专利名称：一种利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法
技术领域：
本发明涉及化合物(化学品)检测领域，具体涉及一种简单、经济、高通量实现利用 斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法。
背景技术：
线粒体是真核细胞内重要的细胞器，参与细胞内三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷 酸化等多种重要的生理和生化过程。线粒体在细胞凋亡中起重要的枢纽作用，线粒体中一 系列的代谢过程与细胞凋亡密切相关，如氧自由基的过度产生、细胞色素C的释放、线粒体 膜通透性转换孔的异常开放等。线粒体膜具有多种离子通道可介导离子转运，离子通道的 调节可能影响线粒体甚至细胞的功能。线粒体损伤一方面可直接导致线粒体病，另一方面 与神经退行性疾病、肿瘤、衰老等息息相关[1]线粒体介导的细胞凋亡途径主要过程是细胞色素C、Smac蛋白、凋亡诱导因子和 核酸内切酶从线粒体释放。其中促凋亡亚族(Bax)是p53激活转录的产物，可以促进或诱 导线粒体凋亡因子的释放从而促进凋亡。在正常情况下这些蛋白是位于细胞的非线粒体组 分，一旦细胞受到凋亡诱导剂的诱导，它们就以线粒体作为靶细胞器而向线粒体转位，对凋 亡进行调控。凋亡诱导剂诱导细胞凋亡时，线粒体膜通透性增强，线粒体内的各种蛋白被释 放出来，包括细胞色素C。细胞色素C进入细胞质中与凋亡蛋白激活因子Apaf-I及半胱氨 酸天冬氨酸特异性蛋白酶-9 (Caspase-9)前体形成凋亡小体，在细胞质中存在的脱氧三 磷酸腺苷(dATP)的共同作用下，活化Caspase-9前体，启动Caspase级联，最终诱导细胞产 生凋亡[2_3]。线粒体在细胞凋亡中的重要性还在于它与Bcl-2基因家族之间的关系。很多 Bcl-2家族的蛋白如Bcl-2、Bax、Bcl-xl等都定位于线粒体膜上。神经退行性疾病(Degenerative disease of the central nervous system, ND)是一组以原发性神经元变性为基础的慢性进行性神经系统疾病。该类疾病主要包 括阿尔茨海默病(Alzheimer ‘ s disease, AD)、巾白金森病(Parkinson ‘ s disease, PD)、Huntington舞蹈病(Huntington disease)、不同类型脊髓小脑共济失调(spinal cerebellar ataxias)、多发性硬化(multiple sclerosis, MS)、多发性肌萎缩侧索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis)及脊髓肌萎缩症(spinal muscular atrophy)等。神 经退行性病变共同的病理机制之一是神经细胞的凋亡，因此可通过阻断神经细胞退行性改 变的线粒体介导的细胞凋亡过程筛选防治神经退行性病变的药物[4_6]。线粒体介导肿瘤细胞凋亡的主要途径是通过线粒体膜通透性改变，介导凋亡因 子的释放。有体外实验证明，线粒体DNA突变可削弱正常呼吸功能，释放高水平的活性氧 (reactive oxygen species, R0S)，从而激活细胞凋亡及对核基因组的损伤[7_9]。抗肿瘤药 物作用于线粒体，可导致线粒体通透性转换孔开放，线粒体膜电位下降或消失，继而呼吸链 脱耦联，谷胱甘肽耗竭，ROS产生及细胞色素C和诱导因子释放，并诱导肿瘤细胞凋亡。衰老的发展过程与线粒体功能异常密切相关[1°]。自由基学说是具有代表性的衰 老学说之一。线粒体作为细胞呼吸和氧化的中心，也是产生活性氧的重要场所["]。正常机体内ROS的产生与消除处于动态平衡，但随着机体年龄的增加，这种平衡被打破，抗氧化活 性递减，氧自由基产生增多并积累。过多的氧自由基可通过过氧化作用攻击线粒体膜，导致 线粒体膜通透性改变，线粒体膜电位下降或消失，最终诱导细胞凋亡研究发现许多药物或毒物的作用靶点位于线粒体膜或线粒体内膜复合物，其药理 或毒理作用主要通过调节线粒体呼吸链功能、代谢酶活性、膜通透性来实现，药物或毒物能 损伤线粒体结构、酶或DNA合成[12_14]。因此，可通过检测线粒体损伤来评价化合物毒性和 筛选新药。线粒体损伤的检测包括对线粒体膜通透性转换孔的检测、膜磷脂的检测、膜电位 的检测及线粒体DNA的损伤检测。目前线粒体损伤的检测方法主要是建立在细胞水平或分 子水平基础上。细胞凋亡过程中线粒体损伤的检测方法主要有以下几种[15]
(1)免疫印迹法通过不同免疫印迹法，测定不同细胞成分中细胞色素C、AIF等蛋白分 布。此方法处理量相对较低，且需亚细胞结构线粒体的分离。该方法实验过程操作复杂，难 以避免非特异性影响，容易产生假阳性或假阴性结果。(2)酶联免疫吸附测定利用特定商品试剂盒对亚细胞分布进行测定，敏感性较 高，但需要亚细胞结构分离。该方法实验操作复杂，容易造成细胞损伤，且不能反映药物在 生物整体的吸收、分布、代谢与排泄，不能反映药物在体内的真实情况。(3)细胞转染利用绿色荧光蛋白(green-fluorescence protein, GFP)标记的编 码膜间蛋白的cDNA转染细胞，该方法虽然可应用于活细胞，且进行动态观察，但过程较为 复杂，处理量低。(4)免疫荧光或共聚焦显微镜经固定及渗透化处理的细胞，先后与一抗及二抗反 应，相应的二抗上进行荧光标记，荧光显微镜观察。可利用活性caspase抗体和核对比染色 检测凋亡过程的进行。但此方法样本处理量较低，且不同膜间蛋白释放过程的动力学有所 不同，易产生假阴性结果。(5)电子/免疫电子显微镜可观察凋亡细胞的超微结构，从而直接观察线粒体外 膜破裂及局部内膜疝出。该方法样本处理量很低，很难进行定量分析，且不能检测外膜完整 性未破坏时发生的透化现象。(6)细胞荧光测定利用荧光活化细胞分选系统(fluorescence activated cell sorting, FACS)进行测定。首先应用低浓度洋地黄选择性将细胞膜透化，引起胞质细胞色 素C外漏并被清除。再经过固定，免疫标记及细胞荧光测定。正常细胞的细胞色素C维持在 线粒体膜间隙中，呈现出强荧光，而如细胞色素C从外膜漏出，则荧光信号较弱。此方法可 用于大量样本量的处理且无需亚细胞分离，但实验过程较为复杂，处理过程中需不断优化。但是，上述无论是细胞水平还是分子水平的线粒体损伤检测，都属于体外实验检 测，且存在很多缺陷
(1)细胞水平的检测采取细胞培养的方式，该方法虽然有效、所需费用较低，但体外细 胞缺少了生物整体的代谢循环转换和体内的循环分布，不能真正反映整体生物活性；
(2)分子水平的检测需将线粒体分离，同样缺少了药物在生物体内的吸收、分布、代谢 及排泄过程，不能反映药物在体内的真实情况；
(3)线粒体在分离过程中会造成不同程度的损伤，相对纯度较低；
(4)离体线粒体酶活性较低，生物学功能较差；(5)难以避免非特异性影响，从而产生假阳性或假阴性结果；
(6)样本容量低，不能进行高通量筛选，难于定量分析；
(7)实验重复性差，特异性较差，敏感性较差；
(8)实验操作复杂，实验周期长；
(9)实验费用较高。目前尚未见线粒体损伤检测的体内实验报道，利用斑马鱼检测线粒体损伤的研究 亦很少。Zhang YZ等[18]利用共聚焦显微镜结合JC-I荧光染色法检测了斑马鱼卵子发生 过程中的线粒体行为，该研究首先将成年雌性斑马鱼卵巢离体，经化合物处理后制成早期 卵母细胞悬液，再经线粒体荧光染料染色后置于共聚焦显微镜下观察研究。该研究是用来 观察斑马鱼卵子发生过程中的线粒体行为，并非是对线粒体损伤的检测，不能用来评价化 合物的线粒体毒性，也不能用来筛选线粒体靶向化合物。公开号为CN1866025A的中国发 明，公开一种斑马鱼胚胎模型检测抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活 性的方法，但该发明并非靶向线粒体筛选化合物。JC-I (碘化四氯代四乙基苯咪唑羰花青)是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料， 能进入活细胞内与线粒体内膜特异性结合。JC-I是很好的电压依赖性荧光染料，目前被认 为是最可靠最敏感的线粒体膜电位特异性的荧光染色剂。其原理是正常线粒体膜电位较 高，JC-I聚集在线粒体的基质中形成聚合物，激发光488nm时的最大发射波长为590nm，可 以产生红色荧光；损伤线粒体膜电位降低，JC-I不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-I为 单体，激发光488nm时最大发射波长为530nm，可以产生绿色荧光[16_17]。因此，可通过检测 红绿荧光强度来表示线粒体膜电位的变化。此外，本发明也可以采用活细胞内线粒体荧光 染料DASPEI (2，4- 二甲基氨基苯乙烯基-N-乙基吡啶鐺碘化物)作为染色剂，其在激发光 488nm,发射光515nm时可产生绿色荧光。线粒体经过JC-I染色后的检测方法主要是采用流式细胞仪、荧光酶标仪或激光 共聚焦显微镜等[19_22]仪器进行分析研究。但目前采用这些方法的研究仍处于体外实验阶 段，且建立在细胞水平基础上。这些方法虽然有效，但实验操作复杂，实验费用较高，难以避 免非特异性影响，从而产生假阳性或假阴性结果，最重要的是体外细胞缺少了生物整体的 代谢循环转换和体内的循环分布，不能真正反映整体生物活性。
发明内容
为了克服上述现有技术线粒体损伤检测方法所存在的缺陷和不足，发明人经过研 究，旨在提供了一种方便快捷、经济实用的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的体内实验 分析方法。具体来讲，本发明的技术方案如下 发明概述
一种利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，主要包括以下步骤
(1)斑马鱼选取
选取受精后2-7天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中，
(2)化合物处理
A方案移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物处理组、线粒体损伤阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的待测化合物溶液、线粒体 损伤诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，然后微孔板于28°C下恒温培养6-72 h (小时)，其中待 测化合物溶液浓度为0. 1-1000 μ Μ,或者
B方案移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物组合处理组、线粒体损伤模型 组、线粒体保护阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的 待测化合物+线粒体损伤诱导剂的混合溶液、线粒体损伤诱导剂溶液、线粒体损伤诱导剂+ 线粒体保护剂的混合溶液、溶剂、养殖用水，然后微孔板于28°C下恒温培养6-72 h (小时)， 其中待测化合物溶液浓度为0. 1-1000 μ Μ,
(3)JC-I或DASPEI染色处理
将溶剂对照组随机分为两组，其中一组不染色作为背景组，另外一组与其他组进行染 色处理，步骤如下
Α、移除微孔板中的液体，根据微孔板的规格加入10 μ M JC-I或ImM DASPEI ；
B、将微孔板置于28°C恒温中培养0.5-1h (小时);
C、移除微孔板中的液体，用养殖用水清洗；
D、微孔板中根据微孔板的规格加入养殖用水，于28°C恒温中培养5min(分钟)；
E、重复实验操作D)2-3次；
F、将斑马鱼转入新的微孔板中，移除微孔板中的液体，根据微孔板的规格加入养殖用
水，
(4)多功能微孔板分析仪定量分析或/和荧光显微镜定性分析。本发明利用活体斑马鱼荧光染色法检测线粒体靶向化合物。JC-I的原理是正常 线粒体膜电位较高，JC-I聚集在线粒体的基质中形成聚合物，激发光488nm时的最大发射 波长为590nm，可以产生红色荧光；损伤线粒体膜电位降低，JC-I不能聚集在线粒体的基质 中，此时JC-I为单体，激发光488nm时最大发射波长为530nm，可以产生绿色荧光。因此，可 通过检测红绿荧光强度来表示线粒体膜电位的变化。此外，本发明也可以采用活细胞内线 粒体荧光染料DASPEI作为染色剂，其在激发光488nm，发射光515nm时可产生绿色荧光。作为优选，根据本发明所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其中 所述的步骤(1)斑马鱼选取受精4天后的斑马鱼；所述的步骤(2)化合物处理中微孔板于 28°C下恒温培养24h。在该条件下，线粒体损伤诱导剂可导致最大程度的线粒体损伤。作为优选，根据本发明所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其中所 述的步骤(3)染色处理的整个染色过程需避光操作。避光的理由是避免荧光见光消退。作为优选，根据本发明所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其中所 述的步骤(1)斑马鱼选取采用解剖显微镜。优选的理由是解剖显微镜下能更准确地挑选发 育正常的斑马鱼，利于下一步化合物处理，有利于检测结果。作为优选，根据本发明所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其中所 述的微孔板选用6-96孔的微孔板。选择这些规格微孔板的理由是研究发现，本发明的斑马 鱼适宜在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析。作为优选，根据本发明所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其中所 述的步骤(2)采用A方案进行化合物处理后，步骤(4)多功能微孔板分析仪定量分析按下述 方法操作将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度，将激发光设置为488·，在590nm 处(JC-I为染色剂)或515nm处(DASPEI为染色剂)采集发射光的荧光强度，按下述公式计 算线粒体损伤率
权利要求
一种利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，主要包括以下步骤(1)斑马鱼选取选取受精后2 7天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中，(2)化合物处理A方案移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物处理组、线粒体损伤阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的待测化合物溶液、线粒体损伤诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，然后微孔板于28℃下恒温培养6 72小时，其中待测化合物溶液浓度为0.1 1000μM，或者B方案移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物组合处理组、线粒体损伤模型组、线粒体保护阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的待测化合物+线粒体损伤诱导剂的混合溶液、线粒体损伤诱导剂溶液、线粒体损伤诱导剂+线粒体保护剂的混合溶液、溶剂、养殖用水，然后微孔板于28℃下恒温培养6 72小时，其中待测化合物溶液浓度为0.1 1000μM，(3)JC 1或DASPEI染色处理将溶剂对照组随机分为两组，其中一组不染色作为背景组，另外一组与其他组进行染色处理，步骤如下A、移除微孔板中的液体，根据微孔板的规格加入10μM JC 1或1mM DASPEI；B、将微孔板置于28℃恒温中培养0.5 1小时；C、移除微孔板中的液体，用养殖用水清洗；D、微孔板中根据微孔板的规格加入养殖用水，于28℃恒温中培养5分钟；E、重复实验操作D)2 3次；F、将斑马鱼转入新的微孔板中，移除微孔板中的液体，根据微孔板的规格加入养殖用水，(4)多功能微孔板分析仪定量分析或/和荧光显微镜定性分析。
2.根据权利要求1所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于所 述的步骤(1)斑马鱼选取受精4天后的斑马鱼；所述的步骤(2)化合物处理中微孔板于 28°C下恒温培养24小时。
3.根据权利要求1或2所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于 所述的步骤(3)染色处理的整个染色过程需避光操作。
4.根据权利要求1或2所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于 所述的步骤(1)斑马鱼选取采用解剖显微镜。
5.根据权利要求1或2所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于 所述的微孔板选用6-96孔的微孔板。
6.根据权利要求1或2所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于 所述的步骤(2)采用A方案进行化合物处理后，步骤(4)多功能微孔板分析仪定量分析按下 述方法操作将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度，将激发光设置为488·，在590nm 处或515nm采集发射光的荧光强度，按下述公式计算线粒体损伤率
7.根据权利要求1或2所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于 所述的步骤(2)采用B方案进行化合物处理后，步骤(4)多功能微孔板分析仪定量分析按下 述方法操作将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度，将激发光设置为488·，在530nm 处采集发射光的荧光强度，按下述公式计算线粒体损伤保护率
8.根据权利要求1或2所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于 所述的步骤(4)荧光显微镜定性分析按下述方法操作将斑马鱼转入新的微孔板后，移除微孔板中的养殖用水，根据微孔板规格加入浓度为 0. 64mM的甲磺酸，用3%甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察荧光 颜色。
9.根据权利要求1或2所述的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，其特征在于 所述的步骤(2)化合物处理中的溶剂为体积浓度为0. 1%的二甲基亚砜。
全文摘要
本发明涉及化合物检测领域，具体涉及一种利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的方法，主要包括斑马鱼选取、化合物处理、染色处理和定量/定性分析几个步骤，其中所述的染色处理是指将经过化合物处理后的斑马鱼采用JC-1或DASPEI作为染色剂在28℃下染色处理0.5-1个小时。本发明弥补了现有技术无法实现体内检测线粒体损伤的不足，提供了一种方便快捷、经济实用的利用斑马鱼筛选线粒体靶向化合物的体内实验分析方法，具有高通量、特异性强的特点。
文档编号G01N33/543GK101968484SQ20101029669
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者彭恩泽 申请人:彭恩泽