针对用于治疗疾病的mdm2抑制剂的生物标记的制作方法

专利名称：针对用于治疗疾病的mdm2抑制剂的生物标记的制作方法
技术领域：
本申请提供用MDM2抑制剂对患有白血病的受试者进行鉴别和治疗的方法。
背景技术：
进攻型癌细胞表型是导致细胞内信号传导途径失调的多种遗传变异和后生变异的结果。然而，所有癌细胞的共同点是它们不能执行细胞凋亡程序且由于正常细胞凋亡机制的缺陷而导致的适当细胞凋亡的缺乏是癌症的标志。因此，癌细胞由于正常细胞凋亡机制的缺陷而不能执行细胞凋亡程序的性质通常与对化学疗法、放射疗法或免疫疗法所引起的细胞凋亡的抗性增加相关。不同原因的人类癌症由于细胞凋亡缺陷而对目前治疗方案的原发性或获得性抗性是目前癌 症疗法中的主要问题。因此，目前和将来的努力方向是设计和开发新的分子靶标特异性抗癌疗法以提高癌症患者的存活和生命质量，所述努力必须包括以下策略:特异性地靶向于癌细胞对细胞凋亡的抗性。就此而言，靶向于在直接抑制癌细胞的细胞凋亡中发挥核心作用的关键负性调节蛋白，这代表了新的抗癌药物设计中非常有前景的治疗策略。p53肿瘤抑制基因在控制细胞周期进程和细胞凋亡中发挥核心作用且其是抗癌药物设计中引人关注的治疗靶标，这是因为其肿瘤抑制基因活性可被刺激以消灭癌细胞(Vogelstein等人，Nature 408:307(2000))。刺激p53活性的方法如下进行:使用非肽小分子抑制剂对P53与蛋白质MDM2的相互作用进行抑制。MDM2和p53是自调节反馈回路中的一部分且MDM2被p53所转录激活，然后MDM2通过至少三种机制来抑制p53的活性(Wu等人，Genes Dev.7:1126 (1993)。第一种机制，MDM2蛋白直接与p53反式激活域结合并由此抑制P53所介导的反式激活。第二种机制，MDM2蛋白含有核输出信号序列且一经与p53结合即诱导P53的核输出，这阻止p53与所靶向的DNA结合。第三种机制，MDM2蛋白是E3泛素连接酶且一经与p53结合即能够促进p53的降解。因此，MDM2通过作为p53活性的强效内源性细胞抑制剂而发挥作用来有效地抑制P53所介导的细胞凋亡、细胞周期停滞和DNA修复。因此，与MDM2结合并阻断MDM2和p53之间的相互作用的小分子抑制剂可在具有功能性p53的细胞中促进P53的活性并刺激p53所介导的细胞作用例如细胞周期停滞、细胞凋亡或DNA修复(Chene, Nat.Rev.Cancer 3:102(2003) ;Vassilev 等人，Science 303:844(2004))。目前正在寻求设计靶向于P53-MDM2相互作用的非肽小分子抑制剂，其是抗癌药物设计中引人关注的策略(Chene, Nat.Rev.Cancer 3:102(2003) ;Vassilev 等人，Science303:844(2004))。已通过X射线晶体学确定了该相互作用的结构基础(Kussie等人，Science 274:948(1996))。
fms样酪氨酸激酶(FTL3)是造血系统所涉及的第III类受体酪氨酸激酶(RTK)中的一种蛋白质(Rosnet, 0.等人，Genomics 9:380-385 (1991)) RTK在结构上具有含有五个免疫球蛋白样结构域的胞外区、一个近膜区(JM结构域)、被激酶插入域(KI结构域)所间隔的两个酪氨酸结构域(TKl和TK2)和C-末端结构域。FLT3的配体由骨髓中的基质细胞表达且以膜结合形式或可溶性形式存在。该配体独立地或与其它细胞因子一起刺激干细胞(Hannum，C.等人，Nature 368:643-648(1994))。因此，FL 和 FLT3 之间的配体-受体相互作用被认为在造血系统中发挥重要作用。通过FLT3抑制剂F1-700对突变体FLT3进行的抑制和同时通过MDM2抑制剂Nutlin-3对p53进行的激活所实现的细胞凋亡作用已被报道(Kojima, K.等人，Leukemia 24:33-43(2010))。在来自患有急性髓细胞性白血病(AML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL)的患者的大多数样本中观察到高水平的FLT3表达。在患有慢性髓细胞性白血病(CML)的患者中也发现高水平的FLT3表达。已知与AML细胞相比，FL较显著地刺激AML细胞的增殖(Piacibello1W.等人，Blood86:4105_4114(1995))。在AML患者中发现FLT3的体细胞突变(Nakao，M.等人，LeukemialO: 1911-1918· (1996))。就这些突变体而言，在FLT3基因对JM结构域进行编码的区域中发现内部串联重复(ITD)。重复的序列主要含有外显子11/12(现为外显子14-15)和内含子20 (尽管每种样品在长度上是变化的)且它们通常具有延长的JM结构域，而延长的JM结构域由于延长的框内可读框而在蛋白质中是可翻译的。在23%的AML患者中发现FLT3 内部串联重复(FLT3-1TD)突变(Kottaridis,P.D.等人，Blood 98:1752(2010))。成人AML中的治疗结果仍不是令人满意的且需要新颖的治疗方法来改善患病患者的预后。一种有前景的方法涉及通过使用对P53与MDM2的结合产生干扰的药物(MDM2抑制剂)对p53进行化学激活即一种诱导癌细胞凋亡的非遗传毒性方法。直接对p53与MDM2的结合产生干扰的多种化合物包括已开发出来的Nutlin类和MI系列的MDM2 抑制剂(Shangary, S.等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.105:3933-3938(2008)；Vassilev, L.T., Trends M0.1Med.13: 23-31 (2007) ；Vassi lev, L.T.等人，Science303:844-848(2004) ；Ding, K.等人，J.Med.Chem.49:3432-34352006 ；和 Shangary, S.等人，Clin.Cancer Res.14:5318-5324(2008))。目前可得到的证据表明，通过用Nutlin类或MI系列化合物抑制MDM2而对p53进行的诱导导致p53蛋白质水平的升高，随后导致p53所介导的细胞凋亡或p53/p21所介导的细胞周期停滞(Vassilev, L.T.等人，Science303:844-848(2004) ；Kruse, J.P.等人，Cell.137:609-622 (2009) ；Haupt, Y.等人，Nature387:296-299(1997) ；Kubbutat, Μ.H.等人，Nature387:299-303 (1997);和 Kussie, P.H.等人，Science 274:948-953(1996))。非癌细胞由于在很大程度上仍是未知的原因而对MDM2抑制剂所介导的细胞凋亡是相对具有抗性的并通常经历短暂的细胞周期停滞(Secchiero, P.等人，Blood(2006)；Stuhmer, T.等人，Blood 106:3609-3617(2005))。同样不清楚的是各种p53网络/效应子分子的性质及其对MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡的确切贡献，因此仍不知晓单独的P53效应子基因或信号传导途径对于发生MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡是否是绝对必需的(Kruse, J.等人，Celll37:609-622 (2009) ；Tovar, C.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.103:1888-1893 (2006) ；Levine, A.J.等 A , Nat.Rev.Cancer 9:749-758(2009)；Villunger, A.等人，Science 302:1036-1038 (2003) ；Shibue, T.等人，GenesDev.17:2233-2238(2003))。已提供证据表明在MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡中涉及内在和外在的细胞凋亡途径及P53蛋白对线粒体细胞凋亡分子具有直接作用且因此可能的是，MDM2抑制剂所介导的细胞凋亡在功能上利用冗余的细胞凋亡途径(Vaseva, A.V.等人，Cell Cycle8:1711-1719(2009) ；Morselli,E.等人，CellCycle 8:1647-1648(2009) ；Du, W.等人，J.Biol.Chem.284:26315-26321 (2009) ；Kojima, K.等 A ,Blood 108:993-1000(2006)；Kojima,K.等人，Bloodl06:3150-3159(2005) ;Vousden,Κ.H.等人，Cell137:413-431(2009) ；Saddler, C.等人，Blood 111: 1584-1593 (2008)) 在多种细胞系统中就对MDM2抑制剂的抗性机制进行的研究已表明，完整的p53对于发生MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡可能是必需的(Secchiero, P.等人，Blood107:4122-4129(2006) ；Saddler, C.等人，Bloodlll: 1584-1593 (2008) ；Coll-Mulet, L.等人，Blood 107:4109-4114(2006))。不大清楚的是，野生型p53状态以什么样的频率和在什么样的细胞环境下足以独自作为敏感性的预测因子或其它什么样的敏感性/抗性决定因素是可操控的(Secchiero, P.等人，Blood 113:4300-4308(2009) ；Kitagawa, Μ.等人，0ncogene27:5303-5314 (2008) ；Kitagawa, Μ.等人，Mol.Cell.29:217-231 (2008))。p53所介导的细胞凋亡的两种可能调节子是MDM2和MDMX且高水平的这些蛋白质已被证实在多种实验条件下影响MDM2抑制 剂敏感性。然而，支持这些蛋白质的关键作用的可用证据既不是结论性的且在各个实验系统之间也不是一致的，因此仍可能的是，这些P53调节分子就MDM2抑制剂在所有人类肿瘤中的有效性而言不是关键的决定因素(Laurie，N.A.等人，Nature444:61-66 (2006) ；Hu, B.等人，J.Biol.Chem.281:33030-33035 (2006)；Francoz, S.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.103:3232-3237 (2006))。仍需要能够预测哪些白血病患者可能受益于MDM2抑制剂疗法。

发明内容
本申请提供对人类受试者进行选择以治疗白血病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)确定所述受试者的细胞是否含有FLT3-1TD突变，和(b)若所述细胞含有所述突变，则选择所述受试者以治疗白血病。本申请还提供治疗白血病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有白血病的人类受试者给药MDM2抑制剂，其中所述受试者的细胞含有FLT3-1TD突变。本申请还提供对人类受试者进行选择以治疗白血病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测试所述受试者的细胞是否存在FLT3-1TD突变。本申请还提供在患有白血病的人类受试者中预测治疗结果的方法。在一些实施方案中，向具有FLT3-1TD突变的受试者给药MDM2抑制剂将在所述受试者中增加产生有利治疗应答的可能性。


图1A和IB为线形图，其描绘了 AML胚细胞对MDM2抑制剂M1-219(图1A)和M1-63(图1B)的抗性。通过阴性选择将109个(M1-219)和60个(M1-63) AML样品富集至胚细胞纯度>90%且与各种浓度的M1-219或M1-63 —起孵育40小时。准备样品以供膜联蛋白-V和PI染色且通过流式细胞仪来分析并通过与未经处理的对照等分液进行比较来计算每种浓度下剩余的活的和非凋亡的细胞分数。A.M1-219测定结果。红色:p53序列突变体；绿色:缺乏p53mRNA的病例；黑色:野生型p53状态。B.M1-63测定结果。红色:p53序列突变体；绿色:缺乏p53mRNA的病例；黑色:野生型p53状态。图2为线形图，其描绘了 19种AML细胞系对M1-219的敏感性。图3A和3B为免疫印迹，其描绘了用M1-219、Nutlin-3或外部照射处理后原发性AML胚细胞中野生型和突变型p53的水平。通过阴性选择对AML胚细胞进行纯化并不经处理或用M1-219 (5 μ M)或Nutlin-3 (5 μ Μ)处理8小时或用一次外部照射(5Gy)进行处理。8小时后，将细胞溶解并通过SDS-PAGE对蛋白质进行分级。每份凝胶还负载有MOLM 13AML细胞系溶胞产物的等分液作为内标(负载量分别为1.25、2.5和5yg经M1-219处理的溶胞产物或5 yg未经处理的溶胞产物(UT))。将蛋白质转移到膜上并准备以供用抗p53和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹。将针对二者即P53和肌动蛋白的膜一起显影。M1-219的IC5tl值不于括号内。图4A和4B为点形图，其描绘了用M1-219处理的AML胚细胞中MDM2mRNA(图4A)和MDMX mRNA(图4B)的水平。在由经FACS分类的AML胚细胞的RNA制备的cDNA中测量MDM2mRNA和MDMX mRNA的归一化表达水平。显示了 Δ Ct值(Ct平均MDM2或MDMX-Ct平均PGK1)，其如所示那样按M1-219IC5(i值来分组。红色菱形表示具有突变的p53的AML胚细胞。图5A和5B为免疫印迹，其描绘了 AML患者口腔样品(图5A)和胚细胞样品(图5B)中的p53水平。图5C为LOH分析。图为描述p53突变分析的表格。图5E为点形图，其通过 QPCR 而描绘了 p53 的表达。将通过使用 Affymetrix Program Genotyping Console针对所有患者而生成的文档输入到使用软件工具PLUT的LOH工具(版本2)中且将口腔DNA和所配对的肿瘤DNA之间所有单独的LOH位置绘制为跨越染色体长度的蓝色记号标记。如所述那样通过dChipSNP来得到就所有患者的所有SNP位置所进行的拷贝数估计且表示为跨越染色体的长度。拷贝的丢失用蓝色表示，拷贝的增加用红色表示。A和B:染色体拷贝数在17p的变化的基于SNP 6.0阵列绘图的热图显示。蓝色:拷贝丢失；红色:拷贝增加。A: 口腔DNA ；B:AML胚细胞DNA。C:在17p对所配对的胚细胞和口腔DNA进行比较的LOH分析。红色编号:拷贝中性LOH(获得性单亲二体)；黑色:拷贝丢失的LOH。D:p53外显子5-9突变分析结果。E:AML胚细胞中经归一化的p53mRNA表达，其如所示那样按M1-219IC5(i来分组。红色菱形表示具有突变的P53的AML胚细胞。图6为点形图，其描绘了具有各种p53突变的AML胚细胞对MDM2抑制剂M1-219的敏感性。M1-219IC5Q值的显示如下分类:1)ρ53突变状态，ii)存在FLT3-1TD，和iii)所有其它病例。平均IC5tl值在FLT3-1TD+和所有其它病例之间的差异是显著的(p=0.02)。
具体实施例方式大多数患有急性髓性白血病(AML)的患者的存活仍是很差的且需要新颖的治疗方法来改善结果。本申请描述了就白血病细胞对MDM2抑制剂的敏感性而言进行详细表征的结果。在一个实施方案中，所述白血病为急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在一个实施方案中，所述白血病为慢性髓细胞性白血病(CML)。在另一个实施方案中，所治疗的白血病为急性髓细胞性白血病(AML)。本申请使用的术语“急性髓细胞性白血病(AML) ”和“急性髓性白血病”是同义的。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为MO型(分化甚微的急性成髓细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为Ml型(急性成髓细胞性白血病且不伴有成熟)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M2型(急性成髓细胞性白血病且伴有粒细胞成熟)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M3型(早髓细胞性或急性早髓细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M4型(急性髓单核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M4eo型(髓单核细胞性白血病且伴有骨髓嗜酸性粒细胞增多)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M5a型(急性成单核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M5b型(急性单核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M6型(急性红细胞性白血病)。在另一个实施方案中,所述急性髓细胞性白血病为M6a型(红白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M6b型(非常罕见的红细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M7型(急性成巨核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M8型(急性嗜碱性粒细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性嗜碱性粒细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性嗜酸性粒细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为肥大细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性髓树突细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性全骨髓增生伴有骨髓纤维化。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为髓样肉瘤。在一个实施方案中，所述细胞为白血病细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为急性髓细胞性白血病细胞。在一个方面，本发明涉及用于白血病患者的个体化给药方案且包括针对个体白血病患者选择最有可能得 到成功结果的治疗选项。在另一个方面，本发明涉及在患有白血病的患者中使用对治疗结果(例如实现有利的应答或成功治疗的可能性)进行预测的测定。本申请提供对患者(例如人类受试者)进行选择以用MDM2抑制剂治疗白血病的方法，所述方法包括由所述患者得到生物样品(例如血细胞),测试来自所述患者的生物样品是否存在生物标记(例如具有激活突变的FLT3)，和若所述生物样品含有具有激活突变的FLT3,则选择所述患者进行治疗。在一个实施方案中，所述方法还包括若所述生物样品含有FLT3激活突变，则向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂。FLT3激活突变的实例包括例如FLT3-1TD(内部串联重复)和FTL3-KD(酪氨酸激酶结构域)突变。本申请提供在患有白血病的患者中预测治疗结果的方法，所述方法包括由所述患者得到生物样品，测试来自所述患者的生物样品是否存在具有激活突变的FLT3，其中激活突变的检出表明所述患者将对给药治疗有效量的MDM2抑制剂产生有利的应答。有利的应答包括但不限于血液学应答，例如患者中血细胞即白细胞、红细胞和血小板计数的正常化(可通过简单的血液测试来检测)；细胞遗传学应答，例如患者中费城染色体阳性细胞数目的减少或消失(可通过标准实验室方法来检测)；和/或分子应答，例如患者中异常BCR-ABL蛋白数量的减少或消失(可通过PCR测定来检测)。本申请提供治疗白血病的方法，所述方法包括向患有白血病的患者(例如人类受试者)给药治疗有效量的MDM2抑制剂，其中所述患者的细胞含有具有激活突变的FLT3。在一个实施方案中，在已确定所述患者的细胞含有FLT3-1TD突变后，选择所述患者以用MDM2抑制剂进行治疗。在一个实施方案中，对患有白血病的患者进行治疗的方法包括由所述患者得到生物样品，确定所述生物样品是否含有具有激活突变的FLT3，和若所述生物样品含有具有激活突变的FLT3，则向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂，例如表I中的化合物。在另一个实施方案中，本申请提供的方法还包括确定所述患者的细胞是否含有p53突变。本申请使用的术语“生物标记”是指可在患者体内或在由患者得到的样品中检测和/或定量的任意生物化合物，例如蛋白质、蛋白质片段、肽、多肽、核酸等。另外，生物标记可为完整无缺的分子或其可为所述分子的部分或片段。在一个实施方案中，对生物标记的表达水平进行测量。生物标记的表达水平可例如通过检测生物标记的蛋白质水平或RNA(例如mRNA)水平来测量。在一些实施方案中，生物标记的部分或片段可例如通过抗体或其它特异性结合试剂来检测或测量。在一些实施方案中，生物标记的可测量方面与患者的给定状态例如癌症的具体阶段相关。对于以蛋白质水平或RNA水平进行测量的生物标记，所述可测量方面可包括例如生物标记在患者或由所述患者得到的样品中的存在、缺乏或浓度(即表达水平)。对于以核酸水平进行检测的生物标记，所述可测量方面可包括例如生物标记的等位体或生物标记的突变类型、突变率和/或突变程度(在本申请中也称作突变状态)。对于以蛋白质表达水平或RNA表达水平为基础进行检测的生物标记，例如若生物标记在不同组中的平均或 中值表达水平经计算是统计学上显著的，则可认为在不同的表型状态之间测量到的表达水平是不同的。用于统计学显著性的常见检验包括t-检验、AN0VA、Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon检验、Mann-Whitney检验、微阵列显著性分析、优势比等。单独或组合的生物标记提供了对受试者属于哪种表型状态的相对可能性的测量。因此，它们可尤其用作疾病的标志物和表明具体治疗性处置方案将可能带来有益患者结果的指标物。在本发明一个实施方案中，所述生物标记为FLT3受体(在本申请中也称作FLT3)。在本发明一个实施方案中，所述FLT3受体的可测量方面为突变状态。在本发明一个实施方案中，所述突变状态为导致FLT3受体酪氨酸激酶活性增加和/或导致FLT3受体酪氨酸激酶组成性激活的一种突变状态。所述突变包括例如近膜结构域中的一个或多个内部串联重复(ITD)和/或酪氨酸激酶结构域(TKD)中的一种或多种突变。因此，在本发明一些方面，所述生物标记为FLT3，与另一种表型状态(例如未患病的正常患者或患有癌症但不具有携带突变的细胞的患者)相比，所述FLT3差异性地存在于一种表型状态的受试者(例如患有癌症(例如白血病)且具有携带突变的细胞的患者)中。除单独的生物化合物(例如FLT3或p53)外，本申请使用的术语“生物标记”还意在包括多种生物化合物的组或群。例如，FLT3和p53的组合可为生物标记。因此，“生物标记”可包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十五种、二十种、二十五种、三十种或更多种生物化合物。生物标记在患者中的表达水平或突变状态可使用本领域已知的多种方法中的任意一种来确定。本领域已知用于在患者或生物样品中对特异性蛋白质进行定量和/或对FLT3和/或p53突变进行检测的任意方法可用在本发明方法中。实例包括但不限于PCR(聚合酶链反应)或RT-PCR、Northern印迹、Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、对RNA表达进行的基因芯片分析、免疫组织化学或免疫荧光(参见例如Slagle等人，Cancer 83:1401(1998))。本发明一些实施方案包括确定生物标记RNA表达(转录)的方法。本发明其它实施方案包括确定生物样品中蛋白质表达的方法。参见例如 Harlow 等人，Antibodies:A Laboratory Manual, Cold SpringHarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)和 Ausubel 等人，Current ProtocolsinMolecular Biology, John ffiley&Sons, New York 3rd Edition, (1995)。对于 Northern印迹或RT-PCR分析，使用不含有RNA酶的技术从肿瘤组织样品中分离RNA。所述技术是本领域公知的。当在患者体内进行定量时，蛋白质例如FLT3或其变体的表达水平可如下确定:给药与FLT3特异性结合的抗·体(参见例如美国公开申请2006/0127945)并确定结合程度。所述抗体可用放射性同位素例如碳-11、氮-13、氧-15和氟-18可检测地标记。然后所述标记可通过正电子发射断层扫描术(PET)来检测。在本发明一个实施方案中，由患者得到生物样品并对活检用样品中的细胞进行测定以确定生物标记的表达或突变状态。在本发明一个实施方案中，PET成像用于确定生物标记的表达。在本发明另一个实施方案中，对肿瘤细胞样品中生物标记的转录进行Northern印记分析。Northern分析是检测和/或定量样品中mRNA水平的标准方法。首先从样品中分离RNA以使用Northern印记分析进行测定。在所述分析中，首先RNA样品在琼脂糖凝胶中在变性条件下通过电泳按尺寸分离。然后将RNA转移到膜上，交联并用经标记的探针进行杂化。通常,Northern杂化涉及使经放射性或非同位素标记的DNA在体外发生聚合或产生寡核苷酸作为杂化探针。通常，承载RNA样品的膜在探针杂化前被预杂化或阻断以防止所述探针包覆所述膜，由此减小非特异性背景信号。杂化后，未杂化的探针通常通过在几种变化的缓冲液中进行洗涤来除去。洗涤和杂化条件的严格程度可由本领域技术人员来设计、选择和实施。使用经可检测地标记的探针和适当的检测方法来进行检测。经放射性标记和经非放射性标记的探针及其用途是本领域公知的。所测定的生物标记的存在和/或相对的表达水平可使用例如密度测定法来定量。在本发明另一个实施方案中，生物标记的表达和/或突变状态使用RT-PCR来确定。RT-PCR允许实时检测目标基因的PCR扩增过程。设计对本发明生物标记的表达和/或突变状态进行检测所需要的引物和探针在本领域技术人员的知识范围内。RT-PCR可用于确定肿瘤组织样品中对本发明生物标记进行编码的RNA的水平。在本发明一个实施方案中，RNA在不含有RNA酶的条件下从生物样品中分离，然后通过用逆转录酶处理而转化成DNA。用逆转录酶将RNA转化成DNA的方法是本领域公知的。关于PCR的描述参见以下参考文献:Mullis 等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263 (1986) ；EP50, 424 ；EP 84, 796 ；EP 258, 017 ；EP 237, 362 ；EP 201，184 ;美国专利 4，683，202 ;美国专利 4，582，788 ;美国专利 4，683，194。RT-PCR探针取决于针对PCR所使用的DNA聚合酶的5’ _3’核酸酶活性，其水解与目标扩增子(生物标记基因)杂化的寡核苷酸。RT-PCR探针为寡核苷酸，其具有与5’末端连接的荧光报道子染料和与3’末端连接的淬灭剂部分(或反之亦然)。这些探针被设计成与PCR产物的内部区域杂化。在未杂化的状态下，荧光分子与淬灭分子的邻近阻止对来自探针的荧光信号进行检测。在PCR扩增期间，当聚合酶对结合有RT-PCR探针的模板进行复制时，聚合酶的5’ -3’核酸酶活性使探针裂解。这使荧光和淬灭染料解偶联且不再发生FRET。因此，在每个周期中，荧光按与探针裂解量成比例的方式增强。可使用商购设备和常规惯用技术来随时间测量和跟踪反应所发出的荧光信号。在本发明另一个实施方案中，生物标记所编码的蛋白质的表达通过Western印迹分析来检测。Western印迹(也称作免疫印迹)是在所给定的组织匀浆或萃取物样品中检测蛋白质的方法。其使用凝胶电泳以按质量分离变性的蛋白质。然后将蛋白质从凝胶中转移出来并置于膜(例如硝基纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF))上，其中使用与所述蛋白质特异性结合的第一抗体对它们进行检测。然后所结合的抗体通过缀合有可检测的标记(例如生物素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的第二抗体来检测。第二标记信号的检出表明所述蛋白质的存在。在本发明另一个实施方案中，生物标记所编码的蛋白质的表达通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测。在本发明一个实施方案中，“夹心式ELISA”包括板用捕捉抗体涂覆；加入样品，其中所存在的任意抗原与捕捉抗体结合；加入也与所述抗原结合的检测抗体；加入与检测抗体结合的酶联第二抗体；且加入底物，其被所述第二抗体上的酶转化成可检测的形式。来自第二抗体的信号的检出表明生物标记抗原蛋白的存在。在本发明另一个实施方案中，生物标记的表达通过使用基因芯片或微阵列来评价。所述技术在本领域技术人员的知识范围内。本申请使 用的术语“生物样品”是指来自患者的适于对生物标记例如FLT3-1TD突变状态进行检测的任意组织或流体。有用的生物样品的实例包括但不限于活检用组织和/或细胞，例如实体瘤、淋巴腺、发炎组织、病症或疾病所涉及的组织和/或细胞、血液、血浆、浆液、脑髓液、唾液、尿液、淋巴、脑脊髓液等。其它适当的生物样品将是相关领域技术人员所熟悉的。可使用本领域已知的任意技术就生物标记的表达和/或突变对生物样品进行分析且生物样品可使用临床从业人员所公知的技术来得到。在本发明一个实施方案中，所述生物样品包括血细胞。本申请使用的“ MDM2抑制剂”是干扰MDM2活性的化合物。MDM2抑制剂是本领域技术人员公知的。例如，参见 Shangary, S.等人，Annual ReviewOf Pharmacology andToxicology 49:223-241 (2009);和 Weber, L.ExpertOpinion On Therapeutic Patents20:179-191(2010)。在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为螺-羟吲哚化合物。本申请使用的术语“螺-羟吲哚MDM2抑制剂”是指例如在美国专利申请61/260，685,61/263, 662,61/413, 094、61/451，968、11/360，485 (US 2006/0211757A1)、11/848，089 (US 2008/0125430A1)或 12/945,511 或国际专利申请 PCT/US2006/0062(W0 2006/091646)或 PCT/US2007/019128 (W02008/036168)中公开的化合物。在一个具体实施方案中，所述螺-羟吲哚MDM2抑制剂为表I中的化合物。在另一个具体实施方案中，所述螺-羟吲哚MDM2抑制剂为表2中的化合物。在以荧光极化为基础的生物化学结合测定中，就具有野生型p53的肿瘤细胞而言，表I中的化合物以高亲和力与人MDM2蛋白结合，有效地激活p53并诱导细胞生长抑制和细胞死亡。显著的是，这些化合物能够在人类癌症的异种移植物模型中抑制肿瘤生长，这表明这些化合物有希望成为新的抗癌药物。表I
权利要求
1.治疗患有白血病的患者的方法，所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂，其中所述患者的细胞含有具有激活突变的FLT3。
2.选择患有白血病的患者以用MDM2抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括: (a)由所述患者得到生物样品； (b)确定所述生物样品是否含有具有激活突变的FLT3;和 (c)若所述生物样品含有具有激活突变的FLT3，则选择所述患者进行治疗。
3.权利要求2的方法，所述方法还包括向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂。
4.在患有白血病的患者中预测治疗结果的方法，所述方法包括: (a)由所述患者得到生物样品；和 (b)确定所述生物样品是否含有具有激活突变的FLT3； 其中具有激活突变的FLT3的检出表明向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂将引起有利的治疗应答。
5.治疗患有白血病的患者的方法,所述方法包括: (a)由所述患者得到生物样品； (b)确定所述生物样品是否含有具有激活突变的FLT3;和 (c)若所述生物样品含有具有激活突变的FLT3，则向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂。
6.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述生物样品包括血细胞。
7.权利要求2-6中任一项的方法，所述方法还包括确定所述生物样品是否含有一种或多种P53突变。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述FLT3激活突变为内部串联重复。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述患者为人类。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述白血病为急性髓细胞性白血病。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述MDM2抑制剂为螺-羟吲哚MDM2抑制剂。
12.权利要求11的方法，其中所述螺-羟吲哚MDM2抑制剂选自:
13.权利要求1或3-12中任一项的方法，其中向所述患者给药至少一种额外的抗癌药物。
14.权利要求13的方法，其中所述至少一种额外的抗癌药物为FLT3抑制剂。
15.治疗患有急性髓细胞性白血病的人类患者的方法,所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的选自以下的化合物:
16.选择患有急性髓细胞性白血病的人类患者以用选自以下的化合物进行治疗的方法:
17.在患有急性髓细胞性白血病的人类患者中预测治疗结果的方法，所述方法包括: (a)由所述患者得到生物样品；和 (b)确定所述患者的细胞是否含有FLT3-1TD突变； 其中FLT3-1TD突变的检出表明向所述患者给药治疗有效量的选自以下的化合物将引起有利的治疗应答:
18.治疗患有急性髓细胞性白血病的人类患者的方法，所述方法包括: (a)由所述患者得到生物样品； (b)确定所述生物样品是否含有FLT3-1TD突变；和 (c)若所述生物样品含有FLT3-1TD突变，则向所述患者给药治疗有效量的选自以下的化合物:
全文摘要
本发明提供对患有白血病的受试者进行选择和治疗的方法，其中由于受试者的细胞含有FLT3-ITD突变而选择所述受试者进行治疗并用MDM2抑制剂治疗。
文档编号A61P35/02GK103153302SQ201180028596
公开日2013年6月12日 申请日期2011年4月5日 优先权日2010年4月9日
发明者S.王, S.马利克, J.龙, P.维利特 申请人:密歇根大学董事会