一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针领域。

背景技术：

在线粒体中，铜离子是一个重要的微量元素,是一系列重要生理酶中不可分割的一部分,如运输和催化功能的酶。当线粒体内的铜离子失衡会破坏线粒体呼吸链，会表现出活性氧簇化合物含量升高、线粒体膜电位下降、脂质过氧化、细胞色素c的释放等一系列细胞凋亡的征兆。铜离子和蛋白质的相互作用也被视为神经变性疾病的信号，如帕金森和阿尔茨海默病。对线粒体内Cu²⁺的精确检测，有助于我们进一步了解铜离子在神经退行性疾病中的起到的作用，有助于增进我们对线粒体内铜离子生理过程的了解，为神经疾病病理的研究提供一个线粒体内铜离子可视化工具。

线粒体在生命中的重要角色，促使它一直作为科学研究中的重中之重。在线粒体的研究中，多以荧光探针主，一个理想的荧光探针是无数个科学家的梦想，至今已经报道出来了很多荧光探针，如检测活性氧簇、活性氮簇、金属离子，生物小分子等的荧光探针，但是这些荧光探针都存在一个致命的缺点就是在经过细胞质靶向线粒体的过程中不能避免来自细胞质内的被检测物的干扰，造成研究结果缺乏说服力。为了解决这一存在已久的问题，急需研发一种可以定位线粒体又能避免细胞质内被检测物的荧光探针。

技术实现要素：

为了解决以上的问题，本发明提供一种可定位活细胞中线粒体，并通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明采用的技术方案是：一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针，所述的荧光探针为Mito-Cu²⁺荧光探针，Mito-Cu²⁺荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示：

本发明采用的另一技术方案是：所述的通过光调控精确检测线粒体内的铜离子荧光探针的制备方法，所述的Mito-Cu²⁺荧光探针的制备方法包括如下步骤：将荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流8-16小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu²⁺荧光探针，反应式如下：

优选的，所述荧光素衍生化合物和三苯基膦的摩尔比为1:1.2-2。

优选的，所述的荧光素衍生物的制备方法如下：

(1)将荧光素溶解在甲醇中，滴加的水合肼，回流8-14小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；

(2)将荧光素酰肼和2-硝基苄溴溶到DMF中，加入碳酸铯常温6-13个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素酰肼；

(3)将光保护荧光素酰肼和1，4-二溴丁烷溶到DMF中，加入碳酸铯和碘化钾常温反应10-24个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到荧光素衍生物。

优选的，所述步骤(1)中荧光素与水合肼的质量比为1:4.2-5。

优选的，所述步骤(2)中荧光素酰肼、2-硝基苄溴和碳酸铯的摩尔比为1:1-1.5:4。

优选的，所述步骤(3)中光保护荧光素酰肼、1，4-二溴丁烷和碳酸铯的摩尔比为1:1.2-1.5:4。

本发明采用的另一技术方案是：一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子荧光探针的应用，所述的荧光探针可应用于生理体系中精确检测线粒体内的铜离子。

有益效果：

本发明的荧光探针具有较好的线粒体靶向性、化学稳定性、生物兼容性和铜离子选择性。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。

本发明的荧光探针在可应用于细胞体系中通过光调控精确检测线粒体内的铜离子而避免来自细胞质中铜离子的干扰的应用。

本发明的精确测线粒体内铜离子的荧光探针可用于活细胞线粒体铜离子的精确检测，主要用的活细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或者RAW264.7细胞株。

附图说明

图1是实施例1制备的Mito-Cu²⁺(5uM)UV光照5分钟后对不同Cu(NO₃)₂浓度Hepes缓冲溶液(0.2uM-20uM)的荧光光谱图。

图2是实施例1制备的Mito-Cu²⁺(5uM)UV光照5分钟后对20uM Cu(NO₃)₂浓度Hepes缓冲溶液不同响应时间的荧光光谱图。

图3是实施例1制备的Mito-Cu²⁺(5uM)UV光照5分钟后对20当量不同金属离子浓度Hepes缓冲溶液的荧光光谱图。

图4是实施例1制备的Mito-Cu²⁺(5uM)在细胞线粒体中的共聚焦显微成像。

具体实施方式

实施例1

通过光调控精确测线粒体内铜离子的荧光探针的制备方法如下：

(1)荧光素酰肼的制备：将1g荧光素溶解在50mL甲醇中，滴加4mL的水合肼，回流10小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；

(2)光保护荧光素酰肼的制备：将108mg荧光素酰肼和82mg 2-硝基苄溴溶到3mL DMF中，加入405mg碳酸铯常温6个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素酰肼；

(3)光保护荧光素衍生物的制备：将光保护荧光素酰肼253mg和1，4-二溴丁烷131.7mg溶到4mL DMF中，加入碳酸铯664.4mg和碘化钾催化量常温反应12个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到荧光素衍生物。¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.02(d,J＝4.8Hz,1H),7.92(d,J＝1.5Hz,1H),7.75(m,1H),7.58(t,J＝4.5Hz,1H),7.42(m,3H),7.00(t,J＝3.9Hz,1H),6.69(s,1H),6.62(d,J＝9.9Hz,1H),6.51(d,J＝6.9Hz,5H),6.03(t,J＝3.3Hz,1H),3.98(t,J＝3.45Hz,2H),3.66(s,2H),3.46(t,J＝3.75Hz,2H),2.03(m,2H),1.92(m,2H),1.69(d,J＝3.9Hz,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ166.36,160.00,158.37,153.14,150.92,147.47,138.70,134.27,132.92,129.76,128.75,128.57,128.49,128.24,127.52,124.88,123.81,123.30,122.92,112.70,112.47,112.13,111.44,110.60,103.15,101.68,71.84,67.24,65.30,33.32,29.46,27.82,23.63.

(4)Mito-Cu²⁺荧光探针的制备：将摩尔比1:1.2的荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流12个小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu²⁺荧光探针。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ8.05(d,J＝4.8Hz,1H),7.74(m,17H),7.55(m,3H),7.48(s,1H),6.95(d,J＝3Hz,1H),6.41-6.50(s,1H),6.59(m,2H)6.53(m,3H),5.59(d,J＝3.9Hz,1H),4.42(bs,2H),4.06(t,J＝3.45Hz,2H),3.69(t,J＝6.75Hz,2H),1.91(m,2H),1.72(m,2H),1.65(d,J＝3.9Hz,3H).¹³C NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ165.49,159.03,157.46,152.13,151.00,147.39,136.87,134.85,134.18,133.56,133.43,132.64,130.24,130.08,129.14,128.57,128.26,127.82,127.28,124.52,123.25,122.43,118.97,117.83,112.29,111.87,111.37,102.31,101.30,71.23,66.24,64.30,28.77,22.90,19.33,18.33.IT-TOF-MS:m/z[M+H]⁺calcd:812.29,found:812.28.

实施例2

通过光调控精确测线粒体内铜离子的荧光探针的制备方法如下：

(1)荧光素酰肼的制备：将0.8g荧光素溶解在50mL甲醇中，滴加3.7mL的水合肼，回流12小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；

(2)光保护荧光素酰肼的制备：将158mg荧光素酰肼和125mg 2-硝基苄溴溶到4mL DMF中，加入593.6mg碳酸铯常温10个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素酰肼；

(3)光保护荧光素衍生物的制备：将光保护荧光素酰肼100mg和1，4-二溴丁烷57mg溶到2mL DMF中，加入碳酸铯267mg和碘化钾催化量常温反应16个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到荧光素衍生物

(4)Mito-Cu²⁺荧光探针的制备：将摩尔比1:1.6的荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流14个小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu²⁺荧光探针。

实施例3

通过光调控精确测线粒体内铜离子的荧光探针制备方法如下：

(1)荧光素酰肼的制备：将1g荧光素溶解在50mL甲醇中，滴加4.5mL的水合肼，回流14小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；

(2)光保护荧光素酰肼的制备：将200mg荧光素酰肼和185.3mg 2-硝基苄溴溶到4mL DMF中，加入751.4mg碳酸铯常温12个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素酰肼；

(3)光保护荧光素衍生物的制备：将光保护荧光素酰肼123mg和1，4-二溴丁烷76mg溶到3mL DMF中，加入碳酸铯323mg和碘化钾催化量常温反应20个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到荧光素衍生物

(4)Mito-Cu²⁺荧光探针的制备：将摩尔比1:1.75的荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流15个小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu²⁺荧光探针。

实施例4

通过光调控精确测线粒体内铜离子的荧光探针制备方法如下：

(1)荧光素酰肼的制备：将1g荧光素溶解在50mL甲醇中，滴加4.8mL的水合肼，回流14小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；

(2)光保护荧光素酰肼的制备：将120mg荧光素酰肼和119mg 2-硝基苄溴溶到4mL DMF中，加入450mg碳酸铯常温13个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素酰肼；

(3)光保护荧光素衍生物的制备：将光保护荧光素酰肼85mg和1，4-二溴丁烷55.3mg溶到2mL DMF中，加入碳酸铯223mg和碘化钾催化量常温反应20个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到荧光素衍生物

(4)Mito-Cu²⁺荧光探针的制备：将摩尔比1:2的荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流16个小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu²⁺荧光探针。

实施例5

通过光调控精确测线粒体内铜离子的荧光探针对铜离子的响应检测

1、Mito-Cu²⁺对不同铜离子浓度的荧光响应(图1)：

首先配制浓度25mM的Hepes缓冲溶液(pH＝7.35),用缓冲溶液配制5uMMito-Cu²⁺的铜离子探针，UV光照5分钟后,加入0.2-20当量的铜离子，用荧光分光光度法测试，并绘制Mito-Cu²⁺的铜离子探针对不同当量铜离子的荧光光谱图。

2、Mito-Cu²⁺对20当量铜离子不同响应时间的荧光响应(图2)：

用缓冲溶液配制5uM Mito-Cu²⁺的铜离子探针，UV光照5分钟后,加入20当量的铜离子，用荧光分光光度法分别测试响应5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟的荧光强度，并绘制Mito-Cu²⁺对20当量铜离子不同响应时间的荧光光谱图。

3、Mito-Cu²⁺对20当量不同金属离子的荧光响应(图3)：

用缓冲溶液配制10uM Mito-Cu²⁺的铜离子探针，UV光照5分钟后,加入20当量的不同金属离子，用荧光分光光度法分别测试，并绘制Mito-Cu²⁺的铜离子探针对不同金属离子的荧光光谱图。

4、Mito-Cu2+在细胞线粒体中的共聚焦显微成像(图4)：

向含有Hela细胞的培养皿中加Mito-Cu²⁺DMSO溶液，与细胞培养液混合均匀后，使Mito-Cu²⁺在培养液中的浓度为5uM，染色1个小时后，用pH＝7.35的缓冲溶液冲洗3次，将该培养皿在共聚焦显微镜下成像，取出培养皿，UV光照5分钟后，静置1个小时，再次将该培养皿在共聚焦显微镜下成像。

实验结果表明，Mito-Cu²⁺具有良好的细胞通透性、很好线粒体靶向性。证明了通过光调控的方法控制探针和铜离子的反应是非常成功的，实现了精确检测线粒体内的铜离子而不受细胞质内铜离子的干扰。

本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。