PAGE鉴定。纯化重组蛋白蛋白的透析复性透析袋的处理在300ml500ml透析袋处理液(2%NaHCO"l.Ommol/LEDTA，pH8.0)中将透析袋煮沸10min后以蒸馏水彻底漂洗，然后置于1.0mmol/L的EDTA(pH8.0)中煮沸10min，以灭菌纯水里外彻底冲洗透析袋数次；将纯化所得的洗脱液以透析液A稀释，装入截留分子量为14kDa的透析袋中，以磁力搅拌器搅拌，4'C依次在盐酸胍终浓度逐步降低的1L透析液B中进行透析，每10h进行透析液换液一次；取出透析袋置于透析液C中，4'C，15h,以磁力搅拌器搅拌；取出透析袋置于透析液D中，4°C，10h，以磁力搅拌器搅拌。透析液的配制透析液A:20,1/LTris-HCl，pH8.0;透析液B:在透析液A中加入不同量的盐酸胍，配制成盐酸胍终浓度分别为6mol/L、4mol/L、2mol/L和lmol/L的透析液B;透析液C:20,1/LTris-HCl，0.6咖ol/LL-精氨酸，10%蔗糖，2画1/LEDTA，0.5mol/L盐酸胍，pH8.0;透析液D:20mmol/LTris-HCl，25mmol/LNaCl，0.2mol/L盐酸胍，pH8.0。上述制备方法中，各种试验参数均按常规操作选择，可视具体的实验条件而定，所用的克隆宿主细胞可以为大肠杆菌DH5a、JM109等，表达宿主细胞可以为大肠杆菌BL21、DE3等。诱导表达融合蛋白NTPase-II可采用多种方法，例如使用IPTG、L-阿拉伯糖。本发明中分离纯化融合蛋白NTPase-II亦可采用多种方法，例如使用亲和层析、离子交换层析等等。弓形虫感染早期检测(一)弓形虫感染BALB/c小鼠。弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加生理盐水悬浮虫体，用细胞计数板在镜下计数，制成浓度为2000个/ml的速殖子悬液。使用一次性注射器吸取悬液，0.5ml/只弓形虫速殖子感染BALB/c小鼠。对10只BALB/c小鼠分别编号，感染前尾静脉取血，感染后从第二天开始尾静脉取血，直至小鼠发病死亡，感染后小鼠存活8天，死后小鼠剪开腹部，用生理盐水洗涤，镜下观察速殖子感染情况。将所有标本的血清析出，置于-2(TC保存。(二)间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。用碳酸缓冲液稀释纯化后的NTPase-II(nucleosidetriphosphatehydrolase,即三磷酸核苷水解酶-II)制成5pg/ml的包被液，100pl/孔包被96孔酶标板，4'C包被过夜；PBST洗板3-5次，通常3次即可，2—3min/次，拍干；力n5%的脱脂奶粉，37°C封闭2h;PBST洗板5-7次，通常5次即可，2—3min/次，拍千；加入稀释度为1:100的上述被检小鼠血清血清，100^1/孔，37。C孵育1.5h;PBST洗板5-7次，以7次为佳，2-3min/次，拍干；加入稀释度为1:4000的羊抗鼠酶标二抗IgM,100|^1/孔，37。C孵育lh，PBST洗板5-7次，以7次为佳，2—3min/次，拍干；加入底物显色液A液和B液，37t:避光显色10—15min，加终止液2mol/L的浓H2S04终止反应，5(^1/孔；使用酶标仪检测反应液的吸光度值，于波长450nm处空气调零后测0D值。以阴性血清的0045。>平均值和3倍标准差之和作为阴性血清的上限，当血清的0D45。M>^+3S者即判断为阳性血清，反之则为阴性。本发明的IgM抗体ELISA结果如下表所示，可见小鼠血清中的IgM抗体滴度于感染后第三天即能出现阳性反应。IgM抗体ELISA结果如下表天数(天)12345678阳性血清0.2180.2970.4950.6120.6740.8540.9150.976阴性对照0.1740.1430.1570.1320.1860.1480.1520.183实施例2用碳酸缓冲液稀释纯化后的NTPase-II制成5|ig/ml的包被液，100pl/孔包被96孔酶标板，4。C包被过夜；PBST洗板3-5次，通常3次即可，2—3min/次，拍干；加5%的脱脂奶粉，37。C封闭2h;PBST洗板3-5次，通常5次即可，2—3min/次，拍干；加入稀释度为1:200的上述被检小鼠血清，100(!l/孔，37。C孵育1.5h;PBST洗板5-7次，以7次为佳，2—3min/次，拍干；加入稀释度为1:4000的羊抗鼠酶标二抗IgG，lOO^il/孔，37。C孵育lh，PBST洗板5-7次，以7次为佳，2—3min/次，拍干；加入底物显色液A液和B液，37"C避光显色10—15min，加终止液2mol/L的浓}^04终止反应，50^1/孔；使用酶标仪检测反应液的吸光度值，于波长450nm处空气调零后测0D值。以阴性血清的0D4^平均值和3倍标准差之和作为阴性血清的上限，当血清的0D45Qnm》x+3S者即判断为阳性血清，反之则为阴性。本发明的IgG抗体ELISA结果如下表所示，可见小鼠血清中的IgG抗体滴度于感染后第七天开始出现阳性反应。IgG抗体ELISA结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上具体实施例中被检血清与羊抗鼠酶标二抗的稀释度随着不同厂家的羊抗鼠酶标二抗不同,须作相应调整。检测特异性检验使用纯化后的NTPase-II作为包被抗原，间接ELISA分别检测本实验室所收集的疟原虫感染、脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病血清中的IgG抗体，并分别计算出阳性率。反应条件及操作步骤如前所述，检测结果如下表所示，可见本发明的检测特异性较高。间接ELISA检测特异性检测结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种弓形虫感染早期检测的方法，其特征在于由以下步骤组成1)用碳酸缓冲液稀释纯化后的NTPase-II制成5μg/ml的包被液，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃包被过夜；2)PBST洗板3-5次，2-3min/次，拍干；3)加5％的脱脂奶粉，37℃封闭2h；4)PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；5)加入稀释度为1∶100的被检血清，100μl/孔，37℃孵育1.5h；6)PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；7)加入稀释度为1∶4000的羊抗鼠酶标二抗IgM，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板5-7次，2-3min/次，拍干；8)加入底物显色液A液和B液，37℃避光显色10-15min，加终止液，50μl/孔；9)酶标仪读数，450nm处空气调零后测OD值，以阴性血清的OD450nm平均值和3倍标准差之和作为阴性血清的上限，当血清的OD450nm≥X+3S者即判断为阳性血清，反之则为阴性。2、一种弓形虫感染早期检测的方法，其特征在于由以下步骤组成1)用碳酸缓冲液稀释纯化后的NTPase-II制成5pg/ml的包被液，100pl/L包被96孔酶标板，4'C包被过夜；2)PBST洗板3-5次，2—3min/次，拍干；3)加5%的脱脂奶粉，37"C封闭2h;4)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；5)加入稀释度为1:200的被检血清，100nl/孔，37。C孵育1.5h;6)PBST洗板5-7次，2—3min/次，拍干；7)加入稀释度为l:4000的羊抗鼠酶标二抗IgG，10(^1/孔，37。C孵育lh，PBST洗板7次，2—3min/次，拍干；8)加入底物显色液A液和B液，37°。避光显色10—15min，加终止液，5C)^il/孔；9)酶标仪读数，450nm处空气调零后测OD值，以阴性血清的0D4^平均值和3倍标准差之和作为阴性血清的上限，当血清的0D45。n^X+3S者即判断为阳性血清，反之则为阴性。全文摘要本发明涉及一种弓形虫感染早期检测的方法。弓形虫三磷酸核苷水解酶-II(NTPase-II)是弓形虫利用宿主细胞补救合成嘌呤途径中不可或缺的关键性酶，对弓形虫的寄生和繁殖都具有重要的作用，也是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原。本发明是利用聚合酶链反应将弓形虫三磷酸核苷水解酶-II基因扩增，插入表达载体中构建重组表达质粒，将重组表达质粒转入原核细胞进行表达，得到重组融合蛋白NTPase-II，利用重组蛋白NTPase-II作为包被抗原建立间接ELISA法，作为对弓形虫感染的早期检测方法。文档编号G01N33/53GK101315381SQ20081006283公开日2008年12月3日申请日期2008年6月30日优先权日2008年6月30日发明者李丽宁,丹沙,潘长旺,峰谭申请人:温州医学院