一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器，该纳米传感器既具有对溶氧量敏感的荧光寿命，又能特异性靶向细胞内的线粒体。细胞吞噬氧气纳米传感器后，细胞质内及线粒体内的溶氧量的变化均可通过纳米传感器的荧光寿命的变化进行检测。本发明具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器拥有如下特性：（一）PLL壳层使得传感器拥有很好的生物体相容性，同时封装也使得探针对外部的干扰具有抗性；（二）线粒体靶向性良好；（三）荧光寿命的氧气灵敏度高；（四）可实现对细胞内不同位置的溶氧量的检测。
【专利说明】一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物溶氧量荧光检测的【技术领域】，具体涉及一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002]线粒体是细胞内重要的细胞器，在维持生理功能的稳态方面起重要作用。线粒体功能的失调和一系列的病理疾病直接有关，如肥胖症、糖尿病、肿瘤、和心血管疾病等，因此，对细胞线粒体功能的检测具有十分重要的意义。众所周知，线粒体是细胞内有氧呼吸产生能量的主要场所，细胞内大部分的氧被线粒体利用。如能对线粒体内的溶氧量水平进行实时监测，则可以间接反映出线粒体的活性以及其代谢功能。
[0003]近年来利用氧气探针分子掺杂的荧光纳米传感器来检测细胞内溶氧量已为科研人员认可。荧光氧气探针一般采用过渡金属配合物，其金属配体电荷转移的荧光性质对氧含量非常敏感。一般而言，随着氧含量水平的升高，其荧光强度和寿命均降低。将氧气探针分子包覆于对氧气具有通透性的纳米粒子内制备成纳米传感器，并通过细胞内吞作用进入细胞质中，则可以实现对细胞内溶氧量的检测。但目前特异性对线粒体内溶氧量的荧光检测仍是一项具有挑战性的工作。要使纳米载体靶向线粒体，需要在纳米载体上修饰能特异识别并且进入线粒体的功能结构。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器，该纳米传感器既具有对溶氧量敏感的荧光寿命，又能特异性靶向细胞内的线粒体。细胞吞噬氧气纳米传感器后，细胞质内及线粒体内的溶氧量的变化均可通过纳米传感器的荧光寿命的变化进行检测。
[0005]为解决第一个技术问题，本发明采用下述技术方案:
[0006]一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器，所述荧光氧气纳米传感器为具有线粒体靶向性的核壳结构的荧光氧气纳米颗粒；所述荧光氧气纳米颗粒是以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅为核(DTS-PS)，以多聚赖氨酸(PLL)为壳的核壳结构，其中，钼(II )MES0-四(五氟苯)卟吩(PtTFPP)分子分散于核层中作为氧气探针，壳层表面偶联三苯基膦(TPP)。
[0007]优选地,所述突光纳米氧气传感颗粒粒径为100_150nm。
[0008]本发明还提供一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器的制备方法，包括以下制备步骤:
[0009]I)将钼(II ) MESO-四(五氟苯)卟吩分子PtTFPP，聚苯乙烯PS和十二烷基三甲氧基硅烷DTS按照1-3%:47-49%: 50%的质量比溶解于四氢呋喃；
[0010]2)将上述溶液在超声震荡条件下注入到pH值为9的含有0.01-0.02mg/ml的多聚赖氨酸PLL的去离子水中，得到悬浮液；
[0011]3)将上述悬浮液静置2小时后，将其在二次蒸馏水中透析24小时，然后加入相当于多聚赖氨酸PLL摩尔浓度30倍的三苯基膦TPP及1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC，震荡两小时，再透析24小时即得具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器。
[0012]本发明的有益效果:
[0013]本发明中PtTFPP的应用是基于它具有较长的发光寿命、大的stokes位移和易于被氧气猝灭等特点。当受光激发后，电子从单线态基态跃迁到单线态MLCT激发态，并以非辐射的形式跃迁到三线态MLCT激发态，电子再回到基态时就会产生发光现象。氧分子与处于激发态的发光分子通过碰撞发生能量传递，进而使发光分子的发光猝灭，氧分子变为单线态氧。PLL的应用提高了荧光氧气纳米传感器的生物兼容性，并为进一步偶联线粒体靶向序列TPP提供靶点一伯胺基团。通过偶联TPP，使荧光氧气纳米颗粒成功靶向细胞内线粒体。纳米粒子中，PS和DTS分别作为基质和封装剂。在超声注入过程中，由于水相对于四氢呋喃的比例的突然增加，疏水性化合物聚合以形成颗粒。同时，DTS水解和缩聚导致二氧化硅基颗粒的封装。随后，由于PLL的氨基和硅烷醇基团之间的静电引力，PLL分子吸附到颗粒表面上，而形成核壳结构的纳米粒子。氧气探针PtTFPP随机分布在疏水性的DTS-PS核心部位，被带负电荷的二氧化硅层封装，表面进一步吸附PLL分子，从而使聚合物杂化纳米粒子表面修饰伯胺基团，然后基于胺基偶联化学连接亲脂性阳离子物质(TPP)，依赖线粒体膜高电位能的推动，将与之结合的纳米载体转运至线粒体基质。氧气探针的荧光寿命有较强的氧气敏感性，PLL对纳米颗粒包覆使其具有较好的生物相容性，偶联TPP使纳米粒子具有线粒体靶向性。上述特性使得这种核壳结构纳米颗粒在生物氧气传感方面具有极大的应用价值。
[0014]本发明具有线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器拥有如下特性:(一)PLL壳层使得传感器拥有很好的生物体相容性，同时封装也使得探针对外部的干扰具有抗性；(二)线粒体靶向性良好；(三)荧光寿命的氧气灵敏度高；(四)可实现对细胞内不同位置的溶氧量的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明
[0016]图1为具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米颗粒的截面示意图。
[0017]图2为具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米颗粒的扫描电镜照片。
[0018]图3为荧光氧气纳米传感器寿命与溶氧量的关系的标定曲线示意图。
[0019]图4为MTT比色法检测荧光纳米氧气传感颗对HepG2细胞的毒性的示意图。
[0020]图5为对比分析偶联TPP纳米颗粒、未偶联TPP纳米颗粒及未包覆PLL的纳米颗粒对细胞新陈代谢刺激的反应示意图。曲线指线粒体靶向纳米传感器的发光寿命变化趋势，一红色对应细胞内氧气纳米传感器的发光寿命变化趋势,—对应细胞外氧气纳米传感器的发光寿命变化趋势。
【具体实施方式】[0021]为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。
[0022]实施例1
[0023](I)将PtTFPP，PS和DTS按照2:48:50的质量比溶解于四氢呋喃中，并且使它们在溶液中的总浓度为0.2 %。然后，使用微量调节注射器，取上述溶液500 μ L，在超声震荡条件下迅速注入到pH值为9 (用氨水调整pH值)的去离子水中，由此产生的悬浮液经超声震荡2小时后，随后在二次水中透析24小时，即得到用于细胞外部氧含量测量的纳米颗粒。
[0024](2)同等浓度PtTFPP，PS和DTS的混合溶液在超声震荡条件下迅速注入到pH值为9的PLL浓度为0.02mg/ml的去离子水中，由此产生的悬浮液经超声震荡2小时后，随后在二次水中透析24小时(除去有机溶剂和多余的PLL)，即得到PLL包覆的核壳结构纳米颗粒，用于检测细胞内的氧含量。
[0025](3)在上述包覆PLL的纳米颗粒中，加入相当于PLL摩尔浓度30倍的TPP和EDC溶液后，震荡两小时，实现TPP与纳米颗粒的偶联，即得到线粒体靶向的纳米粒子，用于检测细胞内线粒体的氧含量。
[0026]细胞的吞噬效率的探究
[0027]用线粒体示踪剂(Mitotracker)对吞曬了偶联TPP的纳米粒子的肿瘤细胞的线粒体进行染色，HepG2细胞无血清培养至汇合率大约50%时，加入荧光纳米颗粒，使其浓度达到10mg/ml，与细胞孵育24小时，随后使用PBS冲洗3遍，通过共聚焦显微镜观察细胞的纳米颗粒吞噬效率。利用共聚焦荧光显微镜对示踪剂和纳米颗粒双通道成像。通过二者成像位置的复合证实本发明中的氧气纳米传感器对细胞内的线粒体具有靶向性。
[0028]细胞内氧气探针寿命与溶氧量的关系
[0029]细胞内突光氧气纳米颗粒的寿命的表征，是通过Victor4(Perkin_Elmer LifeSciences)多标记分析仪的时间分辨突光检测功能计算得到。340nm光激发，642nm处检测荧光强度，间隔一定时间周期性测量每个微孔，延迟时间分别为30us和70us，gate time为lOOuso标定细胞外、细胞内、线粒体内探针寿命与溶氧量的校准曲线的方法是,将细胞培养于24孔板中，分别加入三种荧光探针，共培养24小时后，替换无酚红培养基，使用PBS冲洗三遍，加入4uM的Rotenone抑制细胞呼吸，随后分别通入0，0.86，1.72，2.58，4.3和8.6ppm的氧气，测试其寿命变化，进而标定寿命与氧气含量的关系。
[0030]本发明中的核壳结构纳米颗粒的衰减时间对氧气极为敏感。图3给出了氧气敏感纳米颗粒的发光寿命随氧气浓度的变化曲线，可以观察到，寿命随着氧气浓度的上升而迅速缩短，氧气浓度的变化趋势可以通过单指数函数进行拟合。
[0031]毒性检测
[0032]荧光氧气纳米传感器对细胞毒性的测试是通过MTT比色法进行的，首先，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积0.2mL,培养箱中培养24小时。然后更换培养基，加入不同浓度梯度的荧光氧气传感纳米颗粒。培养24小时后，每孔加0.02mL的MTT溶液(5mg/mL，使用PBS配致)。在培养箱中孵育4小时后，终止培养，清除孔内的废液。在孔板的每孔中加入0.15mL的DMS0，遮光振荡约10分钟，使结晶物得到充分的溶解。然后利用酶联免疫检测仪测定其在波长为490nm的光吸收值，从而可以间接反映细胞的成活数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。[0033]细胞新陈代谢功能分析
[0034]细胞新陈代谢功能分析是通过荧光氧气纳米传感颗粒的寿命变化来表征的，通过氧气传感器探针寿命标定细胞外、细胞内及线粒体内氧含量与细胞新陈代谢的关系。加入线粒体解耦联剂FCCP，使线粒体膜通透性增加，减少细胞内ATP的生成，增加产热，促进细胞呼吸，降低细胞内氧含量。基于荧光氧气纳米传感器对线粒体内、细胞内及细胞外溶氧量进行荧光寿命检测，氧气纳米传感器的荧光寿命即溶氧量水平与细胞新陈代谢的关系见图
5。基于线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器，通过时间分辨荧光检测，探究线粒体内、细胞内及细胞外氧含量对细胞新陈代谢变化的反应，在96孔板中，培养浓度为3*104的H印g2细胞，与探针共培养24小时后，加入FCCP，使用矿物油密封，观察纳米粒子寿命随时间的变化情况。加入FCCP后，细胞外，细胞内，及线粒体内探针寿命都逐渐增加，因为加入FCCP后，线粒体呼吸作用得到促进，使氧气浓度降低，寿命变长。但是相比较而言，细胞外氧气含量变化较少，线粒体内变化率最明显，因为FCCP首先作用于线粒体，线粒体呼吸加强，使线粒体附近氧气含量迅速减少，进而使细胞内氧含量减少，最终使细胞外培养基中的氧气逐渐被消耗。
[0035]实施例2
[0036]重复实施例1，其不同之处仅在于钼(II )MES0_四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷质量比为按照1:49:50，多聚赖氨酸的去离子水浓度为0.0lmg/ml ο
[0037]实施例3
[0038]重复实施例1，其不同之处仅在于钼(II )MES0_四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷质量比为按照3:47:50。
[0039]实施例4
[0040]重复实施例1，其不同之处仅在于步骤3)是将悬浮液静置I小时后，将其在二次蒸馏水中透析20小时，然后加入相当于多聚赖氨酸PLL摩尔浓度20倍的三苯基膦及1- (3- 二甲氨基丙基)-3_乙基-碳二亚胺盐酸盐，震荡I小时，再透析40小时得到具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器。
[0041]实施例5
[0042]重复实施例1，其不同之处仅在于步骤3)是将悬浮液静置3小时后，将其在二次蒸馏水中透析40小时，然后加入相当于多聚赖氨酸PLL摩尔浓度40倍的三苯基膦及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐，震荡2小时，再透析20小时得到具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器。
[0043]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【权利要求】
1.一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器，其特征在于，所述荧光氧气纳米传感器为具有线粒体靶向性的核壳结构的荧光氧气纳米颗粒；所述荧光氧气纳米颗粒是以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅为核，以多聚赖氨酸为壳的核壳结构，其中，钼(II )MESO-四(五氟苯)卟吩分子分散于核层中作为氧气探针，壳层表面吸附三苯基勝基团。
2.根据权利要求1所述的具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器，其特征在于:所述突光纳米氧气传感颗粒粒径为100-150nm。
3.如权利要求1-2所述的具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤: 1)将钼(II)MESO-四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷按照1-3:47-49:50的质量比溶解于四氢呋喃； 2)将上述溶液在超声震荡条件下注入到pH值为9的含有浓度为0.01-0.02mg/ml的多聚赖氨酸的去离子水中，得到悬浮液； 3)将上述悬浮液静置1-3小时后，将其在二次蒸馏水中透析20-40小时，然后加入相当于多聚赖氨酸PLL摩尔浓度20-40倍的三苯基膦及1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐，震荡1-2小时，再透析20-40小时即得具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器。
【文档编号】G01N21/64GK103575717SQ201310571954
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】彭洪尚, 王小卉 申请人:北京交通大学