与对人双微体2(mdm2)抑制剂的敏感性相关的标志物的制作方法

与对人双微体2(mdm2)抑制剂的敏感性相关的标志物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了监测生物标志物的差异性基因表达以确定患者对人双微体抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法、通过测量生物标志物确定细胞对MDM2i的敏感性的方法和筛选候选MDM2i的方法。
【专利说明】与对人双微体2 (MDM2)抑制剂的敏感性相关的标志物 发明领域
[0001] 本发明涉及药物基因组学领域以及可用于治疗之前确定患者敏感性、治疗后跟随 患者响应、癌敏感性和化合物筛选的生物标志物的用途。
[0002] 置量
[0003] p53,也称作肿瘤蛋白53,是参与预防癌症的肿瘤抑制基因，经常被称作基因组 的看门人或保护人（Levine, Cell 1997,88:323-331)。P53基因编码一种正常情况下静 止并且当细胞应激或受损时（如当因诱变剂遭致DNA损伤时）变得激活的转录因子。如 果细胞应激或受损，P53发挥作用以限制损伤或若无这种作用，则触发凋亡途径，从而受 损细胞被消除并且不再威胁生物（Vogelstein等人，Nature 2000,408:307-310)。对 不同癌的分析显示p53在约50 %的人类癌症中突变（Hollstein等人，Nucleic Acids Res. 1994, 22:3551-3555:Hollstein等人，Science 1991，253(5015) :49-53)。卩53杂合（仅 具有单个有功能拷贝）的人将在成年早期形成肿瘤，一种称作Li-Fraumeni综合征的病症 (Varley 等人，Hum. Mutat. 2003, 21 (3) : 313-320)。然而，尽管 p53 调节细胞命运，p53 受另 一种称作MDM2的蛋白质调节。
[0004] 发现双微体2蛋白（MDM2)作为p53的负向调节物（Fakharzadeh等人，EMBO J. 1991，10 (6) : 1565-1565)。MDM2编码含有p53结合结构域和核输出信号序列的E3连接 酶，并且与P53复合时，将它从胞核移出并使其泛素化，这促进p53蛋白经泛素-蛋白体 途径降解（Haupt 等人，Nature 1997, 387 (6630) :296-299 ;Piette 等人，Oncogene 1997 15(9) : 1001-1010)。此外，通过与p53反式激活结构域结合，MDM2直接抑制p53的活性，还 阻止p53介导的基因表达（Wu等人，Genes Dev. 1993,7:1126-1132)。因此，MDM2以多种方 式调节p53。
[0005] MDM2在许多癌例如脂肪肉瘤、胶质母细胞瘤和白血病中过量表达（Momand等 人，Nucleic Acids Res. 1998, 26(15) :3453-3459) QMDM2 的过量表达能干扰p53 的活性，从 而阻止肿瘤的凋亡和生长停滞（de Rozieres等人，Oncogene 2000, 19 (13): 1691-1697)。 MDM2过量表达与神经胶质瘤和急性淋巴细胞性白血病的不良预后相关（Onel等人，Mol. Cancer Res. 2004, 2(1):1-8)〇
[0006] 由于MDM2是p53的抑制剂，阻止MDM2与p53结合的治疗剂将防止p53降解，从 而允许游离P53在癌细胞中结合并介导基因表达，导致细胞周期停滞和凋亡。先前报道了 P53-MDM2 相互作用的小分子抑制剂（Vassilev 等人，Science, 2004, 303(5659) :844-888 ; Zhang 等人，Anticancer drugs, 2009 20 (6) :416-424 ;Vu 等人，Curr. Topics Microbiol. Immuno.，2011，348:151-172)。也已知这些化合物结合模式和人MDM2 -Nutlin复合物的晶 体结构以及MDM2上p53结合位点的支架和口袋（Vassilev，上文）。这类MDM2抑制剂的第 一种（称作Nutlin)结合MDM2并占据p53结合口袋，阻止MDM2-p53复合物形成。这导致 P53蛋白较少降解和p53靶基因的表达。用Nutlin处理的癌细胞系显示生长停滞和凋亡增 加。例如，SJSA-I骨肉瘤系含有MDM2基因的扩增拷贝。用Nutlin-3处理这个细胞系减少 增殖并增加凋亡（Vassilev 等人，Science, 2004, 303(5659) :844-888)。SJSA-I 细胞系在小 鼠中用于产生异种移植物。Nutlin-3的施用减少异种移植物生长90%。为了调查Nutlin 化合物对非癌细胞所拥有的作用，将人和小鼠的正常成纤维细胞用Nutlin-3处理，并且尽 管细胞增殖减慢，但它们保留其活力（Vassilev，上文）。
[0007] 找到指示哪位患者应当接受治疗剂的生物标志物是有用的，特别对癌症而言。与 试错法相比，这允许更及时和激进的治疗。此外，发现显示细胞在施用后持续对治疗敏感的 生物标志物也是有用的。这些生物标志物可以用来监测接受治疗剂的那些患者的反应。如 果生物标志物显示患者已经变得对治疗不敏感，则可以增加、减少、完全停用施用的剂量或 施用额外的治疗剂。因而，需要开发与MDM2抑制剂相关的生物标志物。这种方法确保正确 的患者接受适宜治疗并且在治疗过程期间可以对患者监测持续的MDM2抑制剂敏感性。
[0008] 在开发MDM2抑制剂时，特定生物标志物将有助于理解施用时的作用机制。这种作 用机制可能涉及细胞周期方面的复杂调节机制级联和差异性基因表达。这项分析在药物开 发的前临床阶段进行，以确定癌细胞对候选MDM2抑制剂的具体敏感性和候选物的活性。药 效学研宄中特别有意义的是鉴定特定的敏感性和活性标志物，如本文中公开的那些。
[0009] 发明简沐
[0010] 本发明涉及以下分析：表2中鉴定的许多基因在确定细胞对MDM2抑制剂（下文称 作"MDM2i"）的敏感性方面充当特定生物标志物。本发明涉及以下分析：表2中的至少一 种生物标志物提供MDM2i的"基因标签"，所述基因标签在预测哪些癌细胞对MDM2i敏感方 面具有增加的准确度和特异性。该方法在取自患者的癌样品中分析表2中至少一种生物标 志物的基因表达或蛋白质水平，这预测了癌样品对MDM2i的敏感性。表达水平变化的模式 可以指示有利反应或不利反应。此外，表2中提供的基因标签具有增加的预测值，因为它还 指示P53通路有功能。这是出乎意料的结果，因为许多肿瘤含有突变型p53和为肿瘤提供 生长优势的无功能通路。本发明是"个体化医疗"的例子，其中患者基于对该个体特异性的 功能性基因组标签接受治疗。
[0011] 表2中至少一种生物标志物的预测值也可以在用MDM2i治疗后使用以确定患者是 否仍对治疗敏感。一旦已经施用MDM2i治疗剂，则生物标志物用来监测患者对MDM2i治疗 的持续敏感性。本公开还涉及上调或下调MDM2i治疗后所鉴定基因的表达。这可用于确定 患者接受了正确的治疗过程。本发明包含一种预测和监测患者对MDM2i治疗的敏感性的方 法。该方法包括步骤：向患者施用MDM2i并对从患者获得的生物样品测量生物标志物基因 表达。基于检测来自表2的至少一种生物标志物的基因表达评价患者的反应。检出至少一 种生物标志物的表达水平和/或其改变指示患者对治疗的敏感性。表达水平的模式可以指 示患者有利反应或不利反应。
[0012] 附图简沐
[0013] 图IA显示MDM2i在破坏p53-MDM2相互作用方面的体外效力。图IB显示MDM2i 在癌细胞增殖方面的体外效力。
[0014] 图2显示p53状态（突变型或野生型）和癌细胞对MDM2i (2)的敏感性。X轴是敏 感性的交叉点并且Y轴是Amax值。图2表明细胞对MDM2i (2)的敏感性和p53突变状态， mt (突变型）或野生型（wt)。mt组显示p53突变型CCLE细胞系的MDM2i⑵敏感性图，wt 组显示p53野生型CCLE细胞系的MDM2i (2)敏感性图。Amax定义为最大效应水平（对参照 抑制剂校准，在检验的最高MDM2i (2)浓度时的抑制作用），并且IC5tl定义为MDM2i (2)反应 相对于参照抑制剂达到-50绝对抑制作用时的μ M浓度的IC50。细胞系计数按MDM2i (2) 化学敏感性和P53突变状态，以及相关的统计划分。数据还显示为具有相关统计的列联表。
[0015] 图3是显示表达倍数变化的生物标志物和过量表达值的统计显著性。图3显示选 择的MDM2i化学敏感性预测性生物标志物和它们的相关统计结果。基因身份是官方HUGO 符号。'Expr'前缀表示这些生物标志物是转录物表达型的。
[0016] 图4是敏感和不敏感代表性细胞的Western印迹法，其中所述细胞用MDM2i⑴在 多种浓度处理4小时并且随后探测作为药效学生物标志物代表的选择的p53靶基因。
[0017] 图5是与较大生物标志物集合对比，显示基因标签的预测值增加的图。图5显示 MDM2i (2)化学敏感性预测模型的交叉验证性能。使用灵敏度（正确预测的敏感细胞系的分 数）、特异性（正确预测的不敏感细胞系的分数）、PPV(正预测值，如此预测的敏感细胞系 的分数）和NPV (负预测值、如此预测的不敏感细胞系的分数），评价从三个预测性特征集合 衍生的模型的性能。误差条是5次重复的5倍交叉验证范围内均值的一个标准偏差。使用 表2中所示的13种所选择生物标志物的模型实现对MDM2i (2)化学敏感性的更好预测，并 且这与性能度量无关，但是当将PPV视为性能指示物时最醒目。
[0018] 图6是各自分析其基因标签的一列细胞系和所述细胞系是否敏感或不敏感的预 测以及用MDM2i处理时的IC5Q。
[0019] 图7A-C显示用MDM2i (1)处理后SJSA-I异种移植模型（由基因标签预测为敏感） 中肿瘤生长的剂量-依赖性抑制作用，和作为代表性药效学生物标志物的p21 (CDKNlA)表 达的伴随诱导。
[0020] 图8显示以有效剂量处理MDM2i(l)敏感细胞后p21 (CDKNlA)在蛋白质水平的表 达。
[0021] 图9是使用OncExpress数据库和Primary Tumor Bank中的基因标签被预测为敏 感的肿瘤样品的模型。图9显示MDM2i化学敏感性预测在人原发肿瘤集合和CCLE细胞系 数据中的谱系特异相关性。左小图显示在自人原发肿瘤样品集合的预测敏感的样品的分数 和细胞系数据中观察到的敏感性比率之间的相关性。右小图显示在自人原发肿瘤样品集合 的预测敏感的样品的分数和原发肿瘤异种移植物集合中预测敏感的比率之间的相关性。样 品/异种移植物/细胞系按谱系组织。短划线是身份系。
[0022] 图10表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合建立的MDM2i (2)敏感性预测 模型所实现的正预测值（PPV)。图10显示通过从生物标志物多个组合建立的MDM2i (2)敏 感性预测模型所实现的正预测值（PPV)。
[0023] 组合和单-基因模型PPV显示为箱线图并且与通过两个p53突变状态和13个生 物标志物模型给出的PPV比较（须延长1. 5倍四分位距，黑线是中位数，凹槽是中位数置 信区间的估计值，箱宽度与数据点的数目成比例，不显示离群值；'bm(s'）：生物标志物； 'allExMt' ：p53全部外显子突变模型；'ex5to8mt' ：p53外显子5至8突变模型）。
[0024] 图11表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合建立的MDM2i (2)敏感性预测 模型所实现的特异性。图11显示通过从生物标志物多个组合建立的MDM2i (2)敏感性预测 模型所实现的特异性。组合和单-基因模型特异性显示为箱须图并且与通过两个P53突变 状态和13个生物标志物模型给出的PPV比较（须延长1. 5倍四分位距，黑线是中位数，凹 槽是中位数置信区间的估计值，箱宽度与数据点的数目成比例，不显示离群值；'bm(s'）： 生物标志物；'allExMt' ：p53全部外显子突变模型；'ex5to8mt' ：p53外显子5至8突变模 型）。
[0025] 图12表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合建立的MDM2i (2)敏感性预测 模型所实现的灵敏度。图12显示通过从生物标志物多个组合建立的MDM2i (2)敏感性预测 模型所实现的灵敏度。组合和单-基因模型灵敏度显示为箱须图并且与通过两个P53突变 状态和13个生物标志物模型给出的PPV比较（须延长1. 5倍四分位距，黑线是中位数，凹 槽是中位数置信区间的估计值，箱宽度与数据点的数目成比例，不显示离群值；'bm(s'）： 生物标志物；'allExMt' ：p53全部外显子突变模型；'ex5to8mt' ：p53外显子5至8突变模 型）。
[0026] 图13表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合连同p53突变状态一起建立 的MDM2i敏感性预测模型所实现的PPV。图13显示通过从生物标志物与p53突变状态组 合建立的MDM2i (2)敏感性预测模型所实现的正预测值（PPV)。关于图的说明，参考图10、 图11或图12 ; 'bm(s'）：生物标志物；'mt' ：p53外显子5至8突变；'allExMt' ：p53全部 外显子突变模型；'ex5to8mt' ：p53外显子5至8突变模型）。
[0027] 图14表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合连同p53突变状态一起建立 的MDM2i敏感性预测模型所实现的特异性。图14表示通过从生物标志物与p53突变状态 组合建立的MDM2i (2)敏感性预测模型所实现的特异性。关于图的说明，参考图10、图11或 图12 ; 'bm(s'）：生物标志物；'mt' ：p53外显子5至8突变；'allExMt' ：p53全部外显子突 变模型；'ex5to8mt' ：p53外显子5至8突变模型）。
[0028] 图15表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合连同p53突变状态一起建立 的MDM2i敏感性预测模型所实现的灵敏度。图15表示通过从生物标志物与p53突变状态 组合建立的MDM2i (2)敏感性预测模型所实现的灵敏度。关于图的说明，参考图10、图11或 图12 ; 'bm(s'）：生物标志物；'mt' ：p53外显子5至8突变；'allExMt' ：p53全部外显子突 变模型；'ex5to8mt' ：p53外显子5至8突变模型）。
[0029] 图16是显示人原发性异种移植模型对MDM2i (1)的反应和它们的预测敏感性/不 敏感性的图。图16表示使用表2中公开的生物标志物时据预测对MDM2i敏感的人原发性 异种移植模型经证实对每日给药l〇〇mg/kg MDM2i(l)敏感，从而支持所述预测模型用于癌 症患者群体中（HMEX =黑色素瘤；HCOX =结直肠癌；HSAX =脂肪肉瘤；HKIX =肾细胞癌； CHLI或HLIX =肝癌；HBRX =乳腺癌；HPAX =胰腺癌；HLUX =肺癌）。
[0030] 图17是显示针对野生型P53预先选择并且随后被预测为敏感/不敏感的人原 发性异种移植模型对MDM2i(l)的反应的图。图17显示使用表2中公开的生物标志物时 据预测对MDM2i敏感的野生型p53人原发性异种移植模型经证实对每日给药100mg/kg MDM2i(l)敏感，从而支持所述预测模型用于野生型p53预先选择的癌症患者群体中（HMEX =黑色素瘤；HCOX =结直肠癌；HSAX =脂肪肉瘤；HKIX =肾细胞癌；CHLI =肝癌；HPAX = 胰腺癌；HLUX =肺癌）。
[0031] 发明概沐
[0032] 本发明的各方面、特征和实施方案总结于以下项中并且可以分别单独或按组合使 用：
[0033] 1. -种预测癌症患者对人双微体2抑制剂（MDM2i)治疗的敏感性的方法，所述方 法包括：测量从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且 至少一种生物标志物的基因表达表示该患者对MDM2i治疗敏感。
[0034] 2. -种治疗癌症患者的方法，包括：测量从该患者获得的癌样品中选自表2的至 少一种生物标志物的基因表达；确定该患者对MDM2i的敏感性；并且向该患者施用MDM2i。
[0035] 3. -种治疗癌症患者的方法，包括测定从该患者获得的癌样品中选自表2的至少 一种生物标志物的基因表达；至少一种生物标志物的存在显示该患者对MDM2i的敏感性； 并且向该患者施用MDM2i。
[0036] 4. -种预测癌细胞对人双微体2抑制剂（MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括： 测定从患者癌样品获得的癌细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且选自 表2的至少一种生物标志物的基因表达表示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
[0037] 5. -种预测癌细胞对人双微体2抑制剂（MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括： 测量细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；并且选自表2的至少一种生物标 志物的基因表达表示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
[0038] 6. -种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括：
[0039] a)使细胞与MDM2i候选物接触；
[0040] b)测量与MDM2i候选物接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表 达，并且至少一种生物标志物的表达显示对MDM2i的敏感性；和
[0041 ] c)将来自与MDM2i候选物接触的细胞的细胞增殖减少与接触于取自表1的MDM2i 的细胞的细胞增殖和未处理或安慰剂处理的细胞的细胞增殖的减少比较。
[0042] 7. -种确定癌细胞对人双微体2抑制剂（MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括： a)使癌细胞与至少一种MDM2i接触；b)测量与MDM2i接触的细胞中选自表2的至少一种生 物标志物的基因表达；c)将用至少一种MDM2i处理的癌细胞的细胞增殖与未处理或安慰剂 处理的癌细胞的细胞增殖比较，其中与未处理或安慰剂处理的癌细胞相比时，存在处理的 癌细胞的细胞增殖减少。
[0043] 8.项1至项7中任一项的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
[0044] 9.项1或项8的方法，其中至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至 少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或全部13种生物标志物选 自表2。
[0045] 10.项1至项9中任一项的方法，其中选择p53作为除选自表2的任何生物标志物 之外的生物标志物。
[0046] 11.项1至项10中任一项的方法，包括生物标志物MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B 和 / 或 AEN。
[0047] 12.项1至项11中任一项的方法，其中比较至少一种生物标志物的基因表达与对 照样品的基因表达指示有功能的P53基因通路。
[0048] 13.根据1至项4或项8至项12中任一项的方法，其中癌样品选自乳房、肺、胰脏、 卵巢、中枢神经系统（CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮 肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
[0049] 14.项1至项13中任一项的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白 质。
[0050] 15.项1、项2或项5至项11中任一项的方法，其中与对照相比，在癌样品中至少 一种生物标志物的表达增加。
[0051] 16.项1至项15中任一项的方法，其中MDM2i选自表1。
[0052] 17.项1至项16中任一项的方法，其中MDM2i是与MDM2的p53结合口袋结合的化 合物。
[0053] 18.项1至项16中任一项的方法，其中MDM2i是与来自表1的Nutlin-3a或MDM2i 结合基本上相同的MDM2的p53结合口袋的化合物。
[0054] 19.项1至项18中任一项的方法，其中MDM2i是阻止p53和MDM2之间蛋白质-蛋 白质相互作用的化合物。
[0055] 20.项1至项19中任一项的方法，其中MDM2i是通过诱导p53通路活性抑制细胞 增殖的化合物。
[0056] 21.项2至项20中任一项的方法，还包括从施用MDM2i之前的患者获得生物样品。
[0057] 22.项2至项21中任一项的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
[0058] 23.项4至项14或项16至项22中任一项的方法，其中至少一种生物标志物的基 因表达在癌细胞中增加。
[0059] 24.项3至项5或项7至项23中任一项的方法，其中与至少一种MDM2i接触的癌 细胞的IC 5tl小于1 μ M。
[0060] 25.项3至项5或项7至项25中任一项的方法，其中细胞至少在两个不同时间点 与MDM2i接触。
[0061] 26.项3至项5或项7至项26中任一项的方法，其中细胞与两种不同的MDM2i接 触。
[0062] 27.项26的方法，其中在相同时间使细胞与两种不同的MDM2i接触。
[0063] 28.项26的方法，其中在不同时间点使细胞与两种不同的MDM2i接触。
[0064] 29.项1至项28中任一项的方法，其中MDM2i是异喹啉酮（isoquinolinone)。
[0065] 30. -种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括：a)使细胞与MDM2i候选物接 触；b)在与MDM2i候选物接触的细胞中测量选自表2的至少一种生物标志物的基因表达； c)至少一种生物标志物的基因表达指示对MDM2i的敏感性；和d)将来自与MDM2i候选物 接触的细胞的细胞增殖减少与接触取自表1的MDM2i的细胞的细胞增殖和未处理或安慰剂 处理的细胞的细胞增殖的减少比较。
[0066] 31.项30的方法，其中MDM2i候选物的基因表达与选自表1的MDM2i的基因表达 比较。
[0067] 32.项30或项31的方法，其中MDM2i候选物增加来自表2的至少1种、至少2种、 至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少 11种、至少12种或全部13种生物标志物的基因表达。
[0068] 33.项30至项32中任一项的方法，其中细胞是选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经 系统（CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、 肾、软组织肉瘤和胸膜的癌细胞。
[0069] 34.项30至项33中任一项的方法，其中测量表2的至少一种生物标志物的mRNA 或蛋白质的表达。
[0070] 35.项30至项34中任一项的方法，包括生物标志物MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0071] 36.包含MDM2i的组合物，用于治疗选择的癌症患者群体中的癌症，其中癌症患者 群体是基于从所述患者获得的癌细胞样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达 来选择的。
[0072] 37.项36的组合物，其中至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至 少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或全部13种生物标志物选 自表2。
[0073] 38.项36或项37的组合物，其中选择p53作为除选自表2的任何生物标志物之外 的生物标志物。
[0074] 39.项36至项38中任一项的组合物，其中生物标志物是MDM2、⑶KN1A、ZMAT3、 DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B 和 / 或 AEN。
[0075] 40.项36至项39中任一项的组合物，其中MDM2i选自表1。
[0076] 41.项36至项40中任一项的组合物，其中MDM2i是与MDM2的p53结合口袋结合 的化合物。
[0077] 42.项36至项41中任一项的组合物，其中MDM2i是与来自表1的Nutlin-3a或 MDM2i结合基本上相同的MDM2的p53结合口袋的化合物。
[0078] 43.项36至项42中任一项的组合物，其中MDM2i是阻止p53和MDM2之间蛋白 质-蛋白质相互作用的化合物。
[0079] 44.项36至项43中任一项的组合物，其中MDM2i是通过诱导p53通路活性抑制细 胞增殖的化合物。
[0080] 45.项36至项44中任一项的组合物，其中MDM2i是异喹啉酮
[0081] 46.项36至项45中任一项的组合物，其中癌细胞样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中 枢神经系统（CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色 素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
[0082] 47.项36至项46中任一项的组合物，其中患者基于以下生物标志物的基因表达来 选择：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0083] 48.项36、项37或项39至项47中任一项的组合物，用于治疗选择的癌症患者群 体中的癌症，其中癌症患者群体选自野生型P53预先选择的癌症患者群体。
[0084] 49. -种预测癌症患者对人双微体2抑制剂（MDM2i)治疗的敏感性的试剂盒，所述 试剂盒包含：i)用于检测来自表2的任一种生物标志物的表达，优选地多于一种，特别地至 少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10 种、至少11种、至少12种或全部13种选自表2的生物标志物的表达的工具；和ii)如何使 用所述试剂盒的说明书。
[0085] 50.项 49 的试剂盒，其中生物标志物是 MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、 BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B 或 / 和 AEN。
[0086] 51.项49或项50的试剂盒，还包含用于检测p53表达的工具。
[0087] 52.项49至项51的试剂盒的用途，用于项1至项32的任何方法。
[0088] 在一个方面，本公开提供在含有癌细胞的样品中分析表2中鉴定的至少一种生物 标志物的方法，其中至少一种生物标志物的表达指示癌细胞是否将对MDM2i治疗敏感。表 达变化的模式可以指示有利患者反应或不利患者反应并且可以基于来自表2的至少一种 生物标志物的表达选择或拒绝患者。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合 被测定。
[0089] 在MDM2i治疗后，本公开提供在含有癌细胞的样品中分析表2中鉴定的至少一种 生物标志物的方法，其中MDM2i治疗后该生物标志物的表达指示患者仍然对MDM2i治疗敏 感。检出至少一种生物标志物的表达水平和/或其改变指示MDM2i敏感性，并且这与患者 对治疗的反应相关。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合被测定。表达的 模式可以指示患者有利反应或不利反应。
[0090] 因此，本公开提供一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂（MDM2i)治疗的敏感性 的方法，所述方法包括：测定从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的 基因表达；并且至少一种生物标志物的基因表达指示该患者对MDM2i治疗敏感。
[0091] 所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
[0092] 所述的方法，包括测定以下生物标志物的基因表达：MDM2、⑶KN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0093] 所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变 的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
[0094] 所述的方法，其中癌样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、子宫内 膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸 膜。
[0095] 所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
[0096] 所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
[0097] 所述的方法，其中MDM2i选自表1。
[0098] -种治疗癌症患者的方法，包括：测定从患者获得的癌样品中选自表2的至少一 种生物标志物的基因表达；至少一种生物标志物的存在指示患者对MDM2i敏感；并且向患 者施用MDM2i。
[0099] 所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
[0100] 所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、 BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0101] 所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变 的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
[0102] 所述的方法，还包括从施用MDM2i之前的患者获得生物样品，并且将MDM2i未治疗 的癌样品与MDM2i治疗的癌样品中来自表2的至少一种生物标志物的差异性基因表达比 较，其中增加的基因表达指示持续的患者敏感性。
[0103] 所述的方法，其中癌样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、子宫内 膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸 膜。
[0104] 所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
[0105] 所述的方法，其中MDM2i选自表1。
[0106] 所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
[0107] -种预测癌细胞对人双微体2抑制剂（MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：测 定从患者样品获得的癌细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且选自表2 的至少一种生物标志物的基因表达指示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
[0108] 所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
[0109] 所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、 BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0110] 所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变 的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
[0111] 所述的方法，其中癌样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、子宫内 膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸 膜。
[0112] 所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
[0113] 所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
[0114] 所述的方法，其中MDM2i选自表1。
[0115] 所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
[0116] -种确定癌细胞对人双微体2抑制剂（MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：a) 使癌细胞与至少一种MDM2i接触；b)测量与MDM2i接触的细胞中选自表2的至少一种生物 标志物的基因表达，并且至少一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和c)比较用 至少一种MDM2i处理的癌细胞与未处理或安慰剂处理的癌细胞的细胞增殖；其中与未处理 或安慰剂处理的癌细胞相比时，存在处理的癌细胞的减少的细胞增殖。
[0117] 所述的方法，其中与至少一种MDM2i接触的癌细胞的减少的细胞增殖具有小于 1 μΜ 的 IC50。
[0118] 所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
[0119] 所述的方法，其中MDM2i选自表1。
[0120] 所述的方法，其中在至少两个不同时间点使细胞与MDM2i接触。
[0121] 所述的方法，其中在步骤a)使细胞与两种不同的MDM2i接触。
[0122] 所述的方法，其中在相同时间使细胞与两种不同的MDM2i接触。
[0123] 所述的方法，其中在不同时间点使细胞与两种不同的MDM2i接触。
[0124] 所述的方法，其中癌细胞选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、子宫内 膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸 膜。
[0125] 所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
[0126] 所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、 BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0127] 所述的方法，其中在选自以下的时间点重复步骤b)和c):施用每剂量的MDM2i后 的4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周、1月和几个月。
[0128] 一种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括：a)使细胞与MDM2i候选物接触；b) 测量与MDM2i候选物接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少 一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和c)将来自与MDM2i候选物接触的细胞的 细胞增殖减少与接触取自表1的MDM2i的细胞的细胞增殖和未处理或安慰剂处理的细胞的 细胞增殖的减少比较。
[0129] 所述的方法，其中测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、 BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0130] 所述的方法，其中MDM2i候选物增加表2的至少一种生物标志物的基因表达。
[0131] 所述的方法，其中细胞是选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、子宫内 膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸 膜的癌细胞。
[0132] 所述的方法，其中测量表2的至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质的表达。
[0133] 所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、 BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0134] 包含MDM2i的组合物，用于治疗选择的癌症患者群体中的癌症，其中癌症患者群 体是基于从所述患者获得的癌细胞样品中显示选自表2的至少一种生物标志物的基因表 达来选择的。
[0135] 所述的组合物，其中癌细胞样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、子 宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤 和胸膜。
[0136] 所述的组合物，其中患者基于以下生物标志物的基因表达来选择：MDM2、⑶KN1A、 ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
[0137] -种预测癌症患者对人双微体2抑制剂（MDM2i)治疗的敏感性的试剂盒，所述试 剂盒包含：
[0138] i)用于检测以下生物标志物表达的工具：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、 RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B 和 AEN ;和 ii)如何使用所述试剂盒的 说明书。
[0139] 所述的试剂盒的用途，用于上述列出的任何方法。
[0140]
[0141] 除非上下文明确说明，如说明书和权利要求中所用，单数形式"a"、"an"和"the" 包括复数参考。例如，术语"细胞"包括多个细胞，包括其混合物。
[0142] 所有的数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围均是近似值，其以 〇. 1的增量（+)或（_)变化。应理解，尽管不总是明确说明，所有数字名称前面具有术语 "约"。还应理解，尽管不总是明确说明，本文描述的试剂仅是示例性的并且其等同物为本领 域所知。
[0143] 术语"标志物"或"生物标志物"在本文中互换地使用。生物标志物是核酸或多肽， 并且该核酸或多肽的存在、不存在或差异性表达用来确定对任何MDM2i的敏感性。例如， ⑶KNlA是一种生物标志物。
[0144] "MDM2"指介导p53泛素化、允许p53核输出并触发p53降解的E3泛素-蛋白 质连接酶。除非另外特别声明，否则，如本文所用的MDM2指人MDM2登录号NM_002392/ NP_002383(SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2)〇
[0145] "p53"指肿瘤抑制蛋白并指人p53(p53登录号：DNA-NM_000546,蛋白 质-NP_000537)。
[0146] 当表2中公开的至少一种生物标志物差异性表达时，细胞对采用MDM2i抑制"敏 感"或显示"敏感性"。备选地，当表2中公开的全部生物标志物作为一个集合差异性表达 时，细胞对采用MDM2i抑制"敏感"。在一个实施方案中，当MDM2i减少细胞增殖的IC 5tl小于 10 μ M，优选地小于1 μ M时，细胞"敏感"或显示"敏感性"，或"对敏感治疗"。
[0147] "对照细胞"、"对照组织"和"对照样品"指基线对照，或分别指癌细胞、组织或样 Βαπ，即其对MDM2i不敏感（即MDM2i减少细胞增殖的IC5tl大于10 μΜ ;或当"敏感"用MDM2i 减少细胞增殖的IC50小于1 μ M定义时，则"不敏感""指MDM2i减少细胞增殖的IC5tl大于 1 μΜ) 〇
[0148] "正常样品""指非癌组织或细胞。
[0149] 术语"核酸"和"多核苷酸"可以互换使用并且指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任 何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段（例如，探针、引物、EST或SAGE 标签）、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、 分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针，和引 物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可 以在多聚体组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中 断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。所述术语还指双链 和单链分子。除非另外指明或要求，本发明的任何多核苷酸的实施方案包括双链形式和已 知的或预测构成双链形式的两条互补的单链形式的每一条链。
[0150] "基因"指含至少一个可读框（ORF)的多核苷酸，其在转录和翻译后能编码特定的 多肽或蛋白质。能将多核苷酸序列用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。 分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
[0151] "基因表达"或备选地"基因产物"指基因转录和翻译时产生的核酸或氨基酸（例 如，肽或多肽）。
[0152] 术语"多肽"可与术语"蛋白质"互换使用，并在广义上指两个或多个亚基氨基酸 (subunit amino acid)的化合物、氨基酸类似物或拟肽。亚基能通过肽键连接。在另一个 实施方案中，亚基可以通过其他键，例如酯、醚等连接。
[0153] 如本文中所用，术语"氨基酸"指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，以及 D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链很短，那么通常将三个或三个以上氨基 酸的肽称为寡肽。如果肽链很长，那么通常将肽称为多肽或蛋白质。
[0154] 术语"分离的"意为是自天然状态下与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段 通常相关的组分、细胞组分及其他分离的。例如，分离的多核苷酸与在自然或天然环境，例 如在染色体上通常与其相关的3'和5'连续核苷酸分离。本领域技术人员显而易见的是， 非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要"分离"，以将其与其天然 存在的对应物区分开来。此外，"浓缩的"、"分离的"或"经稀释的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白 质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开来，因为与天然存在的对应物相比，每一 体积的浓缩物或者分子数在"浓缩的"形式中更多或者在"分离的"形式中更少。在一级序 列或者例如糖基化模式上不同于天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或 其片段并不需要以分离形式存在，因为可以通过一级序列或者备选地，通过另一特征如糖 基化模式与其天然存在的对应物区分开来。因此，将非天然存在的多核苷酸提供为不同于 分离的天然存在的多核苷酸的单独实施方案。将在细菌细胞中产生的蛋白质提供为区别于 从真核细胞分离的天然存在的蛋白质的单独实施方案，其中在天然状态下所述真核细胞产 生所述蛋白质。
[0155] 当在多核苷酸操作的上下文中使用时，"探针"指寡核苷酸，其提供为通过与靶标 杂交，检测可能存在于目的样品中的靶标的试剂。通常，探针包含标记或者杂交反应之前或 之后标记可以结合的方法。合适的标记包括但不限于，放射性同位素、荧光色素、化学发光 化合物、染料和蛋白质包括酶。
[0156] "引物"是通常具有游离的3' -OH基的短的多核苷酸，其通过与靶标杂交，与目的 样品中可能存在的靶标或"模板"结合，从而促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。"聚合酶 链反应"（"PCR"）是这样的反应：使用由"上游"和"下游"引物组成的"一对引物"或"一 套引物"，聚合的催化剂如DNA聚合酶以及一般热稳定聚合酶，复制组成靶多核苷酸的拷贝。 PCR方法是本领域熟知的，并且例如在PCR :A Practical Approach，M. MacPherson等人， IRL Press at Oxford University Press (1991)中教导。产生多核苷酸的复制拷贝的全部 过程，例如PCR或基因克隆在本文中总称为"复制"。还可以将引物用作杂交反应，例如DNA 或 RNA 印迹分析中的探针（Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 二版（1989))。
[0157] 如本文中所用，"表达"指DNA转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成 肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA 的剪接。
[0158] 当将"差异表达"应用于基因时，指从该基因转录和/或翻译的mRNA或者由该基 因编码的蛋白质产物的差异产生。与对照细胞的表达水平相比，差异表达基因可以是过表 达或者低表达（underexpress)。然而，如本文所用，过表达是基因表达的增加并且一般是在 对照对应物细胞或组织中检测到的至少1. 25倍或，备选地至少1. 5倍或，备选地至少2倍， 或备选地至少3倍或备选地，至少4倍表达。如本文所用，低表达是基因表达的降低并且一 般低于在对照对应物细胞或组织中检测到的至少1. 25倍或备选地，至少1. 5倍或备选地， 至少2倍或备选地，至少3倍或备选地，至少4倍表达。术语"差异表达的"还指其中在癌 细胞或癌组织中检测到表达并且该表达存在，但在对照细胞中不能检测到表达。
[0159] 由于基因的过量表达或基因拷贝数目的增加可以出现基因的高表达水平。由于负 调节物的失调或缺失，基因还可以被翻译至增加的蛋白质水平。。
[0160] "基因表达谱"指至少一个生物标志物的表达模式，其在多个样品中重现并且反映 那些样品共有的性质，如组织类型、对特定治疗的反应、或细胞中特定生物学过程或通路的 激活。此外，基因表达谱区分共有共同性质的样品和没有共同性质的那些样品，这比通过将 样品随机分配成两组实现的准确性更高。基因表达谱可以用于预测未知状态的样品是否共 有共同的性质。将预测至少一种生物标志物的水平和典型谱之间的一些变异，但是表达水 平与典型谱的整体相似性是这样的，在不共有表达谱反映的共同性质的样品中偶然观察到 相似性在统计学上是不太可能。
[0161] 术语"cDNA"指互补DNA，即用酶如逆转录酶将细胞或生物中存在的mRNA分子制 备成cDNA。"cDNA"文库是细胞或生物中存在的全部mRNA分子的集合，用逆转录酶将所述 mRNA全部转变成cDNA分子，然后插入到"载体"（在添加外源DNA后可以继续复制的其他 DNA分子）中。用于文库的示例性载体包括噬菌体、感染细菌的病毒，如λ噬菌体。然后可 以针对特定的目的cDNA (和由此得到的mRNA)探测文库。
[0162] 如本文中所用，可互换使用的"固相支持物"或"固相支持体"并不限于特定类型的 支持体。相反，本领域普通技术人员可以获得并且已知大量的支持体。固相支持体包括硅 胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、塑料珠、氧化铝凝胶、微阵列和芯片。如本文中所用，"固 相支持体"还包括合成的抗原呈递基质、细胞和脂质体。基于期望的最终用途和不同方案的 适用性，可以选择合适的固相支持体。例如，对于肽合成，固相支持体可以涉及树脂，例如聚 苯乙稀（例如，获自 Bachem Inc. ,Peninsula Laboratories 的 ΡΑΜ-r 树脂）、polyHIPE(R) ?树脂（获自Aminotech，加拿大）、聚酰胺树脂（获自Peninsula Laboratories)、用聚乙 二醇嫁接（graft)的聚苯乙稀树脂（TentaGelR?，Rapp Polymere，Tubingen，德国）或者聚 二甲基丙稀酰胺树脂（获自 Milligen/Biosearch，California)。
[0163] 还可以将多核苷酸与固相支持体连接，用于高通量筛选测定。例如，PCT WO 97/10365公开了高密度寡核苷酸芯片的构建。也参见，美国专利No. 5, 405, 783 ;5, 412, 087 和5, 445, 934。使用该方法，在衍生的玻璃表面上合成探针，以形成芯片阵列。将光保护的 核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性去保护，并与第二个所保护 的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
[0164] 作为实例，通过使用基因芯片如Affymetrix? HG-U133-Plus-2GeneChips来测 量信使RNA的水平，可以评估转录活性。因此，在可重复的系统中，有可能高通量、实时定量 大量目的基因的RNA。
[0165] 术语"严格杂交条件"指这样的条件，在所述条件下核酸探针可以与其靶序列特异 性杂交，而不与其他序列杂交。确定杂交的严格性的条件包括：温度、离子强度和变性剂如 甲酰胺的浓度。改变这些因素之一会影响另一因素，并且本领域技术人员理解，可以改变条 件以维持期望的严格水平。高度严格杂交的实例是：65°C -68°C，0.015M氯化钠、0.0015M 柠檬酸钠或者42°C，0. 015M氯化钠、0. 0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺（参见Sambrook，上 文）。"中等严格"杂交的实例是条件：50°C -65°C，0. 015M氯化钠、0. 0015M柠檬酸钠或者 37°C -50°C，0. 015M氯化钠、0. 0015M柠檬酸钠和20%甲酰胺。当期望适量的核酸错配时， 使用中等严格条件。本领域技术人员理解，洗涤是杂交条件的一部分。例如，洗涤条件可以 包括02.X-0. IX SSC/0. 1%SDS和42°C_68°C的温度，其中增加温度增加了洗涤条件的严格 性。
[0166] 当在两条单链多核苷酸之间以反向平行构型发生杂交时，称该反应为"退火"，并 且将这些多核苷酸描述为"互补"。如果在第一多核苷酸的链之一和第二多核苷酸之间发生 杂交，那么双链多核苷酸与另一多核苷酸可以是"互补的"或者"同源的"。根据通常公认的 碱基配对规则，按照相对链中期望彼此形成氢键的碱基的比例，可以量化"互补性"或"同源 性"（一种多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度）。
[0167] 多核苷酸或多核苷酸区（多肽或多肽区）与另一序列具有"序列同一性"的确定 百分比（例如，80%、85%、90%、95%、98%或99%)指的是，当比对时，在比较的两个序列 中，碱基（或氨基酸）的百分比是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人，eds.，（1987) Supplement 30, section 7. 7. 18, Table7. 7. I中描述的那些程序进行这种比对并确定同源性和序列同一性百分比。 优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，并使用默认参数。特别地，优选的 程序是BLASTN和BLASTP，且使用以下的默认参数：遗传密码=标准；过滤=无；链=两条； 截断=60 ;期望值=10 ;Matrix = BL0SUM62 ;描述=50个序列；排序=高得分；数据库= 非冗余的。
[0168] 术语"细胞增殖性病症"应当包括表征为异常细胞生长和/或分裂或者功能丧失 的正常生理功能的调节异常。"细胞增殖性病症"的实例包括但不限于，增生、瘤形成、组织 转化或多种自身免疫病症，例如以T细胞凋亡的调节异常为特征的那些疾病。
[0169] 如本文中所用，术语"赘生性细胞"、"肿瘤性疾病"、"瘤形成"、"肿瘤"、"肿瘤细胞"、 "癌症"、"癌细胞"（可互换使用）指表现出相对自主生长的细胞，以致它们表现出以细胞增 殖控制（即，下调细胞分裂）的显著丧失为特征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性 的或者良性的。"转移的细胞或组织"指的是细胞可以侵入并破坏邻近的机体结构。
[0170] 术语"癌症"指癌疾病，例如包括乳腺、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、子宫内 膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸 膜的癌疾病。
[0171] 术语"PBMC"指外周血单核细胞，并包括"PBL外周血淋巴细胞。
[0172] "抑制"肿瘤生长表示当与未与MDM2i化合物接触的肿瘤生长相比，与MDM2i接 触时肿瘤细胞生长的降低。可以通过本领域已知的任何方法评估肿瘤细胞生长，其包 括但不限于测量肿瘤大小、使用3H-胸苷掺入测定法确定肿瘤细胞是否正在增殖、通过 FDG-PET(氟代脱氧葡萄糖正电子成像术）成像测量葡萄糖吸收、或者计数肿瘤细胞。"抑 制"肿瘤细胞生长指的是以下状态的任一种或者全部：减缓、延迟和终止肿瘤生长，以及肿 瘤缩小。
[0173] "组合物"是活性剂和另一载体的组合，所述载体例如惰性的（例如，可检测的试剂 或标记）或者有活性的化合物或组合物，如佐剂、稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂 溶剂、防腐剂、辅助剂等。载体还可以包含单独的或者组合的按重量或体积为1-99. 99%的 药物赋形剂和添加剂，例如：可以单独或者组合存在的蛋白质、肽、氨基酸、脂和糖（例如， 糖，包括单糖和寡糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物）。糖赋 形剂包括例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗 糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如 甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。
[0174] 示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白（HSA)、重组人白蛋白 (rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲容量中发挥功能的代表性氨基酸/抗体组分包括丙 氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
[0175] 术语"载体"还包括缓冲剂或pH调整剂；一般地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的 盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙 酸或苯二甲酸的盐；Tris、氨丁三醇盐酸盐（tromethamine hydrochloride)或磷酸盐缓冲 液。其他载体包括聚合的赋形剂/高分子添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖（聚合的糖）、 葡聚糖结合剂（例如，环糊精，如2-轻丙基-正交（quadrature)-环糊精）、聚乙二醇、调味 剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂（例如，聚山梨醇酯如TWEEN 20? 和TWEEN 80?)、脂（例如，磷脂、脂肪酸）、类固醇（例如，胆固醇）和螯合剂（例如，EDTA)。
[0176] 如本文中所用，术语"可药用载体"包括任一种标准的可药用载体，例如磷酸缓冲 盐水溶液、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及多种类型的润湿剂。组合物还可以包 括稳定剂和防腐剂，以及可应用于体内的任何上述载体。载体、稳定剂和佐剂的实例参见 Remington? s Pharmaceutical Science.，15th Ed. (Mack Publ. Co.，Easton (1975)和 the Physician' s Desk Reference, 52nd ed·，Medical Economics, Montvale, N. J. (1998)中。
[0177] "有效量"是足以实现有益或期望结果的量。可以在一次或多次施用或应用或给药 时施用有效量。
[0178] "受试者"、"个体"或"患者"在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选地哺乳动 物，更优选地人类。哺乳动物包括但不限于，小鼠、猿猴、人、家畜、运动动物和宠物。
[0179] 如本文所用的MDM2的"抑制剂"减少了 p53与MDM2的结合。该抑制可以包括，例 如，在它们结合到一起之前减少P53与MDM2的结合，或在它们结合到一起之后减少p53与 MDM2的结合，因此释放两个分子。
[0180] 现在已经将许多基因鉴定为MDM2i的生物标志物。存在本文中和表2中鉴定的一 个或多个生物标志物的基因表达的存在或减少或增加可以用来确定患者对任何MDM2i的 敏感性，例如，生物标志物的表达指示癌症患者对MDM2i施用敏感并将有利地响应于MDM2i 施用。作为另一个例子，在MDM2i治疗后，可以获得患者样品并且可以对样品测定敏感性以 发现患者是否仍然对MDM2i治疗敏感。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集 合被测定。
[0181] MDM2抑制剂（MDM2i)是这样的化合物，其作为p53-MDM2结合的抑制剂并且与本 发明方法或用途一起是有用的。MDM2i可用于其中指明了 p53-MDM2结合抑制的人用途或 兽医用途的药物组合物中，例如在治疗肿瘤和/或癌细胞生长时。特别地，这类化合物可 用于治疗人的癌症，因为这些癌症的进展可能至少部分地依赖于使P53的"看门人"功能 无效，例如MDM2过量表达。MDM2i化合物可用于例如治疗癌（例如，乳房、肺、胰脏、卵巢、 中枢神经系统（CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、 黑色素瘤癌、肾、软组织肉瘤和胸膜）。一系列示例性MDM2i化合物可见于表1中（参见 W02011076786)。表1中存在的MDM2i化合物属于异喹啉酮类分子。结合MDM2的p53结合口 袋、特别与Nutlin-3a结合基本上相同的MDM2的p53结合口袋、或者基本上结合来自表1的 示例性MDM2i所结合处的其他MDM2i也可以应用于本发明的方法或用途中。根据本发明实 施方案使用的MDM2i可以与表1中描述的MDM2i (即MDM2i(l)和MDM2i(2))或与Nutlin3a 在结构上相关（例如，取代的异喹啉酮，或喹唑啉酮）。本文中包括的方法也可以与其他化 合物如螺-轻网丨噪、咪挫基 11引噪和顺-咪挫啉一起使用（参见Shangary等人，Mol. Cancer Ther.20087(6):1533-1542:Furet 等人，BioOrg.Med. Chem. Let. 2012 22:3498-3502 和 Carol等人，Pediatr. Blood Cancer 2012第1-9页，在纳入期刊之前2012年7月2日在线 发表）。如本文所用的MDM2i通过诱导p53通路活性，阻止p53和MDM2之间的蛋白质-蛋 白质相互作用和/或抑制细胞增殖。
[0182] 表 l-MDM2i 化合物
[0183] MDM2i (1)
【权利要求】
1. 一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂（MDM2i)治疗的敏感性的方法，所述方法包 括：测定从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；并且至少 一种生物标志物的基因表达指示该患者对MDM2i治疗敏感。
2. 权利要求1所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
3. 权利要求1所述的方法，包括测定以下生物标志物的基因表达：MDM2、⑶KN1A、 ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
4. 权利要求1所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且 P53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
5. 权利要求1所述的方法，其中癌样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统（CNS)、 子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉 瘤和胸膜。
6. 权利要求1所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
7. 权利要求1所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
8. 权利要求1所述的方法，其中MDM2i选自表1。
9. 一种治疗癌症患者的方法，包括：测定从患者获得的癌样品中选自表2的至少一种 生物标志物的基因表达；并且至少一种生物标志物的存在指示患者对MDM2i敏感；并且向 患者施用MDM2i。
10. 权利要求9所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
11. 权利要求9所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、⑶KN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
12. 权利要求9所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并 且P53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
13. 权利要求9所述的方法，还包括从施用MDM2i之前的患者获得生物样品，并且将 MDM2i未治疗的癌样品与MDM2i治疗的癌样品中来自表2的至少一种生物标志物的差异性 基因表达比较，其中增加的基因表达指示持续的患者敏感性。
14. 权利要求9所述的方法，其中癌样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统 (CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软 组织肉瘤和胸膜。
15. 权利要求9所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
16. 权利要求9所述的方法，其中MDM2i选自表1。
17. 权利要求9所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
18. -种预测癌细胞对人双微体2抑制剂（MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括： 测定从患者样品获得的癌细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且选 自表2的至少一种生物标志物的基因表达指示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
19. 权利要求18所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
20. 权利要求18所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、⑶KN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
21. 权利要求18所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并 且P53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
22. 权利要求18所述的方法，其中癌样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统 (CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软 组织肉瘤和胸膜。
23. 权利要求18所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
24. 权利要求18所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
25. 权利要求18所述的方法，其中MDM2i选自表1。
26. 权利要求18所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
27. -种确定癌细胞对人双微体2抑制剂（MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括： a) 使癌细胞与至少一种MDM2i接触； b) 测量与MDM2i接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少 一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和 c) 比较用至少一种MDM2i处理的癌细胞与未处理或安慰剂处理的癌细胞的细胞增殖； 其中与未处理或安慰剂处理的癌细胞相比时，存在处理的癌细胞的减少的细胞增殖。
28. 权利要求27所述的方法，其中与至少一种MDM2i接触的癌细胞的减少的细胞增殖 具有小于1 μΜ的IC50。
29. 权利要求27所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
30. 权利要求27所述的方法，其中MDM2i选自表1。
31. 权利要求27所述的方法，其中在至少两个不同时间点使细胞与MDM2i接触。
32. 权利要求27所述的方法，其中在步骤a)使细胞与两种不同的MDM2i接触。
33. 权利要求27所述的方法，其中在相同时间使细胞与两种不同的MDM2i接触。
34. 权利要求27所述的方法，其中在不同时间点使细胞与两种不同的MDM2i接触。
35. 权利要求27所述的方法，其中癌细胞选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统 (CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软 组织肉瘤和胸膜。
36. 权利要求27所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
37. 权利要求27所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
38. 权利要求27所述的方法，其中在选自以下的时间点重复步骤b)和c):施用每剂量 的MDM2i后的4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周、1月和几个月。
39. -种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括： a) 使细胞与MDM2i候选物接触； b) 测量与MDM2i候选物接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并 且至少一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和 c) 将来自与MDM2i候选物接触的细胞的细胞增殖减少与接触取自表1的MDM2i的细胞 的细胞增殖和未处理或安慰剂处理的细胞的细胞增殖的减少比较。
40. 权利要求39所述的方法，其中测定以下生物标志物：MDM2、⑶KN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
41. 权利要求39所述的方法，其中MDM2i候选物增加表2的至少一种生物标志物的基 因表达。
42. 权利要求39所述的方法，其中细胞是选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系统 (CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软 组织肉瘤和胸膜的癌细胞。
43. 权利要求39所述的方法，其中测量表2的至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质的 表达。
44. 权利要求39所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、⑶KN1A、ZMAT3、DDB2、 FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN。
45. 包含MDM2i的组合物，用于治疗选择的癌症患者群体中的癌症，其中癌症患者群体 是基于从所述患者获得的癌细胞样品中显示选自表2的至少一种生物标志物的基因表达 来选择的。
46. 权利要求45所述的组合物，其中癌细胞样品选自乳房、肺、胰脏、卵巢、中枢神经系 统（CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、 软组织肉瘤和胸膜。
47. 权利要求45或46所述的组合物，其中患者基于以下生物标志物的基因表达来选 择：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESNl、CCNGl、XPC、TNFRSF10B 和 AEN0
48. -种预测癌症患者对人双微体2抑制剂（MDM2i)治疗的敏感性的试剂盒，所述试剂 盒包含： i) 用于检测以下生物标志物表达的工具：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、 BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B 和 AEN ;和 ii) 如何使用所述试剂盒的说明书。
49. 权利要求48所述的试剂盒的用途，用于权利要求1至37的任何方法。
【文档编号】G01N33/574GK104520714SQ201380041188
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年7月25日 优先权日:2012年7月31日
【发明者】S·高尔里斯, S·吉瑞 申请人:诺华股份有限公司