犬弓形虫感染双抗夹心elisa检测试剂盒及制备方法
【专利摘要】本发明提供一种检测犬弓形虫循环抗原的双抗夹心ELISA试剂盒及其制备方法，利用两株抗弓形虫SAG3单抗，即一株42#抗弓形虫SAG3单抗和一株29#抗弓形虫SAG3单抗建立了检测犬弓形虫CAg的双抗体夹心ELISA方法。该检测特异性高、灵敏度较好、准确性高、稳定性好。具有操作简单、检测快速，易于判断等优点，适合于临床的快速诊断和基层等流行病学调查。
【专利说明】
犬弓形虫感染双抗夹心EL ISA检测试剂盒及制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及犬弓形虫感染循环抗原(CAg)的检测方法，进一步讲是提供了用于犬 弓形虫感染的双抗夹心ELISA检测试剂盒，本发明还公开了该试剂盒的制备方法，属于犬科 动物疾病检测技术领域。
【背景技术】
[0002]刚第弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫。它 能广泛地感染脊椎动物包括人。大多数免疫功能正常人群感染弓形虫后成为无症状的带虫 宿主;部分感染者会出现弓形虫病较典型的症状。
[0003] 犬是弓形虫的中间宿主，也是弓形虫病的重要传染源。近年来，因饲养宠物犬数量 的不断攀升，感染弓形虫的犬对人类公共健康造成了极大的潜在威胁。现行检测弓形虫病 的方法多以抗体检测为主。但检测抗体不能区分现症感染还是既往感染。而检测循环抗原 (CAg)可确定现症感染。目前尚无理想的检测犬弓形虫感染循环抗原的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明公开一种犬弓形虫感染循环抗原(CAg)双抗夹心ELISA检测试剂盒，用于检 测犬是否感染弓形虫，解决了当前尚无理想的检测犬弓形虫感染循环抗原方法的问题。
[0005] 本发明提供了犬弓形虫双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生 产。
[0006] 本发明所述的检测弓形虫循环抗原的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于主要由 以下部分组成：
[0007] HRP酶标单抗、酶标物稀释液、聚苯乙烯塑料反应板、PBS (磷酸盐缓冲液）、包被液、 封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液及样品稀释液、犬弓形虫感染参照阳性及阴性血清等。
[0008] 所述捕获抗体为42#抗弓形虫SAG3单克隆抗体(Anti-A-SAG3-42)(效价为204800， 亚型为G1);
[0009] 检测抗体为HRP标记的29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体(HRP-Anti-A-SAG3-29)(效价 为204800,亚型为G2a)
[0010]包被液是PH值为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；
[0011] 样品稀释液(PBS)及洗涤液(PBST)是含有0.5 % Tween-20的磷酸盐缓冲液；
[0012 ] 封闭液是1 〇 %胎牛血清的PBST溶液；
[0013] 底物显色液是TMB底物溶液；
[0014] 终止液是2mo 1 /L的H2SO4溶液。
[0015] 本发明所述的检测犬弓形虫循环抗原的双抗夹心ELISA试剂盒的制备方法，包括 以下步骤：
[0016] 1)捕获抗体，即42#抗弓形虫SAG3单抗:pH 9.6的包被液稀释后的单抗，使稀释浓 度达到1:800;
[0017] 2)样品稀释液为pH值7.4的磷酸盐缓冲液；依次在800mL去离子水中溶解8g的 NaCl、0.2g的KC1、3.63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0.24g的KH2P〇4,以浓HC1调节溶液pH值至7.4，加 去离子水定容至lOOOmL，高压后常温保存待用；
[0018] 3)包被液为pH值9.6的碳酸盐缓冲液；称量2.93g的NaHC〇3和1.95g的Na2C〇3于 250mL烧杯中，加去离子水定容至100mL，高压后常温保存待用；
[0019] 4)封闭液为10%胎牛血清的PBST液：lmL胎牛血清溶解于PBST液，定容至10mL;
[0020] 5)洗涤液为0 ? 01mol/L，pH7 ? 4的TOST液：依次在800mL去离子水中溶解8g的NaCl、 0 ? 2g的KC1、3 ? 63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0 ? 24g的KH2P〇4，以浓HC1 调节溶液pH值至7 ? 4，加入 0.5mL的Tween-20,加去离子水定容至lOOOmL，高压后常温保存待用；
[0021 ] 6)底物溶液:购买的商品化的TMB底物显色液；
[0022] 7)终止液为2mol/L H2S〇4:浓硫酸22.2mL，去离子水177.8mL;将浓硫酸沿杯壁缓慢 倒入水中，混匀，室温贮存待用；
[0023] 8)酶标抗体为HRP标记29#抗弓形虫SAG3单抗：用TOST液1:3000稀释酶标物后4°C 保存；
[0024] 9)犬弓形虫参照阳性血清；
[0025] 10)犬弓形虫参照阴性血清；
[0026] 11)聚苯乙烯塑料反应板；
[0027]试剂盒的保存温度为4°C保存。
[0028]本发明检测试剂盒的检测原理：以42#抗弓形虫SAG3单抗(捕获抗体)为包被抗体， 将其包被酶标板后，洗去游离部分;用封闭液进行封闭，洗去游离部分;再加入被检血清，如 果血清有犬弓形虫CAg就能和包被抗体特异性结合，形成免疫复合物，将游离的被检血清洗 去；加入HRP酶标29#抗弓形虫SAG3单抗(检测抗体），就会形成42#抗弓形虫SAG3单抗-犬弓 形虫CAg-29#抗弓形虫SAG3酶标单抗复合物，洗去游离的酶标物;加入显色底物，酶标物会 使无色的显色剂现色，加终止液后变黄;若被检血清无弓形虫CAg，则不能形成42#抗弓形虫 SAG3单抗-犬弓形虫CAg-29#抗弓形虫SAG3酶标单抗物复合物，酶标物不能被固定于酶标 板，加入显色底物及终止液后无色。
[0029]酶标仪测定在45Onm波长时的吸光度值（OD45值），终止反应后颜色的深浅， 0D45Qnm值大小与相应待检血清样品中的弓形虫CAg含量的多少呈正相关关系。
[0030] 本发明积极效果在于：利用两株抗弓形虫SAG3单抗即一株42#抗弓形虫SAG3单抗 和一株29#抗弓形虫SAG3单抗建立了检测犬弓形虫CAg的双抗体夹心ELISA方法。该检测特 异性高、灵敏度较好、准确性高、稳定性好。具有操作简单、检测快速，易于判断等优点，适合 于临床的快速诊断和基层等流行病学调查。
[0031]本发明的试剂盒所有试剂均为已配制好的工作液，可以直接操作无需处理，减少 了操作步骤，可以快速、灵敏检测待检犬血清中的CAg，避免了复杂的操作，对设备要求低； 且本发明的试剂盒样本用量小，试剂保存时间长，对操作者无毒性等；因此本发明应用42# 抗弓形虫SAG3单抗和29#抗弓形虫SAG3单抗建立的检测犬弓形虫CAg的双抗体夹心ELISA方 法检测试剂盒具有较好的市场前景。
【具体实施方式】：
[0032]本发明与以下实施例作进一步说明，但本发明的内容不局限于以下的实施例中。 [0033] 实施例1:
[0034]用HRP标记单克隆抗体
[0035]依据Glue活化辣根过氧化物酶试剂盒的说明书标记29#抗弓形虫SAG3单克隆抗 体。步骤如下：
[0036] (1)取McAb-29溶液100ug，加入100ul REAGENTIA型活化辣根过氧化物酶。
[0037] (2)加入REAGENTII后充分混匀并用PH试纸调PH值9.5,置于37°C，30min。
[0038] (3)用200ul的枪头，插入硼氢化钠粉末中，在枪头尖端可看到白色粉末时，将其转 移至酶标物中，混匀。
[0039] (4)加入REAGENIII (约3倍体积的REAGENT II)并确保酶结合物PH在7 ? 0左右。
[0040] (5)加入甘油至总体积的50%，以稳定酶结合物活性，-20°C保存。
[0041 ] 实施例2:
[0042]标记抗体最佳稀释度的确定
[0043]选择最佳封闭剂，捕获抗体和犬弓形虫参考阳性血清按最佳工作浓度稀释，将检 测抗体稀释为不同浓度1:3000、1:6000、1:9000。加底物缓冲液显色，测定OD45〇nm值，确定检 测抗体最佳工作浓度为1:3000。
[0044] 实施例3:
[0045] 双抗夹心ELISA方法的建立
[0046] 1、捕获抗体和犬弓形虫参考阳性血清工作浓度的确定
[0047] 采用棋盘方阵的方法，分别取不同浓度的捕获抗体：1:200、1:400、1:800、1:1600、 1:3200、1:6400/孔的稀释倍数包被酶标板，选择最佳封闭剂，用不同稀释倍数1:6、1:12、1: 24、1:48、1:96、1:192的弓形虫参考阳性血清孵育，进行双抗体夹心ELISA，确定捕获抗体和 血清最佳工作浓度。捕获抗体的最佳包被浓度为1:800/100此，弓形虫参考阳性血清最佳稀 释度为1:12。
[0048]表1棋盘法确定抗体最适包被浓度和弓形虫参考阳性血清最适稀释浓度
[0050] 2、最佳封闭剂的选择
[0051] 在已确定的最佳包被抗体、酶标抗体的稀释浓度下，选用3种封闭剂(包括10%胎 牛血清、5%脱脂奶粉、1%BSA)进行封闭。10%的胎牛血清为最佳封闭剂(见表2)。
[0052]表2 ?最佳封闭剂的确定
[0054] 3、双抗夹心ELISA临界值的判定
[0055] 按建立的双抗体夹心ELI SA方法对15份阴性血清进行检测计算出15份阴性血清的 X=0.087,SD = 0.0125;阳性界限3+3SEMU25;阴性界限根据统计学原则 得到双抗体夹心ELISA方法判定标准0D45Q?值彡0.125者判为阳性值，0D45Q?值〈0.112者判 为阴性，介于二者之间，即〇.125〈X彡0.112判为可疑(见表3)。
[0056] 表3 ?双抗体夹心ELISA临界值的确定
[0058] 4、性能的测定
[0059] (1)敏感性试验
[0060] 采用已经建立的双抗夹心ELISA方法，将犬弓形虫参考阳性血清按1:12到1:768倍 比稀释。判断该方法的敏感性。该方法的灵敏性为1:48(见表4)。
[0061 ] 表4 ?敏感性试验
[0063] (2)特异性试验
[0064] 以犬阴性血清作为参照，经双抗体夹心ELISA方法检测，犬弓形虫参考阳性血清与 犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清、犬巴贝斯虫阳性血清均无交叉 反应发生，确定该方法的特异性(见表5 )，结果表明该方法特异性较强。
[0065] 表5特异性试验
[0067] (3)重复性试验[0068] 选用3份犬弓形虫参考阳性血清和3份犬弓形虫参照阴性血清，经建立的双抗体夹 心ELISA方法进行批间批内重复性试验后得到，批内重复性试验的变异系数最大值为 10.47%，批间变异系数最大值为14.00%，表明该方法重复性较好(见表6)。
[0069] 表6 ?双抗体夹心ELISA的批内、批间重复性试验结果
[0071] 实施例4
[0072]检测犬弓形虫CAg双抗体夹心ELISA试剂盒的组装 [0073] ELISA检测试剂盒包括以下组分：
[0074] 1.捕获抗体，即42#抗弓形虫SAG3单抗:pH 9.6的包被液稀释后的单抗，使稀释浓 度达到1:800;
[0075] 2.样品稀释液，即roS(磷酸盐缓冲液，pH值7.4):依次在800mL去离子水中溶解8g 的NaCl、0.2g的KC1、3.63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0.24g的KH2PO4,以浓HC1调节溶液pH值至7.4， 加去离子水定容至l〇〇〇mL，高压后常温保存待用；
[0076] 3?包被液(碳酸盐缓冲液，pH值9 ? 6):称量2 ? 93g的NaHC03和1 ? 95g的Na2C03于250mL 烧杯中，加去离子水定容至100mL，高压后常温保存待用；
[0077] 4.封闭液（10 %胎牛血清的PBST液）：lmL胎牛血清溶解于PBST液，定容至10mL; [0078] 5.洗涤液(0.01mol/L，pH7.4的TOST液）：依次在800mL去离子水中溶解8g的NaCl、 0 ? 2g的KC1、3 ? 63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0 ? 24g的KH2P〇4，以浓HC1 调节溶液pH值至7 ? 4，加入 0.5mL的Tween-20,加去离子水定容至lOOOmL，高压后常温保存待用；
[0079] 6.底物溶液:购买的商品化的TMB底物显色液；
[0080] 7.终止液(2mol/L H2S〇4):浓硫酸22.2mL，去离子水177.8mL。将浓硫酸沿杯壁缓慢 倒入水中，混匀，室温贮存待用；
[00811 8.酶标抗体(HRP标记29#抗弓形虫SAG3单抗)使用液配制：用PBST液1:3000稀释酶 标物后4°C保存；
[0082] 9.犬弓形虫参照阳性血清；
[0083] 10.犬弓形虫参照阴性血清；
[0084] 11.聚苯乙烯塑料反应板；
[0085] 试剂盒的保存温度为4°C保存。弓形虫参照阳性血清和参照阴性血清为-20°C保 存。
[0086] 实施例5
[0087]犬待检样本检测:长春地区某宠物医院提供待检犬血清76份。
[0088] 其步骤如下：
[0089] (1)取捕获抗体以每孔100yL的体积包被酶标板，4°C条件下包被过夜；
[0090] (2)用洗涤液洗涤3次，每次洗涤lmin，间隔5min，拍干；
[0091] (3)每孔加入1 OOyL封闭液，37 °C温育2h;
[0092] (4)用洗涤液洗涤3次，每次洗涤lmin，间隔5min，拍干；
[0093] (5)待检血清用PBS稀释（1:12)，同时设阴性及空白对照各1孔，阴性对照血清也以 1:12稀释，空白对照不用稀释，直接加样。37°C温育2h;
[0094] (6)用PBST洗涤3次，每次洗涤lmin，间隔5min，拍干；
[0095] (7)酶标抗体使用液，每孔加1 OOyL，37 °C温育50min;
[OO96] (8)用洗涤液洗涤4次，每次洗涤lmin，间隔5min，拍干；
[0097] (9)加入TMB底物溶液，每孔100yL，
[0098] (10)37°C显色10min后，每孔滴加100yL终止液，室温终止即可；
[0099] (11)测0D值：用酶标仪测定0D45Qnm值;每次实验每板均设参照阴性血清和空白对 照。
[0100] (12)结果判定：以空白对照孔调零后测各孔值，用酶标仪于450nm读取0D值。当 OD45〇nm多0 ? 125时，样品判定为阳性；当OD45〇nm<0 ? 112时，样品判定为阴性；当0 ? 125< OD45〇nm<0.112时，样品判定为可疑，但是需要重新检测。
[0101] 应用已建立的双抗夹心ELISA方法对76份来自长春地区某宠物医院犬待检血清进 行检测，阳性率为5.26% (4/76)。
【主权项】
1. 一种检测弓形虫循环抗原的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于主要由以下部分组 成： HRP酶标单抗、酶标物稀释液、聚苯乙烯塑料反应板、PBS(磷酸盐缓冲液）、包被液、封闭 液、洗涤液、底物溶液、终止液及样品稀释液、犬弓形虫感染参照阳性及阴性血清； 所述捕获抗体为42#抗弓形虫SAG3单克隆抗体(Anti-A-SAG3-42)(效价为204800，亚型 为 G1); 检测抗体为HRP标记的29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体(HRP-Anti-A-SAG3-29)(效价为 204800,亚型为 G2a) 包被液是PH值为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液； 样品稀释液(PBS)及洗涤液(PBST)是含有0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液； 封闭液是10 %胎牛血清的PBST溶液； 底物显色液是TMB底物溶液； 终止液是2mol/L的H2S〇4溶液。2. 如权利要求1所述的一种检测弓形虫循环抗原的双抗夹心ELISA试剂盒制备方法，包 括以下步骤： 1) 捕获抗体，即42#抗弓形虫SAG3单抗:pH 9.6的包被液稀释后的单抗，使稀释浓度达 到1:800; 2) 样品稀释液为pH值7.4的磷酸盐缓冲液;依次在800 mL去离子水中溶解8 g的NaCl、 0.28的1((：1、3.63 8的恥2册04.12!120和0.24 8的腿2?04，以浓11(：1调节溶液?!1值至7.4，加去 离子水定容至1000 mL，高压后常温保存待用； 3) 包被液为口田直9.6的碳酸盐缓冲液;称量2.938的似!1〇)3和1.95 8的似2〇)3于250 1^ 烧杯中，加去离子水定容至100 mL，高压后常温保存待用； 4) 封闭液为10%胎牛血清的PBST液：1 mL胎牛血清溶解于PBST液，定容至10 mL; 5) 洗涤液为0.01 mol/L，pH7.4的TOST液：依次在800 mL去离子水中溶解8 g的NaCl、 0.2 g的KC1、3.63 g的Na2HP〇4.12H20和0.24 g的KH2P〇4,以浓HC1 调节溶液pH值至7.4,加入 0.5 mL的Tween-20,加去离子水定容至1000 mL，高压后常温保存待用； 6) 底物溶液:购买的商品化的TMB底物显色液； 7) 终止液为2 mol/L H2S〇4:浓硫酸22.2 mL，去离子水177.8 mL;将浓硫酸沿杯壁缓慢 倒入水中，混匀，室温贮存待用； 8) 酶标抗体为HRP标记29#抗弓形虫SAG3单抗：用PBST液1: 3000稀释酶标物后4 °C保 存； 9) 犬弓形虫参照阳性血清； 10) 犬弓形虫参照阴性血清； 11) 聚苯乙烯塑料反应板； 试剂盒的保存温度为4 °C保存。
【文档编号】G01N33/577GK106053818SQ201610383181
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】李建华, 宋慧琦, 张西臣, 杨升, 高珺珊, 寇金华, 宫鹏涛, 杨举, 李 赫, 李棕松, 杨正涛, 尹继刚
【申请人】吉林大学