一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法
【专利说明】一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于环境微生物学领域，具体涉及一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂和检测水体细菌数量的荧光显微计数方法。
【背景技术】
[0003]水体总菌数是反映湖泊、河流水质状况的指标之一。常用的水体总菌数检测方法为培养法，包括平板法、MPN法等。但并非所有的细菌都能培养，因此，培养法会导致检测结果误差较大。为克服培养法的缺点，各种直接计数方法被广泛应用，其中结果相对可靠、并被大家广泛认可的方法包括荧光显微计数法和流式细胞仪计数法。由于流式细胞仪价格昂贵，使用和维护成本高，在水体总菌数检测上应用并不多见。荧光显微直接计数法是最近30年来发展起来的用于细菌计数的新方法，它具有快速、准确等特点，在水样、土壤及沉积物等环境样品中细菌数量的测定中有着广泛的应用。使用的荧光染料也从A0、DAPI发展到SYBR Green系列荧光染料，同时还包括单染色、双染色等方法的开发。
[0004]在荧光显微计数中常用的滤膜是氧化铝无机滤膜。这种无机滤膜无需任何前处理，使用方便，没有背景荧光，但缺点是价格较贵，能生产的厂家极少，2009-2012甚至出现了厂家搬迁厂址而导致全球断货的局面。因此，研究者们也尝试使用普通的有机滤膜(如醋酸纤维滤膜)进行荧光显微计数。但目前已报道的有机滤膜使用技术和方法中，有机滤膜都要经过复杂费时的前处理以降低背景荧光信号，不适于快速检测，如公开号为101344476的中国专利“细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法”中使用的滤膜要经过疏水处理和染色烘干后才能用于荧光显微观察。
【发明内容】
[0005]本发明的目的旨在克服现有技术的缺陷，提供一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂和检测水体细菌数量的荧光显微计数方法，该方法省时省力、成本低廉、能快速准确检测水体中的细菌数量。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种用于荧光显微镜细菌计数的抗褪色剂，用对苯二胺、氯化钠、磷酸氢二钠、Tris、甘氨酸、甘油溶于去离子水中，调节PH后得到。
[0007]优选的，每200mL所述的抗褪色剂的储备液通过包含如下步骤的方法制备得到:将1.5-3g对苯二胺、0.5-lg氯化钠、2.5-3.5g磷酸氢二钠、0.2-0.4g Tris、3_5g甘氨酸溶于60-80mL去离子水中，用盐酸和氢氧化钠调节pH至7-8，加入80_100mL甘油，最后再用去离子水定容至200mL。该储备液避光4°C保存，有效期3个月。
[0008]更优选的，每200mL所述的抗褪色剂的储备液通过包含如下步骤的方法制备得到:将2g对苯二胺、0.8g氯化钠、3.2g磷酸氢二钠、0.25g Tris、4g甘氨酸溶于80mL去离子水中，用0.1M的盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，加入10mL甘油，最后用去离子水定容至200mLo
[0009]所述的抗褪色剂的工作液为将储备液用无菌针头滤器过滤除菌再用无菌水稀释后得到，工作液现配现用。优选的，将储备液稀释10倍得到工作液。
[0010]上述抗褪色剂可用于荧光显微镜细菌计数中，能够降低了背景荧光，获得了良好观察效果。
[0011]一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法，包括如下步骤:往水样中加入荧光染料进行染色，再加入上述抗褪色剂工作液进行抗褪色处理，将抗褪色处理的样品经醋酸纤维滤膜抽滤后在荧光显微镜下观察。
[0012]优选的，所述的检测水体细菌数量的荧光显微计数方法，包括如下步骤:
(I)样品染色:取ImL水样到5mL的离心管中，加入100 μ L用无菌去离子水稀释的SYBR Green I荧光染料，常温避光染色5min。
[0013](2)抗褪色处理:向步骤(I)染色好的样品中加入其3倍体积的抗褪色剂工作液，混匀后避光静置5min。
[0014](3)荧光显微计数:将步骤(2)经抗褪色处理的样品利用真空抽滤装置进行过滤，所用滤膜为普通醋酸纤维滤膜，孔径0.22 μ m。过滤完毕后，将滤膜取出放置到洁净的载玻片上，使附有细菌的一面朝上，然后在滤膜上滴加一滴抗褪色剂工作液，覆上盖玻片，置荧光显微镜载物台上，以480nm光波激发，40倍物镜下观察，随机计数10个视野中细菌颗粒的数量，并计算平均数。最后按公式Y=AB/C计算出ImL样品中细菌的数量，其中Y表示ImL样品中细菌的数量，A表示一个视野中细菌的平均数，B表示滤膜截留面积，C表示每个视野的面积。
[0015]本发明的主要优点是:
(I)本发明改变了抗褪色处理方法，降低了背景荧光，获得了良好观察效果。
[0016](2)本发明无需繁琐的有机滤膜前处理工作，提高了检测效率。
[0017](3)本发明在检测过程中无需使用昂贵的无机滤膜，降低了检测成本。
【附图说明】
[0018]图1是本发明方法与氧化铝滤膜法计数大肠杆菌DH5 α的比较结果图。
[0019]图2是染色后的水样通过40倍物镜观察的效果图。
[0020]图3是本发明方法获得的武汉市东湖4个子湖水样细菌总数结果图。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。
[0022]实施例1抗褪色剂储备液和抗褪色剂工作液的制备
(I)抗褪色剂储备液的制备
将2g对苯二胺、(λ 8g氯化钠、3.2g磷酸氢二钠、(λ 25g Tris、4g甘氨酸溶于80mL去离子水中，用0.1M的盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，加入10mL甘油，最后用去离子水定容到200mL,制成抗褪色剂储备液。抗褪色剂储备液避光4°C保存，有效期3个月。
[0023](2)抗褪色剂工作液的制备
取ImL抗褪色剂储备液，无菌针头滤器过滤除菌，再用无菌水稀释至10mL，制成抗褪色剂工作液。抗褪色剂工作液现配现用。
[0024]实施例2大肠杆菌培养物计数
用牛肉膏-蛋白胨液体培养基