一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用。

背景技术：

动植物和微生物中含有糖醛酸的糖分子种类较多，如动物体内的糖胺聚糖(肝素、乙酰肝素、硫酸软骨素abcde、硫酸角质素等)、陆生植物中的果胶、海洋藻类中的褐藻胶、褐藻糖胶及其低聚物和衍生物等，这些酸性多糖具有多种生物学活性。如肝素和低分子肝素具有抗凝和抗血栓活性，硫酸软骨素具有抗神经炎和降血脂活性，柑橘果胶具有抑制肿瘤转移的功能，以褐藻胶为原料开发的海洋糖类药物藻酸双酯钠、甘糖酯等具有抗脑血栓、脑缺血及高血压、高脂血症、冠心病、心绞痛等疾病。以岩藻聚糖硫酸酯为原料开发的海昆肾喜胶囊具有抗慢性肾功能衰竭症等，这些糖药物分子中均含有丰富的羧基。然而糖类化合物尤其是多糖由于结构复杂，没有特定的紫外吸收光谱，使得微量检测困难，进而限制了其体内药代动力学研究并成为糖药物开发的瓶颈。传统的糖类药物代谢动力学研究方法有同位素标记法、免疫学法、色谱分析法等，由于过程繁琐，灵敏度低，结果重复性差而受到限制。

荧光标记及活体成像检测技术由于灵敏度高，检测结果直观，已广泛用于生命科学研究及药物开发中。研究表明，cy7可对姜黄素进行荧光标记，并利用活体成像技术对姜黄素在小鼠体内分布情况进行实时检测，表明该技术可对姜黄素在小鼠体内代谢进行研究(孙永等，南京中医药大学学报，2011，27(6):539-541)。但是，对于糖类化合物特别是含有糖醛酸的糖分子是否能采用类似技术进行荧光标记，并研究其在活体内的药代动力学特点及组织和器官分布尚无专利或文献报道。

技术实现要素：

针对含糖醛酸类糖分子体内代谢和组织器官分布研究方法不灵敏的问题，本发明提供了一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用，本发明能弥补现有技术存在的不足之处。本发明所提供的荧光标记及纯化方法简单，效率高，荧光信号强，检测灵敏度高，结果重现性和可视性好，尤其是对于未知结构的糖分子药代动力学研究具有明显的优势。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子，所述荧光标记的含糖醛酸的糖分子经过如下标记过程获得：

其中，所述r为含有羧基的多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，所述荧光分子为具有氨基的花青染料cy3、cy5和cy7中的至少一种。

本发明还提供了所述的荧光标记的含糖醛酸的糖分子的制备方法，它包括以下步骤：(1)羧基活化：将含糖醛酸的糖分子溶解在2-吗啉乙烷磺酸缓冲液中，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，混合均匀形成反应体系，搅拌反应，反应结束后用透析袋透析或凝胶色谱柱纯化，透析液或糖分子洗脱组分减压浓缩后冷冻干燥得活化的糖分子；

(2)荧光标记：将步骤(1)活化的糖分子溶解在磷酸盐缓冲液中，加入含有-nh2的荧光分子，形成总反应溶液，搅拌反应2～24h，浓缩，将浓缩液转移至透析袋中透析脱盐，透析内液减压浓缩，干燥后得荧光标记的含糖醛酸的糖分子。

进一步的：所述步骤(1)中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的摩尔浓度均为糖分子中羧基占反应体系的摩尔浓度的2～20倍，反应时间为2～24h。

进一步的：所述步骤(2)中加入的荧光分子在总反应溶液的最终摩尔浓度为羧基占反应体系的摩尔浓度的0.1～10倍。

进一步的：将步骤(2)所述荧光标记的含糖醛酸的糖分子进行如下纯化步骤：将荧光标记的含糖醛酸的糖分子用凝胶色谱柱纯化，采用示差检测器和荧光检测器联用检测，收集示差检测器和荧光检测器重合信号峰；

或将步骤(2)所得荧光标记的糖分子经透析袋透析，检测透析外液电导率不再变化，糖分子组分经减压浓缩后冷冻干燥得荧光标记的糖分子。

进一步的：所述凝胶色谱柱填料为sephadexg-10、sephadexg-15、sephadexg-25或biogelp2、p4或p6。

进一步的：所述步骤透析袋的截留分子量为1kda～10kda。

本发明还提供了所述的荧光标记的含糖醛酸的糖分子在制备用于检测糖分子在体内代谢的检测剂中的应用。

本发明还提供了所述的荧光标记的含糖醛酸的糖分子在制备用于检测糖分子在组织器官中分布的检测剂中的应用。

进一步的：所述荧光标记的含糖醛酸的糖分子的检测时间为0.01～24h。

与现有技术相比，本发明的优点及积极效果是：本发明提供的含糖醛酸类糖分子的荧光标记技术操作简单，适用于任一含有糖醛酸的多糖、低聚糖、寡糖及其衍生物分子，具有普遍实用性，且标记产物纯度高，标记后保持分子原型。本发明制备的荧光标记糖分子经动物活体成像技术检测在动物体内的组织及器官分布证实具有荧光信号强，检测灵敏度高，可视性强等优点，为含糖醛酸类糖药物活体代谢研究提供了新的方法，具有广阔的应用前景。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其它优点和特点将变得更加清晰。

附图说明

图1为本发明荧光标记糖分子在小鼠体内不同时间组织器官分布图。

图2为本发明荧光标记糖分子在不同器官分布检测图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明。

本发明采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)对糖分子的羧基进行活化，再与含有氨基的荧光分子缩合，获得荧光标记糖分子，具体标记过程如下所示：

其中，所述r为含有糖醛酸的多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，所述荧光分子为具有氨基的花青染料cy3、cy5和cy7中的至少一种。

实施例1：含糖醛酸类糖分子的荧光标记

1、将50mg岩藻聚糖硫酸酯溶解在1ml0.1mol/lph＝5.0的2-吗啉乙烷磺酸(mes)缓冲液中，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，混合均匀形成反应体系，使edc和nhs的摩尔浓度分别均为岩藻聚糖硫酸酯分子中羧基摩尔浓度的5倍，搅拌反应12h，反应结束用7kda的透析袋透析脱盐，透析内液经浓缩后冷冻干燥得nhs活化的糖分子。

2、取步骤1中经nhs活化的岩藻聚糖硫酸酯适量，加入1ml0.1mol/lph＝7.2的磷酸盐缓冲液溶解，再加入含有氨基的荧光分子cy7，搅拌反应12h，利用糖分子中经过活化的羧基与荧光试剂的氨基发生缩合反应对糖分子进行荧光标记，浓缩，将浓缩液转移至7kda透析袋中透析脱盐，透析内液减压浓缩，干燥后得荧光标记的岩藻聚糖硫酸酯。

3、取步骤1所述岩藻聚糖硫酸酯，以及步骤2所述荧光标记的岩藻聚糖硫酸酯进行分子量分析，色谱柱为ohpaksb-802.5hq与ohpaksb-804hq凝胶色谱柱串联，以0.1mol/l硫酸钠水溶液为流动相，采用示差检测器-多角激光散射仪联用在线检测，计算岩藻聚糖硫酸酯标记过程中的重均分子量和数均分子量。

本实施例所述的含有氨基的荧光分子cy7可改用具有氨基的荧光分子cy3、cy5或其它可用于动物活体成像检测的荧光试剂；所述纯化用透析袋的截留分子量可改用1kda～10kda的任意一种；所述分子量测定用的凝胶色谱柱可改用ohpaksb-802hq、ohpaksb-806hq、tsk-gelg3000pw/g3000pwxl或splaquagel-ohmixed中的一种或两种串联。

本发明将糖醛酸类糖分子的羧基基团通过nhs活化，进一步与荧光试剂分子中的氨基发生缩合反应，从而将荧光分子引入糖分子而实现糖分子的荧光标记，由于反应产物水溶性强，可以通过透析或凝胶柱层析纯化，反应效率高，操作简单。

实施例2：荧光标记的含糖醛酸的糖分子在检测糖分子的代谢动力学和组织及器官分布中的应用

1、将荧光标记的糖分子用生理盐水配制为5mg/ml水溶液，生理盐水作为空白对照组，按照0.1ml/10g体重剂量裸鼠尾静脉注射。

2、在步骤1注射后分别于0、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、2.5h和3h麻醉实验裸鼠，使用小动物活体成像系统对各实验组受试药在小鼠体内的组织分布情况进行观察，分别拍照记录裸鼠腹部和背部不同时间的荧光信号。

3、活体成像观察结束后将各组实验裸鼠处死后解剖，分别取脑、心脏、肺脏、肝脏和肾脏采用活体成像系统观察拍照，记录不同器官荧光信号。

本发明中荧光标记糖分子不同时间在实验鼠体内分布情况如图1所示，从图1可以看出标记的糖分子静脉注射进入小鼠体内后，15min～3h内均可以检测到荧光信号，且随着时间的延长，信号逐渐向肾脏聚集，呈现肾排泄的特征。同时发现标记糖分子在3h以内，糖分子与荧光分子未发生脱离，表明该荧光标记方法适合代谢过程中药物分子的示踪检测。本发明标记糖分子在各器官的荧光信号分布检测结果如图2所示。从图2结果可进一步说明标记糖分子3h以后主要集中于肾脏部位。根据需要，标记糖分子的代谢和组织器官分布情况可以连续检测24小时。

综上，本发明所述方法通过对糖分子的羧基进行活化，再与荧光分子中的氨基发生缩合反应，并通过透析及凝胶柱层析纯化，实现了对含糖醛酸的糖分子的快速荧光标记，利用动物活体成像技术实现了标记糖分子在动物体内的药代动力学特征及组织和器官分布分析。

本发明建立的荧光标记方法适用于任何含有糖醛酸的糖分子，具有普适性强，灵敏度高，结果直观可靠等特点，应用前景广阔。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例中所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。