一种固定化的荧光标记细胞色素c、其制备方法及用途与流程

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种荧光标记的细胞色素c的固定化方法，以及所述固定化的荧光标记细胞色素c在生物样品检测中的用途。

背景技术：

一氧化氮(no)是具有多种生物活性的信使分子和效应分子，对心脑血管系统、消化系统、神经系统都具有重要的调节作用，近来研究表明no还能发挥非特异性宿主防御作用，介导组织损伤、细胞凋亡等病理过程，进而引起炎症反应和自身免疫性皮肤病。no虽然结构简单，但在有氧环境下极不稳定，检测难度大，因而相关分析方法的研究极大的关注，cn105153214提供了一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针、cn103923641提供了一种检测线粒体中一氧化氮的荧光探针。

细胞色素c是一种定位于线粒体内外膜间隙的血红素蛋白，广泛存在于各种含线粒体呼吸链的生物体中。细胞色素c含有c型血红素，能够与no通过配位反应完成各种生理功能。早期的研究表明细胞色素c能够直接与no结合与解离。

目前，发明人前期针对细胞色素c与no反应机制的研究发现no进入溶液以no形式存在，使cytc周围的微环境发生变化，进入到heme腔中改变其电子分布，增大了met80与heme之间的距离，使其相互作用减弱，met与heme之间的配位键改变，分子间发生重排，其中心fe与no形成新配位键，但所形成的fe-n键不稳定，当no量较少时，随时间变化又会断裂，再次生成五配位fe，可以与溶液中的自由基团结合，最终达到一个平衡，当不断通入no时，所形成的配位键不再发生断裂，破坏了其达到的平衡。

在对上述结合机制进行深入研究的基础上进一步发现，由于cytc与no的配位反应伴随着空间构象的改变、配位键的形成，因此在不破坏细胞色素c结构和与no结合活性的基础上，用荧光标记细胞色素c将能够用于检测细胞色素c与no结合过程中的能量转移。

目前，国内外还没有利用固定化荧光标记的细胞色素c来检测一氧化氮的方法和产品。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种固定化的荧光标记细胞色素c，通过细胞色素c与no的配位反应，引起细胞色素c构象的改变和能量的迁移，进而导致荧光光密度的改变，从而实现no的检测。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供一种荧光标记细胞色素c的固定化方法，包括以下步骤：

(1)从微生物中提取纯化细胞色素c；

(2)将细胞色素c与荧光素反应制备荧光标记的细胞色素c，除去游离荧光素；

(3)用异丙醇铝制备铝胶母液；

(4)将步骤(2)和(3)的产物混匀，涂布固相载体。

其中，所述细胞色素c来自光合细菌。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，所述细胞色素c包含的氨基酸序列如seqidno:1所示。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(1)具体为：将菌体冻融后，超声破碎，上清液过离子交换色谱，洗脱液再过分子筛层析，获得电泳纯的细菌源细胞色素c。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(2)具体为：将1mg细胞色素c溶解于nahco3溶液中，加入5μl20mm的荧光素琥珀酰亚胺酯，混匀，4℃反应2h，0.01m的ph7.4磷酸盐缓冲液透析，除去未结合的游离荧光素二乙酸酯。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(3)具体为：取2g异丙醇铝，加入44ml沸水中，80℃搅拌45min，加入1.2ml1m的hcl，煮沸1h，冷却至4℃。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(4)具体为：取等量的步骤(2)和(3)的产物混匀，4℃反应1h，均匀涂覆于固相载体表面。

本发明第二个目的是：提供通过所述荧光标记细胞色素c的固定化方法制备的固定化荧光标记细胞色素c。

本发明第三个目的是：提供上述荧光标记细胞色素c的固定化方法在制备检测生物样品中no的检测试剂中的用途。

本发明第四个目的是：提供上述荧光标记细胞色素c的固定化方法在制备检测生物样品中no的检测装置中的用途。

本发明所述检测生物样品中no的检测装置为细胞色素c珠、细胞色素c片、细胞色素c容器或细胞色素c传感器。

所述的细胞色素c珠是表面涂覆有细胞色素c的透明球状固体、细胞色素c片是表面涂覆有细胞色素c的透明片状固体、细胞色素c容器是内表面涂覆有细胞色素c的透明容器、细胞色素c传感器是指感应部件上涂覆有所述细胞色素c。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明首次公开了一种固定化荧光标记的细胞色素c。其能够立即响应溶液中的no使得荧光光密度值瞬间大幅度改变，从而能够快速、灵敏的检测生物样本、细胞培养液、发酵液等液体环境中易被氧化而瞬间消失的no。本发明所述固定化荧光标记细胞色素c对溶液中no的响应速度约为0.4s，no的检测限约为10μm。

(2)荧光标记方法简单并且避免了对细胞色素c空间结构和功能的影响。本发明采用荧光素二乙酸酯标记法，通过双功能基团将荧光素标记于细胞色素c蛋白质支链的伯氨基上，不影响以铁卟啉为活性中心的no结合位点的功能。

(3)本发明所述固定化荧光标记的细胞色素c应用范围广，可以固定于荧光光度计的样品杯透光避内部，也可以固定于透明载体上，可重复多次使用。尤其适用于体外培养的血管内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞的检测，具有较好的经济价值。

附图说明

图1为纯化的沼泽红假单胞菌atcc:17001细胞色素c电泳图。泳道1是纯化的细胞色素c，泳道2是蛋白marker，由上到下依次为95、77、55、43、34、26、17kda，所述纯化的蛋白位于约55-77kda之间。

图2为不同溶液中，固定化荧光标记细胞色素c在510-590nm激发光下产生的的荧光光密度值。粗线为荧光标记的细胞色素玻璃珠在超声除气的磷酸盐缓冲溶液中的荧光光密度值；细线为荧光标记的细胞色素玻璃珠在no饱和的磷酸盐缓冲溶液中的荧光光密度值。横轴为波长nm，纵轴为荧光光密度值a.u.

图3为固定化荧光标记的细胞色素c在535nm的荧光光密度值，横轴为时间sec，纵轴为荧光光密度值a.u.。第3.5秒的位置“1”，向检测溶液中加入no饱和的缓冲液；第14.5秒的位置“2”，向检测溶液中再加入超声除气的缓冲液进行稀释。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：光合菌细胞色素c的分离纯化和鉴定

从沼泽红假单胞菌atcc:17001中分离提取细胞色素c。将沼泽红假单胞菌发酵液离心，收集菌体以发酵液体积1/100量的tris-hcl(0.1m，ph7.4)缓冲液重悬，置-20℃冷冻过夜，室温融解后，4℃超声破碎10min，15000g冷冻离心20min，取上清液。

用tris-hcl(0.01m，ph7.4)缓冲液平衡deae纤维素层析柱，将上样后先以10倍柱体积tris-hcl(0.01m，ph7.4)缓冲液漂洗，再用低离子强度nacl溶液(0.02m)洗涤至无蛋白成分流出，最后加入高离子强度的nacl(0.2m)，收集并合并洗脱液，并进行浓缩。

将浓缩液上样至sephadexg-100分子筛柱，用tris-hcl(0.01m，ph7.4)缓冲液洗脱，分部收集、合并呈铁红色的级分，浓缩、蛋白定量，取样进行sds-page电泳鉴定纯度和大小(参见图1)。

实施例2：细胞色素c的荧光标记

将细胞色素c用0.1mnahco3溶液稀释至500μg/ml，将六氯荧光素琥珀酸亚胺酯用dmso溶解至20mm，取5μl加入上述细胞色素c溶液中，混匀室温反应1h，以0.1mph7.4的tris-hcl缓冲液透析，直至透析液中不含荧光物质。

实施例3：荧光标记细胞色素c的固定化

取2g异丙醇铝，加入44ml沸水中，80℃搅拌45min，加入1.2ml1m的hcl，煮沸1h，冷却至4℃，制备得铝胶母液。

将荧光标记的细胞色素c与铝胶母液按体积比1:1混合，充分混匀4℃静置反应1h，均匀铺布于玻璃珠上，置4℃冰箱中过夜保存备用。

实施例4：固定化荧光标记细胞色素c的荧光检测

将实施例3制备的固定有荧光标记细胞色素c的玻璃珠分别加入超声除气的磷酸盐缓冲溶液(0.01mph7.4)、以及充入no饱和的磷酸盐缓冲溶液中，用荧光光度计检测不同波长的激发光下产生的荧光光子的量(参见图2)。固定化荧光标记细胞色素c在no饱和缓冲液中相对于超声除气缓冲液中，荧光光密度值显著降低。

该实验结果表明与超声除气的磷酸缓冲液相比，在no饱和的磷酸盐缓冲溶液中荧光标记细胞色素c产生荧光的能力下降。本发明所述固定化荧光标记的细胞色素在530-540nm激发光下产生的荧光光子数量较高，波长超过550nm时，荧光光密度值显著下降，并且两种溶液中光密度差值最大的波长区间也大约位于530-540nm之间。选择535nm作为荧光光密度检测的最佳参数。

实施例5：固定化荧光标记细胞色素c对溶液中no的响应

将实施例3制备的固定有荧光标记细胞色素c的玻璃珠加入分别加入超声除气的磷酸盐缓冲溶液(0.01mph7.4)中，检测荧光光密度值。先加入等体积no饱和的磷酸盐缓冲溶液立即混匀，检测荧光光密度值的变化；再加入等体积超声除气的磷酸盐缓冲液稀释，检测荧光光密度值的变化，结果如图3所示。

图3表明，加入no饱和的磷酸盐缓冲溶液后，荧光光密度值立即断崖式下降，进一步加入超声除气的磷酸盐缓冲液后，荧光光密度值又大幅度回升。

上述结果证实：

(1)本发明所述固定化荧光标记细胞色素c对溶液中no的响应速度快、荧光光密度信号变化大，能快速灵敏的检测no的含量。

(2)本发明所述固定化荧光标记细胞色素c响应于no产生的能量转移和构像改变是可逆的，能够重复使用。

实施例6：固定化荧光标记细胞色素c用于体外培养的巨噬细胞产no的检测

体外培养巨噬细胞，向周龄balb/c小鼠腹腔内注射5ml生理盐水，揉捏腹腔，抽出腹腔液1500rpm离心3min，细胞沉淀置于1640完全培养基(含20％fbs)中，37℃培养，隔日换液。

将体外培养的巨噬细胞均分为两组，实验组向细胞培养液中添加终浓度1000u/ml的ifn、10μg/ml的lps、10μg/ml的sps、60μg/ml的ltn以及200μg/mlpaa，以刺激巨噬细胞产生no；对照组不加药物。

荧光光密度结果表明实验组荧光光密度值约为235a.u.，而对照组荧光光密度值约为280a.u.。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。