一种基于时间分辨荧光标记‑适配体识别检测玉米赤霉烯酮的方法与流程

本发明涉及利用磁性纳米材料和时间分辨荧光纳米材料结合核酸适配体识别对玉米赤霉烯酮进行检测,特点在于利用玉米赤霉烯酮适配体功能化的磁性纳米材料对玉米小麦等样品中玉米赤霉烯酮分离富集,使得检测方便快捷，同时利用时间分辨荧光纳米材料作为标记物通过检测时间分辨荧光信号进一步提高检测的灵敏度,该方法属于纳米材料与分子生物技术领域。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，又称f-2毒素，是主要由禾谷镰刀菌等镰刀菌产生的一种非甾体雌激素样作用真菌毒素。该毒素的化学名称为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)-β-雷锁酸，分子式：c18h22o5，相对分子质量318.4，难溶于水，易溶于碱性水溶液和醇类，其甲醇溶液在紫外光下呈绿-蓝荧光。zen广泛存在于谷物中，主要污染玉米、大麦、小麦、燕麦、高粱和大米等作物，在面粉、麦芽、啤酒及奶制品、肉制品等产品中也有一定程度的分布。zen对人类及动物的健康造成严重威胁，危害仅次于黄曲霉毒素。zen对动物具有较强的生殖发育毒性和免疫毒性，可引起动物雌激素亢进症，导致不孕不育、胎儿畸形和生长发育不良，特别对猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来巨大的经济损失。当人类食用被污染的作物或肉、蛋奶等制品后，zen进入人体主要危害表现为生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性、肝肾毒性，致肿瘤(子宫瘤、乳腺癌、睾丸癌)毒性。

目前，zen检测方法主要有薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、高效液相质谱联用法(hplc-ms/ms)及基于抗原-抗体免疫识别建立的免疫法等。薄层层析法操作步骤较繁琐，灵敏度及特异性低，已不能满足现代检测的需要。而常用的色谱分析法，样品前处理方法复杂、繁琐，且需要熟练掌握仪器操作技术，不便基层推广。免疫法检测zen虽具有灵敏度高、特异性强等优点，但是小分子抗原zen的制备过程繁琐耗时、成本昂贵，不同批次间抗体存在差异性，储存及使用条件严苛，导致假阳性率高、重复性差。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的检测方法很有必要。

核酸适配体(aptamer)是从体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇小分子dna或rna片段。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相较，核算适配体有诸多优点，比如体外合成周期短，制备成本低，无需动物实验；稳定性好，对温度不敏感；易于修饰等等，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中得到广泛应用。

时间分辨荧光是一种特殊的荧光现象，是利用物质的荧光寿命长短进行时间分辨，即采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度-时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱，用于对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分实现分辨，并可分别进行测定；通过设置合理的延迟时间(delaytime)和门控时间(gatetime，也称检测时间)消除了检测环境中杂质自发荧光和背景荧光对信噪比的干扰，从而提高分析方法灵敏度。时间分辨荧光分析技术发展的关键在于镧系元素荧光探针和分析模式的有效开发和结合利用。随着纳米技术的蓬勃发展，具有良好水分散性的镧系纳米材料作为一类新型发光标记物，其固有的时间分辨光学特性逐渐被开发并利用起来。镧系掺杂纳米材料本身具有诸多优越的理化特性，比如水分散性好、荧光寿命长、耐光漂白、斯托克斯位移宽、生物兼容性好、细胞毒性低、多色可调控(掺杂元素种类和比例)，有利于生物体系中多组分同时检测。鉴于上述优点，新型镧系掺杂的荧光纳米材料具备了良好的时间分辨荧光分析应用前景。磁性纳米材料的物理长度恰好处于纳米量级且具有制备方法简单、原料低廉、独特的超顺磁性、表面易于修饰、生物相容性好等特点，使得其在生物医学领域具有广阔的应用前景。

本发明首先合成得到了表面生物功能化的磁性纳米材料和时间分辨荧光纳米材料,再通过磁性纳米材料结合的目标核酸适配体和时间分辨荧光纳米材料结合的核酸适配体互补链之间的杂交将两者组装构成复合纳米结构,以紫外光进行激发，诱导时间分辨荧光为检测信号,通过对不同浓度玉米赤霉烯酮标准品的检测,建立标准曲线,达到对含玉米赤霉烯酮样品进行定量检测的目的。该发明可以用于玉米、小麦、谷物、饲料及其制品等样品中玉米赤霉烯酮含量的检测。

技术实现要素：

一种时间分辨荧光标记-适配体识别检测玉米赤霉烯酮的方法：分别制备得到氨基化的fe3o4磁性纳米材料和时间分辨荧光纳米材料nayf4:ce/tb,对磁性纳米材料和时间荧光分辨纳米材料进行表面亲和素(avidin)修饰，随后通过亲和素(avidin)与生物素(biotin)之间的作用与生物素(biotin)修饰的适配体dna和适配体互补链(cdna)特异性结合分别构成荧光探针和捕获探针。将两者经过一段时间的孵育,通过互补杂交使得两者组装成复合纳米材料。利用外界磁场对纳米材料进行分离并且利用紫外光(273nm)激发,记录此时荧光信号强度为最大值，当加入目标分析物玉米赤霉烯酮时,适配体的空间构象发生变化,与玉米赤霉烯酮发生特异性结合,使得适配体dna与互补单链(cdna)解链,从而导致时间分辨荧光纳米材料与磁性纳米颗粒分离,此时再富集后检测,得到荧光信号强度减小。在一定范围内玉米赤霉烯酮的含量与荧光信号强度减小的数值相关,基于此对玉米赤霉烯酮标准品进行检测,建立标准曲线,以达到对实际样品中玉米赤霉烯酮进行定量检测的目的；步骤为：

1、采用一步溶剂热法合成nayf4:ce/tb并对其做表面修饰

称取1mmol的磷酸乙醇胺(aep)和1mmol的nacl溶于30ml乙二醇中并不断搅拌，随后加入0.9mmoly(no3)3·6h2o、0.05mmolce(no3)3·6h2o、0.05mmoltb(no3)3·6h2o。然后，将含有4mmolnh4f的10ml乙二醇溶液(45℃水浴搅拌充分溶解)逐滴加入上述透明溶液中，于室温下继续搅拌30min后转移至50ml铁氟龙高压反应釜内，195℃反应4h。反应后，取出冷却至室温，以乙醇、超纯水交替洗涤三次，溶于超纯水中于4℃冰箱保存备用。

2、制备氨基化fe3o4磁性纳米颗粒

称取2.0g无水醋酸钠和1.0g六水合三氯化铁加入30ml乙二醇，将6.5g温浴的1,6-己二胺加入前者的混合液中，加热至50℃，并不断搅拌形成酒红色透亮的均质胶体溶液。将该溶液转移至100ml反应釜中，198℃高温反应6h。反应完成后取出反应釜自然冷却至室温全部倒入烧杯(分批冲洗转移残留粉末)，然后利用磁铁分离收集，弃去上层混合液体，将磁分离获得的黑色粉末用超纯水，超声分散，然后磁分离弃去溶液，收集粉末。采用超纯水和无水乙醇轮流洗涤三次，所得黑色粉末在50℃下干燥12h，取出研钵研磨至细粉末，储存备用。

3、利用戊二醛方法将时间分辨荧光纳米材料和磁性纳米材料与亲和素(avidin)进行偶联

由于时间分辨荧光纳米材料和磁性纳米材料表面含有氨基基团，因此可以通过戊二醛法将亲和素共价结合到材料表面。将时间荧光分辨纳米材料和磁性纳米材料用10mm磷酸盐缓冲液(pbs)重悬，制成1mg/ml溶液，超声15min使其充分分散于缓冲液中。将材料与5％的戊二醛在室温下避光轻微震荡活化2h，时间分辨荧光纳米材料用离心的方法去除未反应的戊二醛，磁性材料通过外加磁场去除未反应的戊二醛，接着用pbs清洗三次，然后加入亲和素(1mg/ml)37℃震荡过夜。反应结束后清洗数次，弃上清。

4、亲和素修饰的磁性纳米材料和时间分辨荧光纳米材料分别与适配体和适配体互补链进行偶联

利用通过亲和素(avidin)与生物素(biotin)之间的特异性结合将表面修饰亲和素(avidin)的磁性纳米材料和时间分辨荧光纳米材料与生物素(biotin)修饰的玉米赤霉烯酮适配体dna单链和适配体互补链cdna连接。具体方法为：将5mg亲和素修饰的磁性纳米材料和时间分辨荧光纳米材料分散于5ml(10mm)磷酸盐缓冲液中，分别加入一定量的生物素化的玉米赤霉烯酮适配体和适配体互补链，在37℃摇床中孵育12h，离心收集材料，用磷酸盐缓冲液清洗三次，分散于磷酸盐缓冲液中。

5、玉米赤霉烯酮适配体dna单链和适配体互补链cdna杂交

将时间分辨荧光纳米颗粒与磁性纳米材料连接起来构成一个纳米复合物，具体实施方法：取400μl时间分辨荧光纳米材料标记的互补dna单链溶液，与100μl适配体功能化磁性纳米材料混合，在磷酸缓冲液体系中37℃反应1h，之后在外加磁场作用1min，收集组装好的纳米材料复合物，并用磷酸盐缓冲液清洗3次。

6、玉米赤霉烯酮标准品进行检测，建立标准曲线

将组装好的纳米材料复合物溶解在的磷酸盐缓冲液中,配制不同浓度的玉米赤霉烯酮加入复合物体系中，于37℃条件下孵育40min，再经过磁分离弃上清,清洗三遍以保证解离脱落的时间分辨荧光纳米材料不在磁性纳米材料表面附着,从而保证检测的灵敏度和准确性，最后将富集到的混合物重悬到200μl的磷酸盐缓冲液中进行上机检测。采用酶标仪synergyh1,biotek在时间分辨荧光模式下，设定激发波长为273nm，延迟时间为100μs，检测时间为1000μs，在544nm处有时间分辨荧光信号,用于检测玉米赤霉烯酮。随着玉米赤霉烯酮浓度的增加，时间分辨荧光信号逐步减小。根据荧光值与对应的玉米赤霉烯酮标准品浓度建立标准曲线，实验结果在0.001～10ng/ml区间内得到良好的线性关系。

7、对玉米赤霉烯酮样品进行检测

对样品做简单的处理，随后直接加入到上述纳米复合体系中，37℃条件下孵育40min，采用酶标仪时间分辨荧光模式下，273nm下激发得到544nm处的荧光信号，从标准曲线中求得对应的玉米赤霉烯酮的浓度。

本发明的优点：

1、利用镧系掺杂纳米材料荧光寿命长的特点，通过时间分辨使得检测背景的荧光衰减，从而大大的提高了检测的灵敏度。

2、利用适配体对检测物质的特异性结合，有效的提高了检测的准确性和稳定性。

3、利用磁性纳米材料作为捕获探针，将目标检测物进行富集，可以有效缩短检测周期，操作简单。

附图说明

图1是基于时间分辨荧光标记-适配体识别检测玉米赤霉烯酮的原理图

图2是时间分辨荧光强度随玉米赤霉烯酮浓度变化叠加图(a)；玉米赤霉烯酮检测标准曲线图(b)。

具体实施方式：

本发明包括但不限于以下实施例，凡在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者拒不改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

实施例1：玉米实际样品中玉米赤霉烯酮的检测及加标回收

样品预处理：玉米高速粉碎过筛，称取5g于100ml烧瓶中，加入5gnacl，甲醇(7:3)水溶液，充分混匀后置于均质器中高速搅拌提取2min，静止片刻，过滤，取10ml滤液置于50ml烧瓶中，再次在均质器中高速搅拌提取2min，静止后用超细玻璃纤维过滤纸过滤，直至滤液澄清，收集滤液备用。分别选取0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10ng/ml浓度的玉米赤霉烯酮标准品添加到待测物中，同样利用本发明方法再次检测其中玉米赤霉烯酮的含量，得到检测值。回收率％＝(检测值-本底值)/添加量×100％。从表一的结果来看，回收率在80.76～122.36％，说明本发明稳定，灵敏，准确，适合用于玉米实际样品中玉米赤霉烯酮的检测。

表一：玉米实际样品中玉米赤霉烯酮的检测和加标回收率

实施例2：小麦实际样品中玉米赤霉烯酮的检测及加标回收

样品预处理同实例1。分别选取0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10ng/ml浓度的玉米赤霉烯酮标准品添加到待测物中，同样利用本发明方法再次检测其中玉米赤霉烯酮的含量，得到检测值。回收率％＝(检测值-本底值)/添加量×100％。从表二的结果来看，回收率在90.04～114.75％，说明本发明同样适合用于小麦实际样品中玉米赤霉烯酮的检测。

表二：小麦实际样品中玉米赤霉烯酮的检测和加标回收率