线粒体耳聋A1555G突变的荧光定量PCR检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种线粒体耳聋a1555g突变的荧光定量pcr检测试剂盒，及其在线粒体耳聋a1555g突变检测中的应用。

背景技术：

耳聋是全球关注的公共卫生问题，由遗传和环境因素共同作用引起，其中超过50％的耳聋患者由遗传因素导致。在遗传性耳聋中，30％为综合征耳聋，70％为非综合征耳聋。耳聋的遗传方式可表现常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、x连锁遗传和母系遗传，线粒体dna(mtdna)突变是母系遗传性耳聋发生的重要原因之一，在遗传性耳聋中的发病率约为1％～2％。

位于mtdna12srrna上的a1555g突变是氨基糖苷类抗生素如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等的作用靶点，与药物性耳聋的发生密切相关。该突变的主要致聋机制是人类mtdna的第1555位核苷酸相当于细菌16srrna的第1491位核苷酸，当发生a1555g突变时，mtdna12srrna的a区能形成一个新的碱基配对，导致12srrna的二级结构与细菌16srrna对应部位的相似度更高，从而促进氨基糖苷类抗生素与之结合，结合后的氨基糖苷类抗生素会抑制参与氧化磷酸化过程的呼吸链蛋白的合成，使携带该突变的个体发生听力损伤。总之，携带a1555g突变的个体对氨基糖苷类药物具有超敏性，可引起临床上常见的“一针致聋”现象，是药物性耳聋发生的重要原因之一。

目前，mtdna突变的常见检测方法主要有直接测序法、微阵列芯片法、pcr-rflp法、荧光定量pcr法等。直接测序法的优点是准确性高，但检测周期较长，且需要专业的测序仪和结果判读人员，不适合临床推广应用。微阵列芯片法具有高通量的优点，但存在检测成本高、操作繁琐、易交叉污染等缺点，不适用于大样本筛查的需求。pcr-rflp法由于在pcr扩增结束后需开盖进行后续的酶切和电泳，同样存在操作繁琐、容易污染等问题。荧光定量pcr技术近年来在分子生物学领域的应用越来越广泛，其基本原理是利用taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通pcr基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团(r)和淬灭基团(q)；探针保持完整时r基团的荧光信号被q基团抑制，一旦探针被切断，q基团的抑制作用消失，r基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对pcr过程中产物量的实时监测，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对pcr产物的后处理，避免了交叉污染。而且，随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料(fam、hex、rox等)及多通道荧光定量pcr仪，可以实现基因分型、基因突变检测、snp分析等研究。

针对荧光定量pcr传统taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，美国abi公司于2000年推出一种新的taqman探针——mgb探针，其3’端采用非荧光性的淬灭基团，在吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，mgb探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可极大提高探针与模板杂交的稳定性，使较短的探针同样能达到较高的tm值。而短探针的主要优点在于荧光报告基团与淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高；同时，短探针也简化了设计和降低了成本。有实验表明mgb探针对于等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱基突变。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种线粒体耳聋常见突变a1555g的荧光定量pcr检测试剂盒，由定量pcr反应液、第一阳性对照品、第二阳性对照品、阴性对照品组成，其中定量pcr反应液含有pcr缓冲液、mgcl2、dntps、耐热dna聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、第一荧光探针和第二荧光探针。

上游扩增引物序列为：5’-catttaactaaaacccctacgcattt-3’

下游扩增引物序列为：5’-gcactttccagtacacttaccatgtt-3’

第一荧光探针序列为：5’-fam-aggaggcaagtcg-mgb-3’

第二荧光探针序列为：5’-hex-tagaggagacaagtcg-mgb-3’

第一阳性对照品为线粒体第1555位点为a碱基的dna样品，第二阳性对照品为线粒体第1555位点为g碱基的dna样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。

本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本发明试剂盒包括说明书和盒体。

本发明的另一个目的是提供所述的试剂盒在相关性耳聋线粒体a1555g突变检测中的应用。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

⑴人外周血细胞mtdna的提取：严格按照美国biovision公司商品化的线粒体dna提取试剂盒操作，从临床外周血标本中提取mtdna。

⑵pcr扩增检测：在双色(或以上)荧光定量pcr仪上进行，每个pcr反应体系总体积为25μl，其中包括20μlpcr反应液和5μl模板(提取的mtdna、阳性对照、阴性对照)。探针检测模式为：fam、hex通道分别用于检测1555位点的g碱基和a碱基。pcr反应条件：94℃5分钟预变性，94℃20秒→60℃60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。

⑶荧光定量结果报告：①检测样品g碱基探针ct值≤35且扩增曲线有明显对数增长期，同一反应体系中a碱基探针ct值大于g碱基探针ct值，且两者差值≥5，则该检测样品1555位点为g碱基；②检测样品a碱基探针ct值≤35且扩增曲线有明显对数增长期，同一反应体系中g碱基探针ct值大于a碱基探针ct值，且两者差值≥5，则该检测样品1555位点为a碱基；③当两探针ct值均大于35或两探针ct值的差值小于5时，需对样品重新进行mtdna提取和pcr检测。

本发明针对mtdna第1555位点的a>g单碱基突变设计两条mgb探针，开发该位点突变的荧光定量pcr检测试剂盒，旨在准确、快速、简便地检测mtdnaa1555g突变，从而应用于该突变相关性耳聋的临床诊断、预防和治疗。本发明采用实时荧光定量pcr技术和双色荧光探针，开发研制了用于线粒体耳聋常见突变a1555g的检测试剂盒。该试剂盒能通过一步法检测mtdna第1555位点是否发生a>g突变，可满足临床准确、快速、简便地诊断该突变相关性耳聋的需要，同时为a1555g突变导致的线粒体耳聋的预防和治疗提供依据。

附图说明

图1为本发明试剂盒的结构示意图。

图2为第一阳性对照品检测结果1555位点为a碱基的扩增曲线。

图3为第二阳性对照品检测结果1555位点为g碱基的扩增曲线。

具体实施方式

本发明结合实施例和附图作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。

实施例1

参见图1，本发明提供的线粒体耳聋a1555g突变的荧光定量pcr检测试剂盒，由定量pcr反应液(1)、第一阳性对照品(2)、第二阳性对照品(3)、阴性对照品(4)、说明书(5)和盒体(6)组成，其中定量pcr反应液含有pcr缓冲液、mgcl2、dntps、耐热dna聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、第一荧光探针和第二荧光探针。

上游扩增引物序列为：5’-catttaactaaaacccctacgcattt-3’

下游扩增引物序列为：5’-gcactttccagtacacttaccatgtt-3’

第一荧光探针序列为：5’-fam-aggaggcaagtcg-mgb-3’

第二荧光探针序列为：5’-hex-tagaggagacaagtcg-mgb-3’

第一阳性对照品为线粒体第1555位点为a碱基的dna样品，第二阳性对照品为线粒体第1555位点为g碱基的dna样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。

本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例2线粒体耳聋a1555g突变荧光定量pcr检测试剂盒的应用

(一)检测样品：

在浙江大学医学院附属儿童医院确诊为感音神经性耳聋患儿30例，所有病例均采用美国biovision公司的线粒体dna提取试剂盒，从其外周血标本中提取线粒体dna作为检测样品。

(二)荧光定量pcr检测

在定量pcr反应液管中分别加入检测样品、阳性对照品或阴性对照品5μl，在双色(或以上)荧光定量pcr仪上进行pcr扩增，fam、hex通道分别用于检测1555位点的g碱基和a碱基。pcr反应条件为94℃5分钟预变性，94℃20秒→60℃60秒，共40个循环。

(三)检测结果

第一阳性对照品检测结果1555位点为a碱基(图2)，第二阳性对照品检测结果1555位点为g碱基(图3)。临床检测样品中1555位点为a碱基的有28例，占93.3％；1555位点为g碱基的有2例，占6.7％。所有检测样品的pcr扩增产物经直接测序，发现1555位点的碱基均与荧光定量pcr检测结果相符，表明该试剂盒检测a1555g突变具有很好的准确性。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限度的范围。

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>扩增人线粒体12srrna的上游引物序列

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<223>扩增人线粒体12srrna的下游引物序列

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<223>人线粒体第1555位点为g碱基的荧光探针序列

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<213>人工序列

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<223>人线粒体第1555位点为a碱基的荧光探针序列

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