线粒体耳聋T12201C突变的荧光定量PCR检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种线粒体耳聋t12201c突变的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用。

背景技术：

耳聋是全球关注的公共卫生问题，由遗传和环境因素共同作用引起，其中超过50％的耳聋患者由遗传因素导致。在遗传性耳聋中，30％为综合征耳聋，70％为非综合征耳聋。耳聋的遗传方式可表现常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、x连锁遗传和母系遗传，线粒体dna(mtdna)突变是母系遗传性耳聋发生的重要原因之一，在遗传性耳聋中的发病率约为1％～2％。

耳聋相关的mtdnatrna基因突变共涉及16种trna，t12201c突变位于其中的trna^his上。该突变首先发现于中国的一个非综合征耳聋大家系中，所有患者表现为迟发性感音神经性耳聋，双侧对称，进行性加重。焦磷酸测序显示，该家系母系成员的t12201c突变呈高度异质性，且异质性水平与非综合征耳聋的严重程度和发病年龄存在相关性。t12201c突变的主要致聋机制为，突变破坏了trna^his受体臂上高度保守的5a-68u碱基配对，从而改变了trna^his的构象，降低了其稳态水平。在携带t12201c突变的细胞中，线粒体dna编码的多肽合成、线粒体氧化磷酸化产生的atp均出现不同程度的下降。由t12201c突变引起的trna^his代谢紊乱，造成线粒体翻译缺陷，严重影响了线粒体呼吸和氧化磷酸化产能。

目前，mtdna突变的常见检测方法主要有直接测序法、微阵列芯片法、pcr-rflp法、荧光定量pcr法等。直接测序法的优点是准确性高，但检测周期较长，且需要专业的测序仪和结果判读人员，不适合临床推广应用。微阵列芯片法具有高通量的优点，但存在检测成本高、操作繁琐、易交叉污染等缺点，不适用于大样本筛查的需求。pcr-rflp法由于在pcr扩增结束后需开盖进行后续的酶切和电泳，同样存在操作繁琐、容易污染等问题。荧光定量pcr技术近年来在分子生物学领域的应用越来越广泛，其基本原理是利用taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通pcr基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团(r)和淬灭基团(q)；探针保持完整时r基团的荧光信号被q基团抑制，一旦探针被切断，q基团的抑制作用消失，r基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对pcr过程中产物量的实时监测，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对pcr产物的后处理，避免了交叉污染。而且，随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料(fam、hex、rox等)及多通道荧光定量pcr仪，可以实现基因分型、基因突变检测、snp分析等研究。

针对荧光定量pcr传统taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，美国abi公司于2000年推出一种新的taqman探针——mgb探针，其3’端采用非荧光性的淬灭基团，在吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，mgb探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可极大提高探针与模板杂交的稳定性，使较短的探针同样能达到较高的tm值。而短探针的主要优点在于荧光报告基团与淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高；同时，短探针也简化了设计和降低了成本。有实验表明mgb探针对于等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱基突变。

技术实现要素：

本发明提供一种线粒体耳聋常见突变t12201c的荧光定量pcr检测试剂盒，由定量pcr反应液、第一阳性对照品、第二阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量pcr反应液含有pcr缓冲液、mgcl2、dntps、耐热dna聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、第一荧光探针和第二荧光探针。

上游扩增引物序列为：5’-attgtgaatctgacaacagaggcttac-3’

下游扩增引物序列为：5’-catgagttagcagttcttgtgagctt-3’

第一荧光探针序列为：5’-fam-accccttacttaccg-mgb-3’

第二荧光探针序列为：5’-hex-accccttatttaccg-mgb-3’

第一阳性对照品为线粒体第12201位点为t碱基的dna样品，第二阳性对照品为线粒体第12201位点为c碱基的dna样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。

本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在相关性耳聋线粒体t12201c突变检测中的应用。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

⑴人外周血细胞mtdna的提取：严格按照美国bibvision公司商品化的线粒体dna提取试剂盒操作，从临床外周血标本中提取mtdna。

⑵pcr扩增检测：在双色(或以上)荧光定量pcr仪上进行，每个pcr反应体系总体积为25μl，其中包括20μlpcr反应液和5μl模板(提取的mtdna、阳性对照、阴性对照)。探针检测模式为：fam、hex通道分别用于检测12201位点的c碱基和t碱基。pcr反应条件：94℃5分钟预变性，94℃20秒→60℃60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。

⑶荧光定量结果报告：①检测样品c碱基探针ct值≤35且扩增曲线有明显对数增长期，同一反应体系中t碱基探针ct值大于c碱基探针ct值，且两者差值≥5，则该检测样品12201位点为c碱基；②检测样品t碱基探针ct值≤35且扩增曲线有明显对数增长期，同一反应体系中c碱基探针ct值大于t碱基探针ct值，且两者差值≥5，则该检测样品12201位点为t碱基；③当两探针ct值均大于35或两探针ct值的差值小于5时，需对样品重新进行mtdna提取和pcr检测。

本发明针对mtdna第12201位点的t>c单碱基突变设计两条mgb探针，开发该位点突变的荧光定量pcr检测试剂盒，旨在准确、快速、简便地检测mtdnat12201c突变，从而应用于该突变相关性耳聋的临床诊断、预防和治疗。本发明采用实时荧光定量pcr技术和双色荧光探针，开发研制了用于线粒体耳聋常见突变t12201c的检测试剂盒。该试剂盒能通过一步法检测mtdna第12201位点是否发生t>c突变，可满足临床准确、快速、简便地诊断该突变相关性耳聋的需要，同时为t12201c突变导致的线粒体耳聋的预防和治疗提供依据。

附图说明

图1为本发明试剂盒的结构示意图。

图2为第一阳性对照品检测结果12201位点为t的扩增曲线。

图3为第二阳性对照品检测结果12201位点为c碱基的扩增曲线。

具体实施方式

本发明结合实施例和附图作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。

实施例1

参见图1，本发明提供的线粒体耳聋t12201c突变的荧光定量pcr检测试剂盒，由定量pcr反应液1、第一阳性对照品2、第二阳性对照品3、阴性对照品4、说明书5和盒体6组成，其中定量pcr反应液1含有pcr缓冲液、mgcl2、dntps、耐热dna聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、第一荧光探针和第二荧光探针。

上游扩增引物序列为：5’-attgtgaatctgacaacagaggcttac-3’

下游扩增引物序列为：5’-catgagttagcagttcttgtgagctt-3’

第一荧光探针序列为：5’-fam-accccttacttaccg-mgb-3’

第二荧光探针序列为：5’-hex-accccttatttaccg-mgb-3’

第一阳性对照品2为线粒体第12201位点为t碱基的dna样品，第二阳性对照品3为线粒体第12201位点为c碱基的dna样品，阴性对照品4为无菌注射用水样品。

本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例2线粒体耳聋t12201c突变荧光定量pcr检测试剂盒的应用

(一)检测样品：

在浙江大学医学院附属儿童医院确诊为感音神经性耳聋患儿48例，所有病例均采用美国biovision公司的线粒体dna提取试剂盒，从其外周血标本中提取线粒体dna作为检测样品。

(二)荧光定量pcr检测

在定量pcr反应液管中分别加入检测样品、阳性对照品或阴性对照品5μl，在双色(或以上)荧光定量pcr仪上进行pcr扩增，fam、hex通道分别用于检测12201位点的c碱基和t碱基。pcr反应条件为94℃5分钟预变性，94℃20秒→60℃60秒，共40个循环。

(三)检测结果

第一阳性对照品检测结果12201位点为t碱基(图2)，第二阳性对照品检测结果12201位点为c碱基(图3)。临床检测样品中12201位点为t碱基的有47例，占97.9％；12201位点为c碱基的有1例，占2.1％。所有检测样品的pcr扩增产物经直接测序，发现12201位点的碱基均与荧光定量pcr检测结果相符，表明该试剂盒检测t12201c突变具有很好的准确性。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限度的范围。

<110>浙江大学

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<211>27

<212>dna

<213>人工序列

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<223>扩增人线粒体trna的上游引物序列

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<223>扩增人线粒体trna的下游引物序列

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<223>人线粒体第12201位点为c碱基的荧光探针序列

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<213>人工序列

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<223>人线粒体第12201位点为t碱基的荧光探针序列

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