一种弓形虫自杀性dna疫苗及构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学和分子生物学技术领域，尤其是一种弓形虫自杀性DNA疫苗及 构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 弓形虫（Toxoplasmagondii)广泛寄生于人和多种动物的有核细胞内，是一种呈 世界性分布的人兽共患寄生虫病病原，全球约有1/3的人受感染，严重危害人类和动物的 健康。弓形虫感染导致孕妇流产、畸胎或死产等严重后果；对于免疫抑制或免疫缺陷的病人 (如器官移植、艾滋病患者及恶性肿瘤患者），弓形虫病是常见的致死病因之一。另外，弓形 虫感染可引起家畜消瘦或流产，给畜牧业造成较为严重的经济损失。同时，被弓形虫感染的 家畜及其产品也成为人类感染弓形虫主要的传染源。然而，由于弓形虫生活史复杂，目前还 没有彻底的药物来预防和治疗弓形虫的感染，临床上常以磺胺嘧啶和乙胺嘧啶等药物联合 用药来治疗弓形虫病，但疗程长、毒副作用大，不能杀灭包囊。因此，免疫预防被认为是弓形 虫防治的重要措施。
[0003]弓形虫疫苗的研究经历全虫疫苗、特异组分疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。尤其 是DNA疫苗以其诸多的优势成为当前研究的热点，如：真核表达抗原蛋白以天然构象存在， 能刺激机体产生全身性的免疫反应；易与其他抗原联合使用增强免疫效果；能产生持久免 疫，减少免疫次数；无需体外表达蛋白和纯化，简化疫苗制备的工序；易于大规模生产，保 存和运输，具有良好的开发前景。然而，普通的 DNA疫苗有可能与宿主的基因组发生整合的 风险，在转基因食品如此敏感的今天，DNA疫苗将在相当长一段时间内无法应用于畜禽的大 面积接种与防治，更很难应用于人群防疫。
[0004] "自杀性"DNA疫苗（SuicidalDNAvaccine)是近几年提出的一种新的疫苗设计， 是在常规DNA疫苗和"自我复制型"RNA疫苗（self-r印licatingRNAvaccine)基础上发 展起来的，不仅具有"自我复制型"RNA疫苗的安全性与有效性，而且结合了常规DNA疫苗易 制备、运输、保存等方面的优点，堪称近年来核酸疫苗的重大突破。用外源的抗原基因取代 甲病毒的结构基因，疫苗进入细胞后表达出甲病毒的非结构蛋白（nsPl~4)，在nsPs的作 用下使得甲病毒基因组进行高效复制，从而使插入的外源抗原基因也得到大量的表达。在 此过程中产生的大量的双链RNA(dsRNA)中间体，最终可诱导转染的细胞凋亡，被称为"自 杀性"DNA疫苗。"自杀性"DNA疫苗高水平的表达，可以低剂量就刺激机体产生高水平的体 液免疫和细胞免疫应答；同时，它的"自杀性"又消除了整合到宿主基因组的风险，避免了长 期持续表达所引起的机体免疫耐受。
[0005]弓形虫核苷三磷酸脱氢酶（nucleosidetriphosphatehydrolase，NTPase)是分 布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，利用宿主细胞补救合成嘌呤途径中不可或 缺的关键性酶，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染 阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原。弓形虫NTPase蛋白有NTPase-I和NTPase-II两 种亚型。其中NTPase-I仅存在于有毒株，而NTPase-II几乎存在于所有弓形虫虫株。本 申请人曾利用重组NTPase-II蛋白免疫BALB/c小鼠后，小鼠体内产生分泌高水平IL-2与IFN-γ的Thl细胞免疫应答，该免疫应答对于弓形虫急性感染、慢性感染均有很好的保护 力。因此，NTPase-II可作为一种弓形虫疫苗候选抗原。
[0006] 通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
[0007] 1、一种用于弓形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用（CN104152466A)，提 供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：1)序列表中 SEQIDNo. 1中所示的核苷酸序列；2)与1)中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3)对上 述1)或2)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感 染预防功能的核苷酸序列。本发明还提供一种疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及医学 上可接受的载体。本发明的质粒DNA疫苗pVAX-R0P7可有效地预防和控制弓形虫动物模 型（昆明鼠）的感染，即可有效的延长小鼠的存活时间，减少脑包囊的荷虫量。因此，质粒 PVAX-R0P7能作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫的感染。
[0008] 2、一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其应用（CN103330947A)，提供一种用于弓形 虫感染预防的疫苗，包括选自以下的核苷酸序列：1)SEQIDNo. 1中所示的第736-第2385位 核苷酸序列；和/或SEQIDNo. 3中所示的第759-第2411位核苷酸序列；2)与1)中所示 的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3)对上述1)或2)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基 的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。本发明的疫苗可有效地预防和控制弓形虫动物模型 (昆明鼠）的感染，重组质粒的联合使用可更有效地提升单基因疫苗的免疫效果。因此，质 粒PVAX-R0P5和pVAX-GRA15可作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫感染，而基于此双基因的重 组质粒的联合免疫可以作为鸡尾酒复合疫苗用于抗弓形虫的感染。
[0009] 3、一种用于弓形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用（CN103937818A)，先提供 一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：1)序列表中SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列；2)与1)中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3)对上 述1)或2)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感 染预防功能的核苷酸序列。本发明还提供一种疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及医学 上可接受的载体。本发明的质粒DNA疫苗pVAX-R0P38可有效地预防和控制弓形虫动物模 型（昆明鼠）的感染，即可有效的延长小鼠的存活时间，减少脑包囊的荷虫量。因此，质粒 PVAX-R0P38能作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫的感染。
[0010] 通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种更加安全、高效、低剂量即 可诱导强烈的免疫反应的弓形虫自杀性DNA疫苗，其构建方法方法简单，所构建的疫苗性 状稳定，易于大规模生产、保存和运输，其可以作为预防弓形虫感染的候选疫苗。
[0012] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
[0013] -种弓形虫自杀性DNA疫苗，所述疫苗由弓形虫NTPase-ΙI抗原基因和甲病毒复 制子载体DREP组成，所述NTPase-II是弓形虫的核苷三磷酸水解酶，与弓形虫的生存和繁 殖有关，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0014] -种如上所述的弓形虫自杀性DNA疫苗的构建方法，步骤如下：
[0015]以弓形虫RH株DNA为模板，利用一对特异性引物，PCR扩增获得长为1815bp的 NTPase-II的编码框序列，该序列不含信号肽，然后将纯化后的NTPase-II片段插入到甲病 毒复制子载体DREP上的XmaI和SpeI位点，形成重组质粒DREP-NTPase-II，提取质粒并 纯化之后，获得弓形虫自杀性DNA疫苗。
[0016] 而且，所述一对特异性引物序列为：
[0017]NTPase-II上游引物：SEQIDN0. 3;
[0018]NTPase-II下游引物：SEQIDNO. 4〇
[0019] 而且，具体步骤如下：
[0020] ⑴设计特异性引物：
[0021] 根据弓形虫RH株NTPase-II基因序列，该基因序列去除信号肽，设计一对特异性 引物NTPase-II上游引物和NTPase-II下游引物，在引物5'端分别引入Xmal和Spe I酶 切位点；
[0022] ⑵NTPase-II基因扩增：
[0023] 以弓形虫RH株DNA为模板，用KAPAHiFi高保真酶扩增NTPase-II基因，PCR反应 体系和反应条件如下：
[0024]
[0025]PCR反应条件：预变性 95°C5min，变性 98°C20s，退火 60°C15s，延伸 72°Clmin， 共32个循环，终延伸72°C2min;
[0026] 取部分PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，获得预期大小1815bp的目的条带，剩余 的PCR产物纯化回收，得NTPase-II片段；
[0027] ⑶NTPase-II目的片段及载体的双酶切和回收：
[0028]NTPase-II片段和DREP-EGFP载体用Xmal和SpeI进