可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-712-3p的制作方法
【专利摘要】本发明公开了可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-712-3p，在弓形虫感染的小鼠模型中，通过提取血浆总RNA，反转录获得其cDNA，采用Q-PCR技术筛选了高表达的mmu-miR-712-3p，与弓形虫感染具有明显的相关性,可作为弓形虫病诊断的标识性miRNA。并以其作为标志物建立了弓形虫感染的Q-PCR检测方法，具有较高的敏感性和特异性，为弓形虫病的临床诊断提供一种可靠的检测依据和快速检测方法，具有重要的临床应用价值。
【专利说明】可检测感染弓形虫的标识性mmu-m i R-712~3p
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物【技术领域】，具体地说是可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-712_3p。
【背景技术】
[0002]刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生虫。人类首例报告为1908年，与动物弓形虫病同时发现，全世界约有5~10亿人感染弓形虫病，人类与这种疾病的斗争已进行了一个多世纪，但至今疾病仍在全球肆虐。我国每年约有8~9万名由于弓形虫引起损害的新生儿出生，感染弓形虫的妇女其异常生产率是正常孕妇的3倍，造成畸胎，死胎。WHO和美国⑶C已将弓形虫病作为艾滋病的指征性疾病。
[0003]目前认为，从动物和人体所分离出的弓形虫均属于同一个种，由于实际中弓形虫不同分离株的毒力存在差异，一股根据弓形虫感染小鼠后的毒性可将其分为鼠毒力株和鼠无/低毒力株，或根据基因连锁图谱分为三个型(Type I,Type I1、TypeIII)。Type I为强毒株，代表虫株RH株为国际标准强毒株，TypeII，TypeIII为弱毒株，基因型变异要大得多。人类感染的弓形虫虫株大多数属于Type II基因型，比较常见的有ME49株等。因此，目前对于弓形虫的检测和防治主要针对I型RH株和II型ME49株。
[0004]弓形虫病的早期诊断仍是亟待解决的重要问题，该病诊断方法大致可分为病原学检查、免疫学方法、分子生物学技术等3类。传统的病原学检查方法如镜检、虫体分离法等费时、费力，且特异性和敏感性不高，不能适应当前弓形虫病诊断及防治的需要。免疫学诊断方法，即检测弓形虫抗体，但弓形虫病患者常伴有免疫功能低下，往往会出现抗体水平的下降，难以做出正确的诊断。分子生物学诊断方法简便快捷，灵敏性好，特异性高，包括普通PCR、巢式PCR、荧光定量PCR、原位PCR等，所应用的诊断基因标靶包括B1、ITS-1、P30基因等，但由于这些诊断基因在弓形虫基因组中的拷贝数并不高(1-30拷贝)，影响该病的诊断。因此，选择高特异性及敏感性的临床生物标志物，并建立快速、准确的实验方法，对于弓形虫的检测、诊断和疾病的治疗具有重要的临床价值。
[0005]近年来,发现microRNAs (miRNAs)与各种疾病的发生和发展有着极为密切的关系。miRNAs表达具有较高的组织特异性、在血液中具有较高稳定性，推测miRNAs可能是一个理想的生物检测标志物，并已经应用于急性心肌损伤，糖尿病，肝癌，肺癌等临床研究。疾病的早期诊断，也成为miRNAs研究的热点。因其具有取材方便、创伤小、可连续体外检测及择时检测的优点，并且血浆中miRNAs的高度稳定性对于疾病的临床诊断具有可靠性强，准确率高的特点。因此，筛选弓形虫感染的特异性miRNA作为检测标志物，建立基于该标志物的检测方法意义重大。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-712-3p。
[0007]可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-712-3p，它的碱基序列为ugcgagucacccccggguguugo
[0008]检测感染弓形虫的Q-PCR试剂盒,包括针对碱基序列为ugcgagucacccccggguguug的mmu-miR-712-3p,所设计的引物；
[0009]所述的引物包括碱基序列tgcgagtcacccccgggtgttg ；
[0010]所述的弓形虫为弓形虫RH株或ME49株。
[0011]本发明提供了可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-712-3p，在弓形虫感染的小鼠模型中，通过提取血浆总RNA，反转录获得其cDNA，采用Q-PCR技术筛选了高表达的mmu-miR-712-3p,与弓形虫感染具有明显的相关性,可作为弓形虫病诊断的标识性miRNA。并以其作为标志物建立了弓形虫感染的Q-PCR检测方法，具有较高的敏感性和特异性，为弓形虫病的临床诊断提供一种可靠的检测依据和快速检测方法，具有重要的临床应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1.感染RH株和ME49株小鼠血浆中mmu-miR-712_3p的差异表达情况；
[0013]图2.感染RH株和ME49株小鼠血浆中mmu-miR-712_3p的定量分析；
[0014]图3.ROC曲线分析血衆mmu-miR-712-3p对不同虫株引起弓形虫病的鉴别效能；
[0015]图4.血衆mmu-miR-712-3p及celniR-39的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。
【具体实施方式】
[0016]实施例1BALB/c攻虫实验
[0017]60只6-8周龄的BALB/c小鼠被随机分成3组，每组20只，其中两组分别腹腔注射RH株和ME49株速殖子IO6个/只，第3组为健康对照组，采用吉姆萨染色法和血片DNA法确定虫体感染。
[0018]实施例2血浆总RNA提取
[0019]感染后72小时通过眼球取血的方式获得所有小鼠的抗凝血。将抗凝血室温1200g/min离心10分钟，取上清后再4°C 12000g/min离心10分钟，取上清即为处理好的血浆样本。
[0020]血衆总RNA 的提取使用 mirVana? miRNA Isolation Kit (Ambion, USA)试剂盒,合成的cel-miR-39作为外参添加于血浆中，具体步骤如下:
[0021]1.每 600 μ L 血衆中加入 600 μ L2 XDenaturing Solution,混匀，冰上孵育 5 分钟。
[0022]2.加入1200 μ L酚氯仿，漩涡震荡I分钟，10000g/min离心5分钟。
[0023]3.取上清加入1.25倍体积的乙醇，将混合液用柱子滤过，10000g/min离心30秒，弃滤过的液体。
[0024]4.加入 700 μ L miRNA Wash Solutionl 于柱子中，10000g/min 离心 30 秒，弃滤过
的液体。
[0025]5.加入 500 μ L miRNA Wash Solution2/3 于柱子中，10000g/min 离心 30 秒，弃滤
过的液体，重复此步骤。
[0026]6.空离I分钟，将柱子移到新管中，加入IOOyL无RNAse的水，10000g/min离心30秒，获得的总RNA溶于水中。
[0027]实施例3反转录及Q-PCR体系的建立
[0028]1、反转录
[0029]50ng 的总 RNA用 miScript II Reverse Transcription kit (Qiagen, Germany)试剂盒进行反转录，反应体系见表1，混匀液体，37°C孵育I小时后，95°C水浴5分钟，在-20°C中长期保持。
[0030]表1反转录反应体系
[0031]
【权利要求】
1.可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-712-3p，它的碱基序列为ugcgagucacccccggguguugo
2.检测感染弓形虫的Q-PCR试剂盒,包括针对碱基序列为ugcgagucacccccggguguug的mmu-miR-712-3p,所设计的引物。
3.根据权利要求2所述的检测感染弓形虫的Q-PCR试剂盒，其特征在于:所述的引物包括碱基序列 tgcgagtcacccccgggtgttg。
4.根据权利要求3所述的检测感染弓形虫的Q-PCR试剂盒，其特征在于:所述的弓形虫为弓形虫RH株或ME49株。`
【文档编号】C12N15/113GK103866011SQ201410072189
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】陈启军, 姜宁, 贾博寅 申请人:吉林大学