专利名称：一种用于弓形虫感染的诊断抗原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物兽药技术领域，是一种用于弓形虫感染的诊断抗原及其制备方法和应用。该诊断抗原位于弓形虫(Toxoplasma gondii)速殖子致密颗粒上，由267个氨基酸组成的蛋白，该蛋白在弓形虫入侵细胞的过程中和弓形虫刚刚完成入侵时分泌到寄生泡边缘。
背景技术：
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)属于原生动物门，顶复亚门，孢子虫纲，球虫亚纲，真球虫目，艾美耳亚目，肉孢子虫科，弓形虫属，于1908年被发现和命名。弓形虫的生活史包括有性生殖阶段(球虫型生活史)和无性生殖阶段。弓形虫只有在终末宿主猫科动物肠上皮细胞中进行有性生殖，但是可以在任何一种温血动物体内进行无性生殖，如哺乳动物和鸟类，甚至有报道表明在适宜的温度下，某些爬行动物体内也有弓形虫繁殖。因此弓形虫是一种寄生范围广泛的人畜共患的机会致病性原虫。该病不仅给畜牧业发展带来很大影响，也严重威胁人类健康。在我国，于恩庶于20世纪50年代在猫、兔等动物体内发现了弓形虫。上世纪7(T80年代，弓形虫病曾经在猪群中爆发，引起猪群大批死亡，造成了严重危害。弓形虫常常与其它病原混合感染，成为了一种重要的家畜致病因素。在人类中，全球大约有1/3的人感染有弓形虫，我国居民的弓形虫感染率为7.9%。正常的成年人感染弓形虫后一般自愈，没有症状或者症状很轻，但是弓形虫感染对于孕妇、免疫力低下、免疫缺陷的人群危害严重。弓形虫病可以导致孕妇的流产、胎儿畸形并危及免疫缺陷病人的生命。另有相关研究表明弓形虫的隐性感染可能导致人的行为变化，与精神疾病有一定的相关性。
弓形虫隐性感染鸡是一类隐蔽性高、容易忽视的重要弓形虫传染源。散养鸡从泥土地采食，极易接触到由猫粪中的弓形虫污染的泥土，从而感染弓形虫。鸡感染弓形虫后体内存在弓形虫包囊，本身却没有显著症状，不易被发现带虫。人类摄入感染弓形虫的鸡肉时，如果烹调不充分或生熟食相互污染，则容易被鸡肉中的弓形虫包囊感染。弓形虫感染的检测方法有很多。传统的病原学诊断方法、DT染色实验、凝集试验，而弓形虫ELISA抗体检测法具有简便易行、灵敏度高、易于标准化、自动化的特点，是一种良好的血清学检测手段。目前国内市售的鸡弓形虫感染抗体诊断试剂盒存在抗体检出时间短，弓形虫感染后期无法检出的问题。由于包被抗原的选择是决定ELISA检测效率的关键，这些问题的形成很可能是由包被抗原的选择未经优化引起的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于弓形虫感染的诊断抗原。该抗原GRA8 (致密颗粒蛋白)位于速殖子致密颗粒上，由267个氨基酸组成，在弓形虫入侵细胞的过程中和弓形虫刚刚完成入侵时分泌到寄生泡边缘。本发明的另一目的在于提供一种用于弓形虫感染的诊断抗原的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:氨基酸序列为SEQ ID N0:4的GRA8蛋白在制备弓形虫感染的分子生物学诊断试剂盒或血清学诊断试剂盒中的应用。核苷酸序列为SEQ ID NO:1的GRA8基因在制备弓形虫感染的分子生物学诊断试剂盒或血清学诊断试剂盒中的应用。核苷酸序列为SEQ ID NO:1的GRA8基因编码的蛋白在制备弓形虫感染的分子生物学诊断试剂盒或血清学诊断试剂盒中的应用。一种用于弓形虫感染的诊断抗原的制备方法，包括以下步骤:(I)设计引物 P1、P2:
Pl: 5’一CCGGAATTCATGGCTTTACCATTGCGTGTT—3’，P2: 5’一CCCAAGCTTTTAATTCTGCGTCGTTACGGT—3’ ；(2)采用一步法提取弓形虫的总RNA ；(3)cDNA的合成:以上述的总RNA为模板，用oligo dT18为引物进行反转录，合成cDNA第一链；(4) GRA8基因的RT-PCR扩增:以cDNA为模板，以PI和P2为引物进行RT-PCR扩增；(5)克隆GRA8基因:取上述获得的RT-PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，切下目的条带回收纯化，得到纯化的PCR产物，取纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 a，挑取阳性克隆菌，提取质粒，确定为PMD18-T-GRA8 ；(6) GRA8基因的表达:分别用EcoRI和Hind III双酶切克隆质粒载体PMD18-T-GRA8和pET28a，回收GRA8目的基因和pET28a大片段，按比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用Hind III和EcoRI双酶切鉴定，确定为pET28a-GRA8 ；(7)表达产物的纯化:使用ImM浓度的IPTG诱导在LB培养基中培养的GRA8表达菌，离心收集菌体，破碎分离，得到包涵体，向包涵体中加入ElutionBuffer并于4°C过夜溶解包涵体离心取上清并滤膜过滤后得蛋白样品，将蛋白质样品进行组氨酸亲和层析纯化得目的蛋白。上述的制备方法，其在于一步法提取弓形虫总RNA的步骤为:取IO7纯化好的弓形虫速殖子置于DEPC处理过的玻璃匀浆器中，加入I mLTrizol试剂，研磨5 15min，匀浆后溶液置1.5 mLeppendorf管中，加入0.2 mL 24:1的氯仿/异戍醇混合物，用力摇动样品10 20 S，置冰上3 8 min ;然后4°C 12000r/min，离心15 min ;将含有RNA的上层水相转到另一 eppendorf管中并置冰上；向上清内加入0.5 mL冰冷异丙醇,轻轻混匀样品并置冰上；5 15 min后4°C 12000 r/min,离心15 min,去掉异丙醇,加入I mL75%乙醇洗漆RNA沉淀,通过摇晃或吸打使RNA沉淀重新悬浮；4 °C 12000r/min离心8 min ;去掉乙醇,干燥；加入20 u LDEPC水溶解沉淀得弓形虫总RNA。上述的制备方法，其在于合成cDNA第一链的反应体系，以总体积20 y L计各组分为 总RNA 10 u L，oligo dT 2u L,混匀后70°C变性lOmin，迅速冰浴2min，再加入下列成分 5XRT Buffer 4 u L, dNTP (IOmM) 1.0 u L, M-MLV 反转录酶(5U/y L) 1.0 y L，RNasineInhibitor (40U/y L) 0.5 y L，无 RNase 水补至 20 y L ;反应条件为:42°C 反应lh，70°C温浴15min，冰上冷却后得cDNA。上述的制备方法，其在于以总体积为50ii L计，RT-PCR扩增GRA8基因的反应体系为:cDNA 模板 2.0ii L，10XPCR Buffer 5iiL，25mM 的 MgCl2 5yL，上游引物 Pl (IOpM)2iiL，下游引物P2 (IOpM) 2 u L, LA Taq酶(5U/y L)0.5 y L，补加灭菌超纯水至50 y L ;反应条件为:于PCR仪上95°C预变性lmin，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，30个循环，72°C延伸10 min。上述的制备方法，其在于克隆GRA8基因时，以总体积为10 ii L计，纯化的PCR产物与PMD18-T载体连接的反应体系为:纯化的PCR产物4.5iil，pMD18_T载体0.5yl，Ligation solution I 5.0 ii I,将上述反应体系中的各组分在薄壁eppendorf管中混合均匀后11°C连接过夜。一种弓形虫感染的诊断抗原，该诊断抗原位于速殖子致密颗粒上，包含267个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4。该诊断抗原的筛选和鉴定的技术路线如下:(I)人工构建弓形虫的动物模型。(2)腹腔注射弓形虫速殖子。(3)长时间采集感染动物血清，与弓形虫全虫蛋白进行免疫印迹，筛选抗原蛋白条带。(4)筛选出的抗原蛋白条带进行双向电泳，再将抗原蛋白点进行MALD1-T0F-T0F质谱鉴定，从而获得单一抗原蛋白。(5)重组抗原蛋白，进行ELISA检验条件的建立和效果验证。本发明利用Western blot法筛选家鸡在弓形虫感染过程中早期、中期、后期识别率均较高的抗原条带并确定编 码基因GRA8，旨在增加弓形虫的检出时间和检出效果。本发明的有益效果:解决了目前市场上销售的鸡弓形虫抗体检测ELISA试剂盒存在抗体检出时间短，对感染后期抗体无法检出的缺点。应用该诊断抗原进行ELISA法诊断有着采样简单，对检测设备要求低，检测结果敏感性高、特异性高的特点，同时解决了一些使用速殖子天然抗原制作的ELISA试剂盒是存在的特异性差、假阳性率高的问题。
图1为GRA8基因的T载体双酶切鉴定其中，M:分子量标准 DL2000 ；1:pMD-18T_GRA8 质粒酶切前；2:pMD-18T_GRA8 质粒酶切后图2为pET28a_GRA8双酶切鉴定其中，M:分子量标准DL5000 ；1:pET28a_GRA8质粒酶切前；2:pET28a_GRA8质粒酶切后图3 为 BL21-pET28a_GRA8 的诱导表达其中，M:分子量标准；1:BL21-pET28a空载体诱导前；2:BL21-pET28a空载体诱导后；3:BL21-pET28a-GRA8 诱导前；4，5，6，7:BL21-pET28a-GRA8 诱导后 1,2,4, 6h图4为重组蛋白rGRA8的组氨酸亲和层析纯化结果
其中，M:分子量标准；I:纯化后的rGRA8蛋白图5为GRA8重组蛋白的抗原性Western blot结果其中，M:分子量标准；1:纯化后的GRA8蛋白与阳性血清的Western blot ；2:纯化后的GRA8蛋白与阴性血清的Western blot
具体实施例方式基础材料:1.弓形虫RH株:来源于国家兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CVCC3217(L)。2.实验动物:0日龄的小公雏购自南京某种鸡场，自出壳至实验结束时饲养在严格消毒，自由采食和饮水。
3.质粒与菌种:宿主菌 E.coli DH5 a、BL21,质粒 pET28a(+)、pMD18_T vector克隆载体，购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司4.工具酶与试剂:Trizol试剂为Promega公司产品；DEPC为Amresco公司产品；Bioshop公司人淋巴细胞分离液；Bio-Rad公司1%低熔点琼脂糖封闭液；博士德公司DAB显色试剂盒；Millipore 公司 0.45 u m NC 膜;反转录酶 AMV、Oligo (dT) 18、rTaq 酶、dNTP、DNA分子量标准物DL2000、T4 DNA Ligase、限制性内切酶，水饱和酚、琼脂糖胶回收试剂盒均为大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品；其余试剂为国产分析纯。5.主要仪器设备:冷冻台式离心机(Eppendorf centrifuge 5417R);紫外可见分光光度计(Bio-Rad) ;PCR仪(HYBAID公司)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；紫外分析仪(WD-9304 C型，北京市六一仪器厂)；Bio-Rad PAGE系统、半干转系统；电热封口机；脱色摇床；Bio-rad凝胶成像系统；微量移液器(GILS0N公司)。实施例1.弓形虫感染诊断抗原的筛选和鉴定1.1弓形虫的扩增和纯化取弓形虫RH株约5 X IO6腹腔注射健康清洁级ICR小鼠，饲养3天后断颈处死，使用灭菌生理盐水冲洗小鼠腹腔，收集含有弓形虫速殖子的淋巴细胞，并使用淋巴细胞分离液纯化速殖子，去除淋巴细胞，进行纯化。1.2鸡弓形虫人工感染模型的建立和血清采集购I日龄雏鸡，饲养2周龄时按照每只雏鸡IO7的剂量腹腔注射弓形虫JS株，在攻虫后不同时间采集并分离血清。1.3速殖子全虫蛋白的提取和Western blot将纯化后的速殖子生理盐水悬液血球计数板计数后离心，按照2X108/ml的最终比例加入等量的水和2 X SDS-PAGE上样缓冲液，95°C加热5min裂解速殖子，使用2ml无菌注射器和小号针头反复抽吸5-10次，95°C再次保温10min，4°C 12000r/min离心lOmin，进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE结束后，立即卸胶，将蛋白胶在转印缓冲液中平衡10_15min，再将胶上的蛋白转印到NC膜上，封闭液中，4-8°C封闭过夜。然后与不同的血清在杂交袋中室温振荡孵育L 5h，封闭液封闭，用0.05%TBST洗涤IOminX 4次，将膜用goat anti chickenIgY封闭液室温中反应lh，TBST洗涤IOminX4次后，使用博士德DAB显色试剂盒避光显色5-10min，使用去离子水终止显色。根据显色结果选取阳性较强、且跨度时间长的抗原蛋白进行分析。1.4抗原蛋白的回收和质谱鉴定按1.3中的方法获得弓形虫全虫蛋白SDS-PAGE电泳胶，参照1.3的结果切下对应抗原蛋白分子量区域的聚丙烯酰胺凝胶，截成较短的小条，放入透析袋，加入含有PMSF的TGS电泳缓冲液2ml，封紧袋口充分浸泡。然后电洗脱70min。电洗脱后，浓缩蛋白洗脱液至Iml左右。移至EP管，用丙酮沉淀处理后进行IEF聚焦电泳。电泳后，同1.3中的方法Western blot分析，根据需要挖取的需要的蛋白点，用移液器吸取超纯水吹打，移入EP管中，送专业的质谱鉴定机构进行MALD1-T0F-T0F检测，并通过蛋白数据库检索比对，结果为弓形虫的GRA8蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0:4。实施例2.用于弓形虫感染的诊断抗原GRA8的制备2.1合成引物根据实施例1中获知的弓形虫GRA8蛋白，在Genbank中检获核苷酸序列，利用软件primer premier5.0设计GRA8引物P1、P2,并送往上海英俊生物技术有限公司合成引物。序列如下:Pl: 5’ —CCGGAATTCATGGCTTTACCATTGCGTGTT— 3’ (SEQ ID NO:2)，P2: 5’ —CCCAAGCTTTTAATTCTGCGTCGTTACGGT— 3’ (SEQ ID NO:3)。其中下划线部分分别为引入的酶切位点Hind III和EcoRI，；方框部分为起始密码子。2.2弓形虫总RNA的提取
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采用一步法提取弓形虫总RNA，具体操作步骤如下:取IO7纯化好的弓形虫速殖子置于DEPC处理过的玻璃匀浆器中，加入I mLTrizol试剂，研磨10 min，匀浆后溶液置1.5mLeppendorf管中，加入0.2 mL24:1的氯仿/异戍醇混合物，用力摇动样品15 s,置冰上5min ;然后4°C 12000r/min,离心15 min ;小心将含有RNA的水相(上层)转到另一 eppendorf管中并置冰上；向上清内加入0.5 mL冰冷异丙醇，轻轻混匀样品并置冰上；10 min后40C 12000 r/min，离心15 min，小心去掉异丙醇，加入I mL75%乙醇洗涤RNA沉淀，通过摇晃或吸打使RNA沉淀重新悬浮；4 V 12000r/min离心8 min;去掉乙醇，室温(25±5°C)干燥；加入20 y LDEPC水(无RNA酶DEPC处理的超纯水)水溶解沉淀。紫外分光光度计测定RNA的含量及纯度。2.3 cDNA 的合成以上述的总RNA为模板，用oligo dT18为引物进行反转录，合成cDNA第一链，反应体系为20 ii L:总RNA IOu L, oligo dT 2 y L，混匀后70°C变性lOmin，迅速冰浴2min，再加入下列成分 5XRT Buffer 4 u L, dNTP (IOmM) 1.0u L, M-MLV 反转录酶(5U/iiL)1.0u L, RNasineInhibitor (40U/y L) 0.5 y L，无 RNase 水补至 20yL。充分混匀，42°C反应lh。70°C温浴15min，冰上冷却后获得cDNA。2.4 GRA8 的基因 RT-PCR 扩增以cDNA为模板，采用以下反应体系进行RT-PCR:cDNA模板2.0 ii L，10XPCRBuffer 5 u LjMgCl2 (25mM)5 y L，上游引物 Pl (IOpM) 21^，下游引物卩2 (10pM)2u L, LATaq酶(5U/ u L)0.5 u L,补加灭菌超纯水至50 u L，充分混匀，于PCR仪上95°C预变性lmin，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 608，30个循环，721:延伸 10 min。
2.5 GRA8基因的克隆(见图1)取上述获得的RT-PCR产物25 iil，I %琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，反应体系如下:
权利要求
1.氨基酸序列为SEQID N0:4的GRA8蛋白在制备弓形虫感染的分子生物学诊断试剂盒或血清学诊断试剂盒中的应用。
2.核苷酸序列为SEQID NO:1的GRA8基因在制备弓形虫感染的分子生物学诊断试剂盒或血清学诊断试剂盒中的应用。
3.核苷酸序列为SEQID NO:1的GRA8基因编码的蛋白在制备弓形虫感染的分子生物学诊断试剂盒或血清学诊断试剂盒中的应用。
4.一种用于弓形虫感染的诊断抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)设计引物PUP2:Pl: 5’一CCGGAATTCATGGCTTTACCATTGCGTGTT—3’，P2: 5’一CCCAAGCTTTTAATTCTGCGTCGTTACGGT—3’ ； (2)采用一步法 提取弓形虫的总RNA； (3)cDNA的合成:以上述的总RNA为模板，用oligodT18为引物进行反转录，合成cDNA第一链； (4)GRA8基因的RT-PCR扩增:以cDNA为模板，以Pl和P2为引物进行RT-PCR扩增； (5)克隆GRA8基因:取上述获得的RT-PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，切下目的条带回收纯化，得到纯化的PCR产物，取纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 a，挑取阳性克隆菌，提取质粒，确定为PMD18-T-GRA8 ； (6)GRA8基因的表达:分别用EcoRI和Hind III双酶切克隆质粒载体pMD18_T_GRA8和pET28a，回收GRA8目的基因和pET28a大片段，按比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用Hind III和EcoRI双酶切鉴定，确定为pET28a-GRA8 ; (7)表达产物的纯化:使用ImM浓度的IPTG诱导在LB培养基中培养的GRA8表达菌，离心收集菌体，破碎分离，得到包涵体，向包涵体中加入ElutionBuffer并于4°C过夜溶解包涵体离心取上清并滤膜过滤后得蛋白样品，将蛋白质样品进行组氨酸亲和层析纯化得目的蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于一步法提取弓形虫总RNA的步骤为:取IO7纯化好的弓形虫速殖子置于DEPC处理过的玻璃匀浆器中，加入I mLTrizol试剂，研磨5 15min,勻衆后溶液置1.5 mLeppendorf管中，加入0.2 mL 24:1的氯仿/异戍醇混合物，用力摇动样品10 20 S，置冰上3 8 min ;然后4°C 12000r/min，离心15 min;将含有RNA的上层水相转到另一 eppendorf管中并置冰上；向上清内加入0.5 mL冰冷异丙醇,轻轻混勻样品并置冰上；5 15 min后4。。12000 r/min,离心15 min,去掉异丙醇,加入I mL75%乙醇洗漆RNA沉淀,通过摇晃或吸打使RNA沉淀重新悬浮；4 V 12000r/min离心8 min ;去掉乙醇，干燥；加入20 u LDEPC水溶解沉淀得弓形虫总RNA。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于合成cDNA第一链的反应体系，以总体积20 ii L计各组分为 总RNA 10 u L，oligo dT 2 u L,混匀后70°C变性lOmin，迅速冰浴2min，再加入下列成分 5XRT Buffer 4 u L, dNTP (IOmM) 1.0u L, M-MLV 反转录酶(5U/U L) 1.0 u L, RNasineInhibitor (40U/y L)0.5 y L，无 RNase 水补至 20 y L ;反应条件为:42°C反应lh，70°C温浴15min，冰上冷却后得cDNA。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于以总体积为50ii L计，RT-PCR扩增GRA8 基因的反应体系为:cDNA 模板2.0 y L，IOXPCR Buffer 5iiL，25mM 的 MgCl2 5u L,±游引物 Pl (IOpM) 2iiL，下游引物 P2 (10pM)2u L, LA Taq 酶(5U/y L) 0.5 y L，补加灭菌超纯水至50 ii L ;反应条件为:于PCR仪上95°C预变性lmin，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，30个循环，72°C延伸10 min。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于克隆GRA8基因时，以总体积为IOyL计，纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接的反应体系为:纯化的PCR产物4.5 yl，pMD18_T载体0.5 ii I, Ligation solution I 5.0 ii I,将上述反应体系中的各组分在薄壁eppendorf管中混合均匀后i re连接过夜。
全文摘要
本发明公开了一种用于弓形虫感染的诊断抗原及其制备方法和应用，属于生物兽药技术领域。利用Western blot、双向电泳、MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定相结合的方法筛选到一种适宜于弓形虫感染诊断的抗原GRA8。本抗原可用于弓形虫感染的各种分子生物学诊断和血清学诊断的应用。
文档编号G01N33/531GK103235119SQ20131012495
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者李祥瑞, 徐立新, 严若峰, 宋小凯, 李锐 申请人:南京农业大学