一种鸡常见食源性细菌四重荧光pcr检测试剂盒及使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒及使用方法，试剂盒包含了荧光PCR反应液以及产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌的标准品，其中荧光PCR反应液含有TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTPs、四对细菌的特异性引物和相应的四种荧光探针。本发明运用四重荧光PCR，能快速、准确地检测产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和空肠弯曲杆菌4种鸡携带的主要食源性病原菌，可用于细菌的鉴定、疾病的诊断和流行病学调查。
【专利说明】—种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，还涉及一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒的使用方法。
【背景技术】
[0002]产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7和空肠弯曲杆菌是鸡携带的4种最常见的食源性致病细菌，它们不仅严重危害我国养禽业，而且通过食品污染感染人类，给人类健康造成威胁。
[0003]产气荚膜梭菌为人畜共患病病原，也是食源性病原菌。鸡群为产气荚膜梭菌的主要宿主之一，产气荚膜梭菌在鸡体内为条件性致病菌，可引起鸡坏死性肠炎，也有很多带菌不发病的情况。人类误食该菌污染的鸡肉制品等，可引起食物中毒。产气荚膜梭菌是引起人食物中毒和气肿疽的主要病原体。
[0004]沙门氏菌是一种常见的人畜共患病病原，该菌不仅能引起鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒等禽类疾病，危害养禽业，还能够感染人类，引起胃肠炎、伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种疾病。据统计，沙门氏菌引起的食物中毒常列世界各国细菌性食物中毒榜首，我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。其中沙门氏菌感染禽是经食物链传染给人类的一个重要中介。
[0005]大肠杆菌0157:H7感染是一种食源性疾病，该菌可从鸡肉、牛肉、奶牛或奶制品、蔬菜、饮料及水中分离到，其中鸡群也是该菌的宿主之一。该菌为一种肠道出血性大肠杆菌，是食物中毒的原因之一。感染者通常发生出血性腹泻，尤其在年轻儿童和年长者中，有时导致肾衰竭。世界各地多次爆发 大肠杆菌0157:H7感染，严重危害了公共卫生安全。
[0006]空肠弯曲菌是一种食源性人畜共患病病原菌，其中家禽特别是鸡群为空肠弯曲杆菌的主要宿主之一,通常成年鸡感染空肠弯曲杆菌无明显症状,然而食入空肠弯曲杆菌污染的鸡肉制品等，极易引起人类感染，导致急性肠胃炎，随后还可以引起自身免疫性并发症，如格巴氏综合征和关节炎。空肠弯曲菌也是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因之
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[0007]鸡群是以上4种细菌的主要宿主之一，然而这些细菌通常被鸡携带却未表现出对鸡的致病性，或无明显的病变，容易被被养殖者忽视，但是这些病原菌一旦污染鸡肉等食品，则会引起食品安全问题。世界各国已对食品安全高度重视，对鸡肉制品等食品中微生物携带提出了明确的要求，从养殖开始控制与清除这些食源性细菌是避免食品污染的关键。因此迫切需要一种可同时快速、准确地检测鸡群或鸡肉制品中多种食源性致病菌的检测方法。目前实验室的诊断方法主要是依靠细菌的分离鉴定，但是该方法检测时间长、操作繁琐，也难以大批量进行。目前也有针对单个病原建立的PCR等检测方法，但是尚未有能系统检测鸡或鸡肉制品中多种食源性致病菌的方法与标准。实时荧光PCR快速、高效、敏感性好、特异性强，而且可以同时进行多种病原菌的检测，已成为病原菌检测的一种重要的方法。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是在于提供了一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒由荧光PCR反应液、阳性对照(产气荚膜梭菌标准品、沙门氏菌标准品、大肠杆菌0157:H7标准品和空肠弯曲杆菌标准品)以及阴性对照品组成。以往在家禽中检测病原菌多通过细菌的分离鉴定或运用针对单个菌的PCR检测，本检测试剂盒针对鸡源最常见的4种食源性细菌，设计并筛选出互不干扰的4对检测引物与4条探针，4种鸡主要食源性细菌检测在一个反应中完成，更为高效，且敏感性好，特异性强，检测下限达到lOcfu。
[0009]本发明还有一个目的是在于提供了一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，方法简单，快速，所有检测步骤可在2个小时内完成。
[0010]为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0011]一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，含有以下成分:
[0012]荧光PCR反应液:Taq DNA聚合酶、不含Mg2+的PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTPs、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7和空肠弯曲杆菌这4种细菌的特异性引物和相应的4种荧光探针。试剂盒中包含4对引物和4条探针序列如下:
[0013]表I特异性引物序列表
[0014]
【权利要求】
1.一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括:荧光PCR反应液、阳性对照，四对细菌的特异性引物:CPO1、CP02、SEO1、SE02、ECO 1、EC02、CJO1、CJ02和四种荧光探针:CPP、SEP、ECP、CJP ； 所述的荧光PCR反应液为:rTaq DNA聚合酶、不含Mg2+的10XPCR反应缓冲液、25mMMg2+ 和 IOmM dNTPs ； 所述的阳性对照为:产气荚膜梭菌；沙门氏菌；大肠杆菌0157:H7和空肠弯曲杆菌的标准品或产气荚膜梭菌基因阳性质粒；沙门氏菌基因阳性质粒；大肠杆菌0157:H7rfbB基因阳性质粒和空肠弯曲噶杆菌ccoN基因阳性质粒； 所述的特异性引物为:
2.权利要求1所述试剂盒的使用方法，具体如下: 1)样品的处理与DNA模板的提取: 使用试剂盒提取DNA模板，取5 μ I作为待测样品，每次检测均应设立阳性对照和阴性对照； 2)反应体系与反应参数: 反应体系如下:
【文档编号】C12Q1/68GK103436626SQ201310417980
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】张腾飞, 王红琳, 罗玲, 张蓉蓉, 罗青平, 温国元, 邵华斌 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所