Pde4b抑制剂及其应用的制作方法

专利名称：Pde4b抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及磷酸二酯酶4B(PDE4B)的配体的开发，还涉及应用PDE4B的晶体结构开发出所述配体。提供的信息仅意图于协助读者的理解。提供的信息和列出的参考文献均不被承认为本发明的现有技术。列出的每一参考文献以其整体并入本文，用于所有目的。
背景技术：
磷酸二酯酶(phosphodiesterases)(PDEs)首先由Sutherland及其同事检测到(Rall，et al.，J.Biol.Chem.，2321065-1076(1958)，Butcher，et al.，J.Biol. Chem.，2371244-1250(1962))。PDEs超家族被再分为两个主要类型，I类和II类(Charbonneau，H.，Cyclic Nucleotide PhosphodiesterasesStructure，Regulation andDrug Action，Beavo，J.，and Houslay，M.D.，eds)267-296 John Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1990))，它们没有可识别的序列相似性。I类包括所有已知的哺乳动物PDEs，由11个得到鉴定的家族组成，所述家族是独立基因的产物(Beavo，et al.，Mol.Pharmacol.，46399-405(1994)；Conti，et al.，Endocr.Rev.，16370-389(1995)；Degerman，et al.，J.Biol.Chem.，2726823-6826(1997)；Houslay，M.D.，Adv.EnzymeRegul.，35303-338(1995)；Bolger，G.B.，Cell Signal，6851-859(1994)；Thompson，etal，Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res.，25165-184(1992)；Underwood，et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，270250-259(1994)；Michaeli，et al.，J.Biol.Chem.，26812925-12932(1993)；Soderling，et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，958991-8996(1998)；Soderling，et al.，J.Biol.Chem.，27315553-15558(1998)；Fisher，et al.，J. Biol.Chem.，27315559-15564(1998))。一些PDEs对cAMP的水解具有高度特异性(PDE4、PDE7、PDE8)，一些是高度cGMP特异性的(PDE5、PDE6、PDE9)，一些具有混合的特异性(PDE1、PDE2、PDE3、PDE10)。
所有得到表征的哺乳动物PDEs都是二聚体，但是在各种PDEs中，二聚体结构对功能的重要性是未知的。每种PDE具有～270个氨基酸的保守的催化结构域，其在PDE家族中有高度的氨基酸序列保守性(25-30％)，并且其位于它的调控结构域的羧基端。一些PDEs的激活物似乎解除了位于酶结构中的自身抑制结构域(autoinhibitory domains)的影响(Sonnenberg，et al.，J.Biol.Chem.，27030989-31000(1995)；Jin，et al.，J.Biol.Chem.，26718929-18939(1992))。
PDEs切割位于3’位置的氧原子和磷原子之间的环2′-3′核苷酸磷酸二酯键，同时在磷原子处发生构型的翻转(Goldberg，et al.，J.Biol.Chem.，25510344-10347(1980)；Burgers，et al.，J.Biol.Chem.，2549959-9961(1979))。这显然是由于离子化的H2O的OH-进行成直线状的亲核攻击的结果。已经提出，在PDEs中保守的金属结合基序中结合的金属有助于攻击性OH-的产生(Francis，et al.，J.Biol.Chem.，26922477-22480(1994))。催化的动力学特性与环核苷酸和催化所需的二价阳离子的随机次序机制(random order mechanism)一致(Srivastava，et al.，Biochem.J.，308653-658(1995))。所有已知的哺乳动物PDEs的催化结构域含有串联排列的两个序列(HX3HXn(E/D))，其中每一序列类似于金属内切蛋白酶例如嗜热菌蛋白酶(thermolysin)的单Zn2+结合部位(Francis，et al.，J.Biol.Chem.，26922477-22480(1994))。PDE5特异性地结合Zn2+，PDE4、PDE5和PDE6的催化活性受亚微摩尔浓度的Zn2+的支持(Francis，et al.，J.Biol.Chem.，26922477-22480(1994)；Percival，etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，241175-180(1997))。每个Zn2+结合基序是独立地结合Zn2+，还是这两个基序相互作用形成新的Zn2+结合部位，尚不清楚。PDEs切割环核苷酸的磷酸二酯键的催化机制可能与某些蛋白酶切割肽的酰胺酯的机制类似，但是在PDEs中串联排列的两个Zn2+基序的存在是没有先例的。
Sutherland和Rall的研究组(Berthet，et al.，J.Biol.Chem.，229351-361(1957))在20世纪50年代末期首先认识到，咖啡因增强胰高血糖素-腺苷酸环化酶的一种刺激物-对肝脏的cAMP累积和糖原分解的效应的至少一部分机制涉及cAMPPDE活性的抑制。自那时起，化学家们已经合成了数千种PDE抑制剂，包括被广泛应用的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。这些化合物中的许多以及咖啡因，是非选择性的，它们抑制PDE家族中的许多成员。PDE研究中的一个重要进展是家族特异性抑制剂例如PDE4抑制剂洛利普南(rolipram)和PDE5抑制剂西地那非(sildenafil)的发现/设计。
细胞中PDE功能的精确调节对于将环核苷酸水平维持在窄的限定速率的浓度范围内是至关重要的。cGMP高于基础水平的2-4倍的增加通常会产生最大的生理反应。存在三种调控PDEs的一般方案(a)由底物可利用度来调节，例如通过提高环核苷酸水平后的质量作用(mass action)刺激PDE活性，或通过由于另一种环核苷酸的竞争而改变一种环核苷酸的水解速率，这可以针对任何双特异性PDEs(例如PDE1、PDE2、PDE3)进行；(b)由改变细胞内信号转导的细胞外信号(例如，磷酸化事件、Ca2+、磷脂酸、磷酸肌醇、蛋白质-蛋白质相互作用等)来调节，这导致，例如，胰岛素对PDE3活性的刺激(Degerman，et al.，J.Biol.Chem.，2726823-6826(1997))；光子通过转导素系统对PDE6活性的刺激(Yamazaki，et al.，J.Biol.Chem.，25511619-11624(1980))，这改变了PDE6与此酶的相互作用；或者通过与Ca2+/钙调蛋白的增强的相互作用对PDE1活性进行刺激；(c)反馈调节，例如通过cAMP增加后PKA催化的PDE1、PDE3或PDE4磷酸化(Conti，et al.，Endocr.Rev.，16370-389(1995)；Degerman，et al.，J.Biol.Chem.，2726823-6826(1997)；Gettys，et al.，J.Biol.Chem.262333-339(1987)；Florio，et al，Biochemistry，338948-8954(1994))，通过在cGMP增加后变构cGMP与PDE2的结合促进cAMP或cGMP分解，或者通过调节PDE蛋白水平，例如通过在细胞慢性暴露于cAMP升高试剂后增加的PDE3或PDE4浓度而发生的失敏(Conti，et al.，Endocr.Rev.，16370-389(1995)，Sheth，et al.，Throm.Haemostasis，77155-162(1997))或者通过PDE5含量的发育相关变化。能够影响上述三种方案中的任意一种的其它因素是PDEs的细胞内区室化(Houslay，M.D.，Adv.Enzyme Regul.，35303-338(1995))，其通过共价修饰例如异戊二烯化或通过PDE一级结构中的特异性靶向序列以及可能的PDEs在细胞内区室之间的移位来实现。
在PDE超家族中，10个家族中的四种PDEs(PDE2、PDE5、PDE6和PDE10)除了具有不同底物专一性的催化部位之外，还含有高度cGMP特异性的变构(非催化性)cGMP结合部位。这些二聚cGMP-结合PDEs中的每一单体含有串联排列并位于蛋白质氨基端部分的～110个氨基酸的两个同源cGMP结合部位(Charbonneau，H.，Cyclic Nucleotide PhosphodiesterasesStructure，Regulation and Drug Action，Beavo，J.，and Houslay，M.D.，eds)267-296(1990)；McAllister-Lucas，et al.，J.Biol.Chem.，27030671-30679(1995))。在PDE2中，cGMP与这些部位的结合刺激在催化部位的cAMP水解(Beavo，et al.，Mol.Pharmacol.，46399-405(1994))。PDE2水解cGMP以及cAMP，根据正协同动力学，cGMP水解受到在变构部位的cGMP结合的刺激(Manganiello，et al.，Cyclic Nucleotide PhosphodiesterasesStructure，Regulation，and Drug Action，Beavo，J.，and Houslay，M.D.，eds，61-85 John Wiley&Sons，Inc.，New York(1990))。这可以代表调节组织cGMP水平的负反馈过程(Manganiello，et al.，Cyclic Nucleotide PhosphodiesterasesStructure，Regulation，andDrug Action，Beavo，J.，and Houslay，M.D.，eds，61-85 John Wiley&Sons，Inc.，NewYork(1990))，除了cGMP刺激的cAMP分解所代表的环核苷酸途径之间的交汇相互作用(cross-talk)之外，这也会发生。cGMP与PDE6变构部位的结合没有显示出会影响催化，但是此结合可以调节PDE6与调节蛋白、转导素和PDE6的抑制性γ亚基的相互作用(Yamazaki，et al.，Adv.Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylaiion Res.，16381-392(1984))。
PDE4亚家族由4个成员组成PDE4A(SEQ ID NO14)、PDE4B(SEQ IDNO12)、PDE4C(SEQ ID NO15)和PDE4D(SEQ ID NO13)(Conti et al.(2003)JBiol Chem.2785493-5496)。与cGMP相比，PDE4酶表现出优先选择cAMP作为底物。这些酶具有推测介导二聚化作用的N端调节结构域，二聚化作用导致被最佳调节的PDE活性。此外，活性通过此上游调节结构域中的cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点被调节。这些酶也相当遍在地被表达，但其在淋巴细胞中的表达是重要的。
已经提出PDE4酶的抑制剂在治疗炎性疾病中具有效用。PDE4B的敲除得到的是可存活的小鼠(Jin and Conti(2002)Proc Natl Acad Sci U S A，99，7628-7633)，而PDE4D的敲除导致存活力下降(Jin et al.(1999)Proc Natl Acad Sci U S A，96，11998-12003)。PDE4D敲除基因型可以通过在其它背景小鼠品系中培育得到拯救。来自这些PDE4D敲除胚胎的气道上皮细胞对肾上腺素激动剂表现出大大降低的超敏性，表明PDE4D是气道炎性疾病的治疗靶标(Hansen et al.(2000)Proc Natl AcadSci U S A，97，6751-6756)。PDE4B敲除小鼠有极少的症状和正常的气道超敏性。
与之相比，来自PDE4B敲除小鼠的单核细胞对LPS表现出降低的反应(Jinand Conti(2002)Proc Natl Acad Sci U S A，99，7628-7633)。这表明相比PDE4D具有选择性的PDE4B化合物能够表现出抗炎活性，同时副作用减少。
PDE4B(Xu et al.(2000)Science，288，1822-1825)和PDE4D的晶体结构(Leeet al.(2002)FEBS Lett，530，53-58)已经在文献中被报道。该PDE4B结构是在活性部位中不存在配体的情况下被解析的，因此有关活性部位性质的信息被局限为两个金属离子位点的确定(假定为锌和镁)。cAMP的结合方式是基于计算机模建被提出的。因此，在本领域中存在着对PDE4B的更有效和特异的抑制剂和调节剂以及设计它们的方法的需求。
发明概述 本发明涉及对PDE4B具有活性的化合物，以及应用有关PDE4B的结构信息来设计其它的PDE4B调节剂。特别地，本发明涉及如下述的式I、式II和式III的化合物。因此，本发明提供了可以用于涉及调节PDE4B的治疗方法的化合物，还提供了用于开发PDE4B和其它PDEs的其它调节剂的分子支架(molecularscaffolds)。
式I化合物具有下列结构 式I其中 X是O、S或NR7； Y和Z独立地是O或S； R1、R2、R4、R5、R7、R9和R10独立地是氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳烷基，并且R1和R2、或R4和R5、或R9和R10、或R2和R3可以独立地结合形成杂环或任选取代的杂环； R3是氰基、硝基、-C(Z)R8、S(O2)NR9R10、S(O2)R11或任选取代的低碳烷基； R6和R8独立地是羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基、或任选取代的杂环； R11独立地是羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、或任选取代的杂芳烷基。本发明包括本发明化合物的所有盐、前体药物和异构体。
在一些实施方案中，X是S，R1是H或任选取代的低碳烷基，R2是环状基团如苯基、甲氧基苯基和苄基，或者包括这些环状基团。
在一些实施方案中，X是S、X是O是S；可选地，X是O；或可选地，X是NR7。在特定实施方案中，对于X是S、X是O和X是NR7中的每一种情况，Y是O；Y是S；R3是氰基；R3是C(Z)R8；R3是S(O2)NR9R10；R3是S(O2)R11，R3是C(O)NH2，或R3是低碳烷基。
在一些实施方案中，R2是任选取代的环状基团，例如碳环基团或杂环基团，或者包括这些任选取代的环状基团，所述环状基团可以是芳基。实例包括环戊基、环己基、苯基、吡咯基、吡啶基；在进一步相关实施方案中，对于每一种刚刚提到的R2是H的选择；R2是低碳烷基。在进一步实施方案中，对于每一种刚刚提到的R2的选择，R3是腈或羧酸烷基酯，例如，羧酸乙酯(如化合物33所示)。
在一些实施方案中，R6是 Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自-O-、-S-、-CR6a-、-CR6b-、-CR6c-和-NR6d-，其中Z1、Z2、Z3和Z4中的至少一个是杂原子，其中Z1、Z2、Z3和Z4被选择以产生稳定的化合物；
R6a、R6b和R6c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基(alkylthio)；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选取代的脲；任选地用烷基、芳基或杂芳基N-单取代或N，N-双取代的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位被连接以产生稳定的化合物；或R6a、R6b和R6c可以与含有Z1、Z2、Z3和Z4的五元环结合形成任选取代的稠合杂环系统；R6d可选地存在，当其存在时，其选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基；然而，条件是当R6是噻吩-2-基时，R1和R2不选自苯基、低碳烷基和低碳烯基；和当R6是呋喃-2-基时，R1和R2不选自任选取代的苯基和任选取代的苯基烷基。
在又一实施方案中，R1选自任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、酰基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；和R2、R4和R5是氢。
在又一实施方案中，任选取代的杂环是任选取代的环杂烷基(cycloheteroalkyl)，例如任选取代的吡咯烷或哌啶。
在一些实施方案中，R6选自
R6a、R6b和R6c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选取代的脲；用烷基、芳基或杂芳基任选地N-单取代或N，N-双取代的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基、任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物；或R6d选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基；然而，条件是当R6是噻吩-2-基时，R6a不是氢或卤素。
在又一实施方案中，R6a选自卤素、任选取代的低碳烷基、烷氧基、烷硫基、炔基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、取代的芳基、芳氧基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇、磺酰胺。
在又一实施方案中，R6选自 R6a和R6b独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选取代的脲；用烷基、芳基或杂芳基任选地N-单取代或N，N-双取代的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物；然而，条件是当R6是噻吩-2-基时，R6a不是氢或卤素。
在一些实施方案中，式I化合物具有下列结构 其中R1选自氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R3选自氰基、硝基、-C(Z)R8、-S(O2)NR9R10、-S(O2)R11和任选取代的低碳烷基；和R6a独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选取代的脲；用烷基、芳基或杂芳基任选地N-单取代或N，N-双取代的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物。
在上述任意化合物的一些实施方案中，R3选自氰基、C(O)NH2和任选取代的低碳烷基。
在上述任意化合物的一些实施方案中，R1和R2中的至少一个选自任选取代的环烷基、任选取代的杂环和任选取代的杂环烷基。而在进一步的实施方案中，任选取代的杂环是任选取代的环杂烷基。上述式子的实施方案包括其所有盐、前体药物和异构体。
同样地，式II化合物具有下列结构 式II 其中 X＝S、O、NR15； R12是氢、OR16、SR16、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳烷基； R13是OR16、SR16或任选取代的胺； R14是OR16、SR16、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基、C(Z)R19、C(Z)NR20R21、S(O2)NR20R21或S(O2)R22； R15是氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基、C(Z)R19、C(Z)NR20R21、S(O2)NR20R21或S(O2)R22； R16是任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基或C(Z)R19； R19是羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳烷基； R20和R21独立地是氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基，或者它们可以结合形成5-7元碳环或杂环； R22是羟基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳烷基； Z是O或S。
在式II化合物的特定实施方案中，X是S，R12是仲胺，优选地带有任选取代的芳基或杂芳基，R13是-NH2，R14是-C(O)-芳基或C(O)-杂芳基，其中芳基或杂芳基被任选地取代。在进一步的实施方案中，R12中的芳基或杂芳基被单取代或双取代，例如，取代以卤素(例如，氟或氯)或卤素取代的低碳烷基，其中的取代优选地位于6元环的对位。在进一步的实施方案中，芳基或杂芳基被单取代或双取代，优选地取代以卤素或卤素取代的低碳烷基，优选地包括在6元环的对位处的取代。
在式II的进一步实施方案中，R14是C(O)R19；R19是任选取代的环烷基；和R12选自任选取代的芳基胺、任选取代的杂芳基胺和任选取代的环烷基，然而，条件是当R12是苯胺时，R19不是环丙基。
在式II化合物的进一步实施方案中，R14是C(O)R19；R19是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任选取代的环烷基；和R12是任选取代的环烷基胺，其中当R12是环己胺时，则R19不是任选取代的苯基。
在一些实施方案中，式II化合物具有下列结构 其中Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自-O-、-S-、-CR19a-、-CR19b-、-CR19c-和-NR19d-，其中Z1、Z2、Z3和Z4中的至少一个是杂原子，其中Z1、Z2、Z3和Z4被选择以产生稳定的化合物；R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基，然而，条件是磺酰胺不可以取代芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基；和R19a、R19b和R19c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选取代的脲；用烷基、芳基或杂芳基任选地N-单取代或N，N-双取代的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物；其中R19a、R19b和R19c中的至少一个是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或羧基；或R19a、R19b和R19c可以与含有Z1、Z2、Z3和Z4的五元环结合形成任选取代的稠合杂环系统；和R19d可选地存在，当其存在时，其选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基。
在进一步实施方案中，R12a选自任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基，其中芳基不可以用酰基、胺和磺酰胺基(sulfonylamido)取代。
在一些实施方案中，式II化合物具有下列结构 其中R19选自 R19a、R19b和R19c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位结合连接以产生稳定的化合物；和R19d可选地存在，当其存在时，其选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基。
在又一个实施方案中，R19选自
R19a独立地是氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物；R19b选自氢和低碳烷基；和R19d可选地存在，当其存在时，其为氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基或亚磺酰氨基。
在上述结构的进一步实施方案中，R19a选自卤素、任选取代的低碳烷基、烷氧基、烷硫基、炔基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、任选取代的芳基、芳氧基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇和亚磺酰氨基，它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物。
在一些实施方案中，式II化合物具有下列结构 其中R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基；和R19a选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物； 在一些实施方案中，式II化合物具有下列结构 其中R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基；和R19a选自烷氧基、氨基、羧基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。
在一些实施方案中，式II化合物具有下列结构 其中R12a选自任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基和任选取代的芳基；和R19a选自烷氧基、氨基、羧基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。
在一些实施方案中，式II化合物具有下列结构 其中R12a选自低碳烷基、环烷基和任选取代的芳基；和R19a选自烷氧基、氨基、羧基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。
在一些实施方案中，式II化合物具有下列结构
其中R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基，然而，条件是磺酰胺不可以取代芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基。
在又一实施方案中，R12a是任选取代的芳基。
在又一实施方案中，R12a是任选取代的苯基。
上式的实施方案包括其所有盐、前体药物和异构体。
式III化合物具有下列结构 式III其中 A是具有3-14个环原子的碳环或杂环结构，其可以是芳基或杂芳基，通过一个键或一组连接原子a与N连接，其中m是0-3； R23是氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，或者它可以与A和/或(a)m结合形成5-7元任选取代的碳环或杂环系统，或者任选取代的芳基或杂芳基； R24是任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基。
在一些实施方案中，R24上的取代是任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，可以选择的是它可以通过碳或氧或硫或任选取代的氮连接到R24。
在式III化合物的一些实施方案中，R24是任选取代的噻吩环；R24是任选取代的苯环；R24是任选取代的碳环；R24是任选取代的杂环；R24是任选取代的芳基；R24是任选取代的杂芳基；R24是用5元或6元碳环(其本身可以被取代)取代的噻吩环；R24是用5元或6元杂环(其本身可以被取代)取代的噻吩环；R24是用任选取代的嘧啶环取代的噻吩环；R24是用烷基酯基团取代的苯基；R24是用烷氧基取代的苯基。
在一些实施方案中，对于上述R24的每一选择，A是任选取代的碳环；可选地，A是任选取代的杂环；可选地，A是任选取代的芳基；可选地，A是任选取代的杂芳基；可选地，A是任选取代的吲哚基；可选地，A是任选取代的苯基；或者可选地，A是任选取代的喹啉基。
在一些实施方案中，对于上述A的每一选择，R23是H；R23是烷基；R23是甲基；R23是乙基；R23是丙基；R23是任选取代的碳环基团；R23是任选取代的杂环基团；或者R23是任选取代的苯基。
在一些实施方案中，(a)m包括S；(a)m包括O；(a)m包括N；(a)m是碳链；(a)m是亚烷基链；(a)m是-S-亚烷基-链；或(a)m是-O-亚烷基-链。
对于(a)m和(b)m，连接原子的数目分别是连接如式IIIa所示的最大可确认部分A和N，或最大可确认部分B和S的原子最小数目。
在一些实施方案中，式III化合物中的R24不是-Ar-取代的异丙基，并且-(a)m-A不是芳基或芳烷基。在一些实施方案中，-(a)m-A不是Ar-取代的异丙基。在一些实施方案中，式III化合物不是如Li et al.，PCT/US00/06611，WO 00/54759中描述的化合物，所述文献并入本文作为参考。
在式III化合物的一些实施方案中，化合物具有式IIIa的结构 式IIIa其中m＝0-3个原子；n＝0-3个原子；A＝环状基团；和B＝环状基团。
在一些实施方案中，式III化合物具有下列结构
其中R26a、R26b、R26c、R26d、R26e和R26f独立地选自氢、卤素、低碳烷基和烷氧基。R24如上限定。
在又一实施方案中，R24选自任选用任选取代的杂环烷基取代的芳基、任选取代的芳氨基、任选取代的杂芳氨基、任选取代的芳基磺酰基和-RNHC(O)R’，其中R是亚烷基，和R’是任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；或R24是任选取代的杂芳基，然而，条件是R24不是四唑或三唑并嘧啶环。
在一些实施方案中，式III化合物具有下列结构 其中n是0或1；和Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地选自-O-、-S-、-CR24a-、-CR24b-、-CR24c-、-CR24d-和-NR24e-，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5被选择以形成稳定的化合物；R24a、R24b、R24c和R24d独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接以产生稳定的化合物；和R24e可选地存在，当其存在时，其为氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基或亚磺酰氨基。
在又一实施方案中，包括Z1-Z4的环是苯基、硫代苯基或呋喃基。上式的实施方案包括其所有盐、前体药物和异构体。
关于式I、II和III的化合物，使用下列定义。
“卤素(halo)”和“卤素(halogen)”是指所有卤素，即氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)或碘(I)。
“羟基(Hydroxyl)”和“羟基(Hydroxy)”是指-OH基团。
“硫醇(Thiol)”和“巯基(mercapto)”是指-SH基团。
“烷基(Alkyl)”是指烷烃衍生基团，含有1至20个碳原子，优选地含有1至15个碳原子。烷基包括直链烷基、支链烷基和环烷基。直链烷基或支链烷基含有1至15个碳原子，优选1至8个碳原子，更优选1至6个碳原子，甚至更优选1至4个碳原子，最优选1至2个碳原子，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基和类似烷基。烷基也包括含有一个或多个环烷基部分或者被一个或多个环烷基部分中断的直链烷基或支链烷基。此例子包括但不限于4-(异丙基)-环己基乙基或2-甲基-环丙基戊基。烷基在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“取代的烷基(substitude alkyl)”是烷基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个基团或者取代基，如卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；芳基；取代的芳基；芳氧基；杂芳氧基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；酰基；羧基；杂环；取代的杂环；杂芳基；取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；氧代或类似基团，其在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“低碳烷基(lower alkyl)”是指具有1-6个碳原子的烷基。
“取代的低碳烷基(substituted lower alkyl)”是用1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基取代的低碳烷基，所述基团或取代基在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“环烷基(cycloalkyl)”是指单环、双环或三环系统，每个环中的环原子数是3-8个、更优选3-6个，如环丙基、环戊基、环己基、金刚烷基和类似基团。
“取代的环烷基(substituted cycloalkyl)”是环烷基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基，所述基团在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“亚烷基(Alkylene)”是指二价烷烃衍生的基团，含有1-20个碳原子，优选地含有1-15个碳原子，在其中，从相同的碳原子或不同的碳原子除去两个氢原子。亚烷基的例子包括但不限于亚甲基-CH2-、亚乙基-CH2CH2-和类似基团。
“取代的亚烷基(substituted alkylene)”是亚烷基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基，所述基团或取代基在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“低碳亚烷基(lower alkylene)”是含有1-6个碳原子的亚烷基。
“取代的低碳亚烷基(substituted lower alkylene)”是低碳亚烷基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基，所述基团或取代基在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“烯基(Alkenyl)”是指直链烃、支链烃或环烃，其含有2-20个、优选地2-17个、更优选地2-10个、甚至更优选地2-8个、最优选地2-4个碳原子，并且含有至少一个，优选1-3个、更优选1-2个、最优选一个碳碳双键。在环烷基的情况下，多于一个碳碳双键的共轭不至于为环赋予芳香性。碳碳双键可以包含在环烷基部分中，例外是环丙基，或者包含在直链或支链部分中。烯基的例子包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、环己烯基、环己烯基烷基和类似基团。
“取代的烯基(substituted alkenyl)”是烯基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基，所述基团或取代基在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“炔基(Alkynyl)”是指直链或支链烃，其含有2-20个、优选2-17个、更优选2-10个、甚至更优选2-8个、最优选2-4个碳原子，并且含有至少一个，优选一个碳碳三键。炔基的例子包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基和类似基团。
“取代的炔基(substituted alkynyl)”是炔基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基，所述基团或取代基在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“烷基烯基(Alkyl alkenyl)”是指基团-Ra-CRb＝CRcRd，其中Ra是低碳亚烷基或取代的低碳亚烷基，Rb、Rc和Rd独立地是氢、卤素、低碳烷基、取代的低碳烷基、酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“烷基炔基(Alkyl alkynyl)”是指基团-RaC≡CRe，其中Ra是低碳亚烷基或取代的低碳亚烷基，Re是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“烷氧基(Alkoxy)”表示基团-ORf，其中Rf是低碳烷基、取代的低碳烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基。
“烷硫基(Alkylthio)”或“硫代烷氧基(thioalkoxy)”是指基团-S-R，其中R是低碳烷基、取代的低碳烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基。
“亚磺酰基(Sulfinyl)”是指基团-S(O)-。
“磺酰基(Sulfonyl)“是指基团-S(O)2-。
“烷基亚磺酰基(Alkylsulfinyl)”是指基团-S(O)-Ry，其中Ry是任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基或任选取代的芳烷基。
“烷基磺酰基(Alkylsulfonyl)”是指基团-S(O)2-Ry，其中Ry是任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基或任选取代的芳烷基。
“氨基磺酰基(Aminosulfonyl)”是指基团-S(O)2-NHRu，其中Ru是键、氢或任选取代的低碳烷基。
“烷基氨基磺酰基(Alkylaminosulfonyl)”是指基团-S(O)2-NRvRw，其中Rv是氢或任选取代的低碳烷基，Rw是任选取代的低碳烷基。
“芳基氨基磺酰基(Artlaminosulfonyl)”是指基团-S(O)2-NRvRx，其中Rv是氢或任选取代的低碳烷基，Rx是任选取代的芳基或任选取代的芳烷基。
“杂芳基氨基磺酰基(Heteroarylaminosulfonyl)”是指基团-S(O)2-NRvRz，其中Rv是氢或任选取代的低碳烷基，Rz是任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳烷基。
“酰基(Acyl)”是指基团-C(O)Rh，其中Rh是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基和类似基团。
“酰氧基(Acyloxy)”是指基团-OC(O)Rh，其中Rh是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基和类似基团。
“芳氧基(Aryloxy)”是指基团-OAr，其中Ar是芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“杂芳氧基(Heteroaryloxy)”是指基团-OHet，其中Het是任选取代的杂芳基。
“氨基(Amino)”或“取代的胺(substituted amine)”是指基团-NRiRj，其中Ri和Rj独立地是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基或磺酰基。进一步地，N、Ri和Rj可以结合形成任选取代的杂环。
“酰氨基(Amido)”是指基团-C(O)NRkRl，其中Rk和Rl独立地是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。进一步地，N、Rk和Rl可以结合形成任选取代的杂环。
“硫代酰氨基(Thioamido)”是指基团-C(S)NRkRl，其中Rk和Rl独立地是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“亚磺酰氨基(Sulfonamido)”和“氨磺酰(sulfonamide)”和“磺氨基(sulfamido)”是指基团-S(O)2NRkRl，其中Rk和Rl独立地是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“脒基(Amidino)”是指基团-C(＝NRm)NRnRo，其中Rm、Rn和Ro独立地是氢或任选取代的低碳烷基。
“磺酰氨基(Sulfonylamino)”是指基团-NRqS(O)2-，其中Rq是氢或任选取代的低碳烷基。
“烷基磺酰氨基(Alkylsulfonylamino)”是指基团-NRqS(O)2Rp，其中Rp是任选取代的烷基，Rq是氢或低碳烷基。
“芳基磺酰氨基(Arylsulfonylamino)”是指基团-NRqS(O)2Rs，其中Rs是任选取代的芳基，Rq是氢或低碳烷基。
“杂芳基磺酰氨基(Heteroarylsulfonylamino)”是指基团-NRqS(O)2Rt，其中Rt是任选取代的杂芳基，Rq是氢或低碳烷基。
“烷基羰基氨基(Alkylcarbonylamino)”是指基团-NRqC(O)2Rp，其中Rp是任选取代的烷基，Rq是氢或低碳烷基。
“芳基羰基氨基(Arylcarbonylamino)”是指基团-NRqC(O)2Rs，其中Rs是任选取代的芳基，Rq是氢或低碳烷基。
“杂芳基羰基氨基(Heteroarylcarbonylamino)”是指基团-NRqC(O)2Rt，其中Rt是任选取代的芳基，Rq是氢或低碳烷基。
“羧基(Carboxyl)”是指基团-C(O)ORr，其中Rr是氢、低碳烷基、取代的低碳烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“芳基(Aryl)”是指苯基或萘基，其可选地与环烷基稠合，所述环烷基优选地具有5-7个环原子，更优选具有5-6个环原子。
“取代的芳基(substituted aryl)”是芳基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂环或任选取代的杂芳基，所述基团在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“碳环(Carbocycle)”是指饱和基团、不饱和基团或芳基，其具有由键接的碳原子组成的单环或多稠环。所述环可以可选地不被取代或取代有，例如，卤素、低碳烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇、磺氨基和类似基团。
“杂环(Heterocycle)”是指饱和的、不饱和的或芳香碳环基团，其具有单环(例如，吗啉基、吡啶基或呋喃基)或多稠环(例如，萘并吡啶基(naphthpyridyl)、喹喔啉基、喹啉基、吲嗪基或苯并[b]噻吩基)并具有一个或多个杂原子，例如一个杂原子，如N、O或S，所述杂原子在单环中或在多稠环的多个环中的一个环中。
“取代的杂环(substituted heterocycle)”是杂环，其取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的取代基、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基，所述基团在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“氧代(Oxo)”是指与被连接碳原子形成双键的氧取代基。
“杂芳基(Heteroaryl)”和“杂芳基(hetaryl)”是指含有5或6个环原子的单环芳环结构，或具有8至10个原子的双环芳基，它们含有一个或多个，优选1-4个、更优选1-3个、甚至更优选1-2个杂原子，所述杂原子独立地选自O、S和N。杂芳基也意图包括氧化的S或N，如亚磺酰基、磺酰基和三环氮的N氧化物。碳原子或氮原子是杂芳环结构的连接点，由此保持稳定的芳环。杂芳基的例子是吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、唑基、噻唑基、噻吩基、异唑基、噻二唑基(oxathiadiazolyl)、异噻唑基、四唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基和类似基团。
“取代的杂芳基(Substituted heteroaryl)”和“取代的杂芳基”是指杂芳基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基，所述基团在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“杂环基(Heterocyclyl)”是指具有5至10个原子的非芳族环烷基，其中环中的1至3个碳原子被杂原子如O、S或N置换，可选地苯稠合或5-6个环原子的杂芳基稠合和/或如同在环烷基的情形中被任选取代。杂环基也意欲包括氧化的S或N，如亚磺酰基、磺酰基和三环氮的N氧化物。连接点位于碳原子或氮原子。杂环基的例子是四氢呋喃基、二氢吡啶基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、二氢苯并呋喃基、二氢吲哚基和类似基团。
“取代的杂环基(substituted hetercyclyl)”是杂环基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基、任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基，所述基团在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“芳烷基(Aralkyl)”是指基团-R-Ar，其中Ar是芳基，R是低碳亚烷基或取代的低碳亚烷基。芳烷基的芳基官能团可以可选地不被取代或取代有，例如，卤素、低碳烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、取代的杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇、磺氨基和类似基团。
“杂烷基(Heteroalkyl)”和“杂环烷基(heterocycloalkyl)”是指基团-R-Het，其中Het是杂环基团，R是低碳亚烷基或取代的低碳亚烷基。杂烷基可以可选地不被取代或取代有，例如，卤素、低碳烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、芳氧基、杂环、取代的杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇、磺氨基和类似基团。
“杂芳基烷基(Heteroarylalkyl)”和“杂芳烷基(heteroaralkyl)”是指基团-R-HetAr，其中HetAr是杂芳基，R是低碳亚烷基或取代的低碳亚烷基。杂芳基烷基和杂芳烷基可以可选地未取代或取代有，例如，卤素、低碳烷基、取代的低碳烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、芳基、芳氧基、杂环、取代的杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇、磺氨基和类似基团。
“环杂烷基(Cycloheteroalkyl)”是指环烷基，其中一个或多个环碳原子被杂原子(例如，N、O、S或P)置换。
“取代的环杂烷基(substituted cycloheteroalkyl)”是环杂烷基，其独立地取代有1个或多个，例如1、2或3个如 中定义的基团或取代基或任选取代的烷基，所述基团在任何可及部位连接以产生稳定的化合物。
“烷基环烷基(Alkyl cycloalkyl)”是指基团-R-cycloalk，其中cycloalk是环烷基，R是低碳亚烷基或取代的低碳亚烷基。烷基环烷基的环烷基官能团可以可选地未取代或取代有，例如，卤素、低碳烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、取代的杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇、磺氨基和类似基团。
“烷基环杂烷基(Alkyl cycloheteroalkyl)”是指基团-R-cycloheteroalk，其中cycloheteroalk是环杂烷基，R是低碳亚烷基或取代的低碳亚烷基。烷基环杂烷基的环杂烷基官能团可以可选地未取代或取代有，例如，卤素、低碳烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、酰氨基、羧基、双亚乙基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、取代的杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、硫醇、磺氨基和类似基团。
因此，在第一方面，本发明涉及本文所述的式I或式II或式III的新颖的化合物。如果没有另外指明，对具体化合物的提及包括所有异构形式，包括其外消旋异构体和其它混合物。用于制备(例如，不对称合成)和分离(例如，分级结晶和色谱方法)这种异构形式的方法是本领域已知的或容易采用本文教导的方法以已知方式获得。注意，如下面论述的，在异构体的上下文中一其中不饱和使得允许形成异构体，例如，顺式和反式，E-和Z-等，和其组合，认为对一种异构体的提及即为对所有这些异构体的提及，除非另外指明。如果没有另外指明，对一种具体化合物的提及也包括其离子、盐、溶剂化物(例如，水合物)、被保护形式和前体药物，例如，如下文所论述。
本发明的其它方面涉及药物制剂，其包括治疗有效量的式I或式II或式III的化合物(或任何这些通式化合物的亚类中的化合物)和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
在特定实施方案中，组合物包括多种不同的药物活性化合物，其可以是式I和/或式II和/或式III的多种化合物，也可以包含与式I和/或式II和/或式III的一种或多种化合物组合的其它化合物。
本发明的一个相关方面涉及药物组合物，其包括式I或式II或式III的化合物和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。组合物可以包括多种不同的药物活性化合物。
在另一个相关方面，可以用式I或式II或式III的化合物制备用于治疗PDE4B介导的疾病或状态的药物。
在另一方面，本发明涉及治疗或预防哺乳动物的疾病或状态的方法，通过向所述哺乳动物施用治疗有效量的式I或式II或式III的化合物、这些化合物的前体药物或这些化合物或前体药物的药学上可接受的盐来实施。化合物可以单独施用或者可以作为组合物的一部分施用。术语“前体药物(prodrug)”如本文所用，是指一种化合物，在其被代谢时，产生所需的活性化合物。典型地，前体药物是无活性的，或者相比活性化合物活性低，但是可以提供有利的操作、施用或代谢性质。例如，一些前体药物是活性化合物的酯，在新陈代谢期间，酯基被切割以产生活性药物。此外，一些前体药物被酶促激活，产生活性化合物，或在进一步化学反应后产生活性化合物的化合物。
因此，在又一方面，本发明涉及用于在动物患者中治疗PDEB4介导的疾病或状态的方法，所述动物例如哺乳动物，如人，所述疾病或状态例如，特征是异常的PDE4B活性。方法包括给予需要的患者有效量的式I或式II或式III的化合物、或含有式I或式II或式III的化合物的组合物。如本文所用，“有效量(effectiveamount)”的化合物或组合物，其意义包括无毒但可以提供所需治疗效果的足够量的其指代的特定化合物或组合物。
如本文所用，术语PDE4B介导的疾病或状态(PDE4B-mediated disease orcondition)是指疾病或状态，其中PDE4B的生物学功能影响疾病或状态的进展和/或过程，和/或其中对PDE4B的调节改变了进展、过程和/或症状。
在涉及治疗或预防疾病或状态的方面和实施方案中，所述疾病或状态是，例如，急性或慢性肺疾病如阻塞性疾病(例如，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纤维化)，间质性肺疾病(例如，先天性肺纤维化、结节病)，血管性肺疾病(例如，肺动脉高压)，支气管炎，过敏性支气管炎和肺气肿，但不限于这些疾病或状态。考虑用本发明实施方案治疗的其它疾病或状态包括，例如，CNS疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和亨延顿舞蹈病；炎性自身免疫病如多发性硬化、类风湿性关节炎和Crohn病以及其它炎性疾病，如脑缺血、炎性肠病和溃疡性结肠炎；骨病如骨质疏松症、骨硬化病和佩吉特病；癌症如弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病；严重急性呼吸综合征；和早产，但不限于这些疾病或状态。
对PDE4B具有活性的式I或式II或式III的化合物的鉴定也提供了鉴定或开发对PDE4B具有活性的其它化合物例如改进的调节剂的方法，如下实施确定对PDE4B具有活性的式I或式II或式III的多种测试化合物中的任何一种相对于对PDE4B具有活性的参照化合物，是否在一种或多种所需药学性质方面提供了改进，和在存在这样的化合物的情况下，选择在所需药学性质方面存在改进的化合物，从而提供改进的调节剂。
在调节剂开发的特定方面，所需药学性质是血清半衰期在2小时以上或4小时以上或8小时以上，水溶性，口服生物利用度在10％以上，口服生物利用度在20％以上。
此外，在调节剂开发的一个特定方面，参照化合物是式I或式II或式III的化合物。该过程可以重复多次，即，多轮地制备衍生物和/或选择其它相关化合物和评价相关化合物的这些其它衍生物，例如，1轮、2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮、8轮、10轮或更多轮。
在其它方面，将有关PDE4B的结构信息用于多种目的，例如，用于设计PDE4B活性的调节剂。此外，本发明提供了应用有关PDE4B的结构信息以及化合物例如式I或式II或式III或者式I或式II或式III的分子支架或支架核心来设计PDE4B活性的调节剂的方法。此外，可以在PDE4B活性的调节剂的设计中利用有关一种或多种其它PDEs的结构信息，例如，PDE5A、PDE4D。
本发明也提供了开发与PDE4B结合的配体的方法。方法包括将与PDE的结合部位结合的一种或多种化合物鉴定为分子支架；确定在与PDE的共晶体中至少一种分子支架的方向；鉴定一种或多种分子支架的化学结构，当该分子支架被修饰时，其改变分子支架和PDE之间的结合亲和力或结合特异性或使两者都改变；和合成配体，其中分子支架的一种或多种化学结构被修饰，从而提供以改变的结合亲和力或结合特异性或改变的上述两种性质与PDE结合的配体。这种支架可以，例如，是式I或式II或式III的化合物，或包括式I或式II或式III的核心。
术语“PDE4B磷酸二酯酶(PDE4B phosphodiesterase)”和“PDE4B”是指酶促活性的磷酸二酯酶，其含有与天然PDE4B的GenBank多肽序列JC1519(SEQID NO1)的氨基酸残基152-528(S152-S528)具有90％以上的氨基酸序列同一性的部分，这是对于在等长片段的最大比对而言的；或者含有保持与天然PDE4B配体结合性的天然PDE4B JC1519的氨基酸残基152-528的至少200个连续氨基酸90％以上的氨基酸序列同一性的部分。优选地，序列同一性是至少95％、97％、98％、99％或甚至100％。优选地，序列同一性的特定水平是在至少300个连续氨基酸残基长度的序列内。JC1519的氨基酸残基152-528表示的序列也可以以NP_002591的S324至S700(由NM_002600编码，SEQ ID NO2)、AAB96381的S309至S685(SEQ ID NO3)和AAA35643的S194至S570(SEQ ID NO4)得到。因此，在一个列出的序列中鉴定出的氨基酸残基也可以被表示为任何其它列出的序列或其它匹配序列中的匹配氨基酸残基。
术语“PDE4B磷酸二酯酶结构域(PDE4B phosphodiesterase domain)”是指降低长度的PDE4B(即，比全长PDE4B短至少100个氨基酸)，其包含PDE4B中的磷酸二酯酶催化区域。在本发明的应用中高度优选的是，磷酸二酯酶结构域保留有磷酸二酯酶活性，优选地是与天然PDE4B相比，保留有磷酸二酯酶活性水平的至少50％，更优选地保留有天然活性的至少60％、70％、80％、90％或100％。
如本文所用，术语“配体(ligand)”和“调节剂(modulator)”等价应用，是指上调或下调靶标生物分子活性的化合物，靶标生物分子例如酶，如激酶或磷酸二酯酶。一般而言，配体或调节剂将是小分子，其中“小分子”是指分子量为1500道尔顿或更低、或者优选地1000道尔顿或更低、800道尔顿或更低、或600道尔顿或更低的化合物。因此，“改进的配体(improved ligand)”是拥有比参照化合物更好的药学性质和/或药物动力学性质的配体，其中“更好”可以针对特定生物系统或治疗用途而限定。在从支架开发配体的情况下，配体是支架的衍生物。
如本文所用，术语“调节(modulating)”或“调节(modulate)”是指改变生物学活性，特别是与特定生物分子如PDE4B相关的生物学活性的效应。例如，特定生物分子的激动剂或拮抗剂调节该生物分子例如酶的活性。
在结合化合物(binding compound)、分子支架和配体的上下文中，术语“衍生物(derivative)”或“衍生化合物(derivative compound)”是指具有下述化学结构的化合物，所述化学结构含有与母体化合物或参照化合物相同的核心化学结构，但是由于具有至少一个结构差异而不同于母体化合物或参照化合物，例如，具有添加的和/或去除的和/或取代的一个或多个取代基，和/或具有用不同原子取代的一个或多个原子。如果没有明确的相反指示，术语“衍生物”不是指，该衍生物是用母体化合物作为起始物质或中间体合成的，虽然在一些情况下，衍生物可以从母体合成。
因此，术语“母体化合物(parent compound)”是指针对另一化合物的参照化合物，其具有衍生化合物中保留的结构特征。母体化合物常常但不是总是具有比衍生物简单的化学结构。
“化学结构(chemical structure)”或“化学亚结构(chemical substructure)”是指构成分子的一部分的任何可定义的原子或原子团。通常地，支架或配体的化学亚结构在将该支架或配体结合到靶标分子中可以起作用，或者可以影响该支架或配体的三维形状、静电电荷和/或构象性质。术语“靶标分子(target molecule)”包含结合配体的蛋白质，例如磷酸二酯酶，包括PDE4B。
与靶标和潜在的结合化合物之间的相互作用相关的术语“结合(binds)”表明，与和蛋白质的一般结合(即，非特异性结合)相比，潜在的结合化合物与靶标的结合达到统计学上显著的程度。因此，术语“结合化合物(binding compound)”是指与靶标分子有统计学上显著的结合的化合物。优选地，结合化合物与指定的靶标相互作用，解离常数(kd)是1mM或更低。结合化合物可以“低亲和力”、“很低的亲和力”、“极低亲和力”、“中度亲和力”、“适度高的亲和力”或“高亲和力”进行结合，如本文所述。
在化合物与靶标结合的上下文中，术语“更高的亲和力(greater affinity)”表明，该化合物比参照化合物或比参照条件下的相同化合物结合得更加紧密，即，具有更低的解离常数。在特定实施方案中，更高的亲和力是至少2、3、4、5、8、10、50、100、200、400、500、1000或10,000倍高的亲和力。
同时，在化合物与生物分子靶标结合的上下文中，术语“更高的特异性(greater specificity)”表明，一种化合物与指定靶标的结合程度比与可以在相关结合条件下存在的另一种生物分子或多种生物分子的结合程度更高，其中结合至这样的其它生物分子产生与结合至指定靶标不同的生物活性。典型地，特异性是针对限定组的其它生物分子而言的，例如，在PDE4B的情况下，是针对其它磷酸二酯酶(例如PDE4D)或者甚至其它类型的酶而言的。在特定实施方案中，更高的特异性是至少2、3、4、5、8、10、50、100、200、400、500或1000倍的特异性。
正如有关化合物与靶标的结合中所用，术语“相互作用(interact)”表明，从结合化合物到特定氨基酸残基的距离将是5.0埃或更近。在特定实施方案中，从化合物到特定氨基酸残基的距离是4.5埃或更近、4.0埃或更近、或3.5埃或更近。此距离可以被确定，例如，应用共晶体学，或者应用对活性部位中的化合物的计算机拟合进行估计。
对PDE4B中特定氨基酸残基的多肽残基编号的提及是由相应于NCBI蛋白质序列登记号JC1519的编号定义的，例如，在McLaughlin et al.，J.Biol.Chem.268(9)，6470-6476(1993)；Obernolte et al.，Gene 129(2)，239-247(1993)；和Bolger etal.，Mol.Cell.Biol.13(10)，6558-6571(1993)中所述。如上所说明的，也可以用来自其它匹配PDE4B序列的可选择的编号。
在一个相关方面，本发明提供了开发特异于PDE4B的配体的方法，其中所述方法包括确定与多种磷酸二酯酶结合的化合物的衍生物对该特定磷酸二酯酶的特异性相对其它磷酸二酯酶而言是否比母体化合物更高。
如本文中有关结合化合物或配体所用，术语“对PDE4B磷酸二酯酶具有特异性”、“对PDE4B具有特异性”和类似意义的术语是指，特定化合物与PDE4B的结合达到了在统计学上比其与可能在特定生物体中存在的其它磷酸二酯酶的结合更高的程度。而且，在说明除结合之外的生物活性时，术语“对PDE4B具有特异性”表明，与对其它磷酸二酯酶的活性相比，特定化合物具有与结合PDE4B相关的更高的生物活性。优选地，特异性也针对可能在生物体中存在的其它生物分子(不限于磷酸二酯酶)而言。
在另一方面，本发明提供了获得结合PDE4B的改进配体的方法。该方法考虑鉴定与该特定PDE结合的化合物，确定该化合物是否和一个或多个保守的活性部位残基相互作用，和确定该化合物的衍生物是否以比母体结合化合物更高的亲和力或更高的特异性或更高的两者与该PDE结合。以比母体结合化合物更高的亲和力或更高的特异性或更高的两者结合表明，该衍生物是改进配体。此过程也可以在连续轮的选择和衍生化中和/或用多种母体化合物进行，以提供具有改进配体特性的一种化合物或多种化合物。同样，衍生化合物可以被测试和选择，得到对该PDE的高选择性，或得到对特定靶标集合的交叉反应性，例如，对包括PDE4B和/或PDE4D的磷酸二酯酶子集。在特定实施方案中，可以应用已知的PDE4B抑制剂，可以开发具有更高亲和力和/或更高特异性的衍生物，其中优选地应用PDE4B和/或PDE4D结构信息；开发出相对于PDE4D而言对PDE4B的更高特异性。
“分子支架(molecular scaffold)”或“支架(scaffold)”是指简单的靶结合分子，可以对其进行一个或多个附加化学部分的共价连接、修饰或消除，以形成具有共同结构要素的多个分子。所述部分可以包括但不限于卤素原子、羟基、甲基、硝基、羧基或任意其它类型的分子基团，包括但不限于在本申请中陈述的那些。分子支架与至少一个靶标分子结合，优选地与一个蛋白质家族中的多个分子结合，靶标分子可以优选地是酶、受体或其它蛋白质。支架的优选特性可以包括，在靶标分子结合部位结合，以使得支架上的一个或多个取代基被置于靶标分子结合部位的结合口袋中；具有可以被化学修饰的化学上易处理的结构，特别是通过合成反应，由此可以容易地构建组合文库；具有部分(moieties)可以被连接的化学部位，其不干扰支架与蛋白结合部位的结合，使得支架或文库成员可以被修饰，形成配体，以得到附加的所需特性，例如，能够使配体活性地转运到细胞和/或特定器官中，或者能够使配体被连接到色谱柱，用于进一步分析。因此，分子支架是在修饰以改进结合亲和力和/或特异性或其它药学性质之前被鉴定的靶标结合分子。
术语“支架核心(scaffold core)”是指可以在其上连接多种取代基的分子支架的基础化学结构。因此，对于特定化学类型的大量支架分子，支架核心是所有支架分子共有的。在许多情况下，支架核心包括一个或多个环结构。
对于式I而言，支架核心包含5元环、两个氨基氮和-C＝y基团；具体的式I支架核心由X的每种选择与Y的每种选择的各种组合来描述。
对于式II，支架核心包括带有R13和R14的5元环。具体的式II支架核心被如下描述X的每种选择，与对连接到5元环的R13原子的O、S或N的每种选择的各种组合，与对连接到5元环的R14原子的O、S、N、C的每种选择的各种组合。
对于式III，支架核心包括磺酰胺部分；在一些实施方案中，支架核心包括带有与5元环如噻吩环连接的硫(例如与环中的硫相邻的C连接)的磺酰胺部分。
“结合部位(binding site)”是指，配体可以与其非共价结合的靶标分子的区域。结合部位表现出特定形状，并且在结合部位中通常含有多个结合口袋。特定形状在一类分子中通常是保守的，例如在一个分子家族中通常是保守的。一类分子中的结合部位也可以含有保守结构如，例如，化学部分，存在结合口袋，和/或在结合部位或结合部位的某些部分存在静电电荷，所有这些都可以影响结合部位的形状。
“结合口袋(binding pocket)”是指结合部位中的特定容积。结合口袋通常可以是结合部位中的特定形状、凹穴或腔。结合口袋可以包括在非共价结合另一分子中具有重要性的特定化学基团或结构，如，例如，有助于分子间的离子键、氢键或范德华相互作用的基团。
在提及与靶标分子结合的结合化合物时，“方向(orientation)”指结合化合物(其可以参照其组成原子中的至少一些来限定)与结合口袋和/或至少部分限定结合口袋的靶标分子中的原子的空间关系。
在本发明中的靶标分子的上下文中，术语“晶体(crystal)”是指类型适于X线晶体分析法的靶标分子的规则集聚。即，当用X线束照射时，该集聚产生X线衍射图。因此，将晶体与不产生衍射图的靶标分子的凝聚或其它复合物区分开来。
“共晶体(co-crystal)”指与靶标分子非共价结合的化合物、分子支架或配体的复合物，并且以适于用X线晶体学或蛋白质晶体学分析的晶体形式存在。在优选实施方案中，靶标分子-配体复合物可以是蛋白质-配体复合物。
短语“改变结合亲和力或结合特异性(alter the binding affinity or bindingspecificity)”分别是指，改变第一化合物对另一化合物的结合常数，或与第一化合物对第三化合物的结合水平相比，改变第一化合物对第二化合物的结合水平。例如，如果与化合物对不相关蛋白质的结合相比，其与特定蛋白质结合的相对水平增加，则该化合物对该特定蛋白质的结合特异性增加。
如本文有关测试化合物、结合化合物和调节剂(配体)所用，术语“合成(synthesizing)”和类似术语是指从一种或多种前体物质进行的化学合成。
短语“分子支架的化学结构被修饰(chemical structure of the molecularscaffold is modified)”是指，衍生物分子具有不同于分子支架，但是仍然含有共同核心化学结构特征的化学结构。该短语不一定是指将分子支架用作衍生物合成中的前体。
“分析(assaying)”指创造实验条件和收集有关实验条件的具体结果的数据。例如，可以基于酶作用于可检测底物的能力对其进行分析。可以基于化合物或配体与一种特定靶标分子或多种分子结合的能力对其进行分析。
化合物的“组(set)”指代化合物的集合。化合物可以在结构上相关或可以不在结构上相关。
在另一方面，通过从PDE4B结构的电子呈现(representation)建立同源模型，也可以用有关PDE4B的结构信息帮助确定另一磷酸二酯酶的结构。
典型地，建立这样的同源模型包括鉴定具有已知结构的已知PDE如PDE4B和其它感兴趣磷酸二酯酶之间的保守氨基酸残基；将已知结构中的多个保守氨基酸的原子坐标转移到另一磷酸二酯酶的相应氨基酸，以提供该磷酸二酯酶的粗略结构；和用该另一磷酸二酯酶中的剩余氨基酸残基结构的电子表示构建代表该另一磷酸二酯酶残余部分的结构。具体而言，对于PDE4B，可以应用2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435中的表1中的坐标，所述申请以整体并入本文作为参考。可以应用在结合部位中的保守残基。
为了协助开发磷酸二酯酶结构的其它部分，同源模型也可以利用来自磷酸二酯酶的一种或多种晶体的低分辨率x线衍射数据，或者与其拟合，例如，以便帮助连接保守残基和/或更好地指定多肽末端部分的坐标。
应用的PDE4B结构信息可以是针对多种不同的变体，包括全长野生型、天然发生的变体(例如，等位基因变体和剪接变体)、野生型或天然发生变体的截短型变体，和全长或截短的野生型或天然发生变体的突变体(其可以在一个部位或多个部位被突变)。例如，为了提供与多种其它磷酸二酯酶结构更接近的PDE4B结构，可以应用在结合部位中包括对保守残基的突变的突变PDE4B。
在另一方面，本发明提供了PDE4B的晶体形式，其可以是长度减少的PDE4B，如磷酸二酯酶结构域。该晶体形式可以含有一种或多种重金属原子，例如，用于X线晶体学的原子。该晶体形式也可以包括共晶体中的结合化合物，例如，与PDE中的一个或多个保守的活性部位残基或者这些残基中的任意两个、任意三个、任意四个、任意五个、任意六个相互作用的结合化合物，并且可以是，例如，已知的PDE抑制剂。这样的PDE晶体可以处于多种环境下，例如，在结晶板中，被安放用于X线晶体学和/或在X线束中。PDE可以是多种形式，例如，野生型、变体、截短型和/或如本文所述的突变形式。
本发明还涉及PDE4B的共晶体，其可以是长度降低的PDE例如磷酸二酯酶结构域，和PDE4B结合化合物。有利的是，这样的共晶体具有足够的大小和质量，使得PDE的结构测定达到至少3埃、2.5埃、2.0埃、1.8埃、1.7埃、1.5埃、1.4埃、1.3埃或1.2埃。共晶体可以，例如，在结晶板中，被安放用于X线晶体学和/或在X线束中。这样的共晶体是有益的，例如，用于得到有关PDE和结合化合物之间的相互作用的结构信息。
在特定的实施方案中，结合化合物包括式I、式II或式III的核心结构。
PDE4B结合化合物可以包括与PDE中的保守的活性部位残基中的至少一个或那些残基中的任意2个、3个、4个、5个或6个相互作用的化合物。与PDE4B结合的示范性化合物包括在本文引用的参考文献中描述的化合物。
同样地，在其它方面，提供了用于获得PDE4B晶体和共晶体的方法。在本发明的一个方面，提供了用于获得PDE4B磷酸二酯酶结构域的晶体的方法，所述方法包括使PDE4B蛋白以5-20mg/ml，例如，8-12mg/ml的浓度经受结晶条件，所述结晶条件基本上等价于30％PEG 400、0.2M MgCl2、0.1M Tris pH 8.5、1mM结合化合物，4℃；或者20％PEG 3000、0.2M Ca(OAc)2、0.1M Tris pH 7.0、1mM结合化合物、15.9mg/ml蛋白质，4℃；或1.8M-2.0M硫酸胺、0.1M CAPS pH10.0-10.5、0.2M硫酸锂。
可以用筛选试剂盒例如Hampton Research(Riverside，CA)筛选试剂盒1初始鉴定结晶条件。可以选择形成晶体的条件，并根据证明的结晶条件对结晶条件进行优化。为了帮助随后的晶体学研究，可以用硒代甲硫氨酸标记PDE。同样地，如上所述，PDE可以处于多种形式，例如，截短型，以提供磷酸二酯酶结构域，可以将其选择为多种长度。
在另一方面，提供对PDE4B具有活性的化合物(如用本文所述方法开发出的化合物)也提供了调节PDE活性的方法，其中使PDE和与PDE结合并与一个或多个保守活性部位残基相互作用的化合物接触。所提供的化合物优选的水平足以调节PDE的活性至少10％、更优选地至少20％、30％、40％或50％。在许多实施方案中，化合物的浓度将是约1μM、100μM或1mM，或者在1-100nM、100-500nM、500-1000nM、1-100μM、100-500μM或500-1000μM范围。
术语“PDE4B活性”是指PDE4B的生物学活性，特别包括磷酸二酯酶活性。
在应用、测试或筛选化合物-所述化合物是调节剂或可能是调节剂-的上下文中，术语“接触(contacting)”是指，使化合物充分接近特定分子、复合物、细胞、组织、生物体或其它指定物质，化合物和其它指定物质之间可以发生潜在的结合相互作用和/或化学反应。
在一个相关方面，本发明提供了用于治疗患有以异常的PDE4B磷酸二酯酶活性为特征的疾病或状态的患者的方法。本发明方法包括给予患者有效量的通过本文所述方法鉴定的化合物。
可能被治疗或防止的具体疾病或病症包括在本文的发明详述以及在本文引用的参考文献中描述的那些疾病。
因为已经开发和分析了PDE4B晶体，并且已经确定了结合模式，本发明的另一方面涉及这些PDEs(其可以是长度降低的PDE)的电子表示，例如，含有相应于2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435中的表1中列出的PDE4B坐标的PDE4B原子坐标表示的电子表示，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的，或者示意图表示例如显示二级结构和/或链折叠的示意图表示，也可以显示出保守的活性部位残基。PDE可以是野生型、等位基因变体、突变形式或修饰形式，例如，如本文所述。
也可以通过用其它残基的电子表示置换特定残基的电子表示来修饰电子表示。因此，例如，通过用不同的氨基酸置换结合部位中的特定保守残基的坐标，可以对含有相应于2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435中的表1、2、3或4中列出的PDE4B坐标的原子坐标表示的电子表示进行修饰，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。一种修饰或多种修饰之后，可以调整总体结构的表示，以允许发生受到该一种修饰或多种修饰的影响的已知相互作用。在大多数情况下，涉及多于一个残基的修饰将以循环方式进行。
此外，可以包括PDE4B结合化合物或结合部位中的测试化合物的电子表示，例如，不可水解的cAMP类似物或包含西地那非的核心结构的化合物。
同样地，在一个相关方面，本发明涉及部分PDE4B的电子表示，其可以是结合部位(其可以是活性部位)或磷酸二酯酶结构域，例如，JC1519的PDE4B残基152-528，或本文所述的其它磷酸二酯酶结构域。结合部位或磷酸二酯酶结构域可以以多种方法表示，例如，以结合部位周围的残基的原子坐标表示和/或以结合部位表面轮廓表示，并且可以包括结合部位处的特定残基例如保守残基的结合特性的表示。结合部位优选地包括不多于1个重金属原子；结合化合物或测试化合物例如包含式I、式II或式III的核心结构的化合物可以在结合部位中存在；结合部位可以是野生型、变体、突变体形式或修饰形式的PDE4B的结合部位；电子表示包括保守残基的表示坐标，正如例如，在2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435的表1、2、3或4中给出的，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。
在又一方面，PDE4B的结构和序列信息可以被用在另一PDE的同源模型中。对这种模型应用PDE4B的高分辨率结构信息是有用的，例如，至少1.7、1.5、1.4、1.3或1.2埃的分辨率。
在又一方面，本发明提供了修饰的PDE4B晶体结构的电子表示，其包括基于2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435的表1、2、3和/或4中的原子坐标的修饰PDE4B的原子坐标的电子表示，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。在一个示范性实施方案中，通过将保守残基的原子坐标置换为不同氨基酸的原子坐标，可以对原子坐标进行修饰。修饰可以包括取代、缺失(例如，C端和/或N端缺失)、插入(内部、C端和/或N端)和/或侧链修饰。
在另一方面，PDE4B结构信息提供了基于PDE4B开发有用的生物试剂的方法，通过分析PDE4B结构来鉴定用于形成生物试剂的至少一种亚结构来实施。这样的亚结构可以包括用于形成抗体的表位，方法包括开发针对表位的抗体，例如，通过在哺乳动物如兔、豚鼠、猪、羊或马中注射表位递呈组分(epitope presentingcomposition)。亚结构也可以包括突变位点，在该处的突变有望或已知可改变PDE4B的活性，方法包括在该位点产生突变。进一步地，亚结构可以包括连接单独部分的连接点，所述单独部分例如肽、多肽、固相材料(例如，珠子、凝胶、色谱介质、载片、芯片、平板和孔表面)、接头和标签(例如，直接标签如荧光团或间接标签如生物素或特异结合对的另一成员)。方法可以包括连接该单独部分。
在另一方面，本发明提供了用于鉴定潜在的PDE4B结合化合物的方法，通过在PDE结合部位的电子表示中拟合化合物的至少一种电子表示来实施。结合部位的表示可以是更大部分的PDE分子或整个PDE分子的电子表示的一部分，或者可以仅是催化结构域或结合部位或活性部位的表示。电子表示可以如上所述或如本文所述。对于PDE4B，电子表示包括根据2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435的表1、2、3或4中的坐标的表示，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的，特别是带有与以前提出的PDE4B结构明显不同的坐标的残基。
在特定实施方案中，方法包括拟合来自计算机数据库的化合物的计算机表示和PDE活性部位的计算机表示，并包括去除与PDE分子络合的化合物的计算机表示，和根据有利的几何配合和能量上有利的互补相互作用将最适合于活性部位的化合物鉴定为潜在的结合化合物。在特定实施方案中，化合物是已知的PDE4B抑制剂，例如，如本文引用的参考文献中所述，或者其衍生物。
在其它实施方案中，方法包括修饰与PDE分子络合的化合物的计算机表示，通过对一个或多个化学基团进行删除或添加或删除和添加来实施；拟合来自计算机数据库的化合物的计算机表示和PDE分子活性部位的计算机表示；和根据有利的几何配合和能量上有利的互补相互作用将最适合于活性部位的化合物鉴定为潜在的结合化合物。
在又一实施方案中，方法包括去除与PDE络合的化合物的计算机表示，和应用化合物搜索计算机程序搜索数据库中与该络合化合物具有结构相似性的化合物或利用化合物构建计算机程序用相似的化学结构置换该络合化合物的一部分。
拟合化合物可以包括确定一种化合物是否会与PDE的一个或多个保守的活性部位残基相互作用。选择用于拟合的化合物或者与PDE络合的化合物，例如，可以是已知的PDE4B抑制剂化合物或含有这样的化合物的核心结构的化合物。
在另一方面，本发明涉及将PDE4B结合化合物连接到连接成分(attachmentcomponent)的方法，以及鉴定PDE4B结合化合物上的连接部位的方法。方法包括为与PDE4B的结合部位结合的结合化合物鉴定用于连接连接成分的能量许可部位；和在该能量许可部位将化合物或其衍生物连接到连接成分。“能量许可部位(Energetically allowed sites)”是具有下列性质的分子区域与连接成分的存在相关的任何自由能变化不会使化合物与磷酸二酯酶的结合去稳定到会破坏该结合的程度。
连接成分可以包括，例如，用于连接到固相或另一分子或其它部分的接头(包括无痕接头)。通过在与固相介质连接的接头上合成化合物或衍生物，可以形成这样的连接，例如，在多种化合物的组合合成中。同样地，与固相介质的连接可以提供亲和介质(例如，用于亲和色谱)。
连接成分也可以包括标签，其可以是直接可检测标签如荧光团，或间接可检测标签如特异结合对的一个成员，例如生物素。
在一个相关方面，鉴定PDE4B结合化合物上的能量许可部位的能力也提供了带有连接的接头的修饰的结合化合物，连接的接头优选地位于能量许可部位以便可以将修饰的化合物结合到PDE4B。接头可以被连接到如上述的连接成分。
本发明的另一方面涉及修饰的PDE4B多肽，其包括使得修饰的PDE4B比天然PDE4B更加类似于另一磷酸二酯酶的修饰，并且也可以包括其它突变或其它修饰。在各种实施方案中，多肽包括全长PDE4B多肽，包括修饰的PDE4B结合部位，包括来自含有保守部位的PDE4B的至少20个、30个、40个、50个、60个、70个或80个连续氨基酸残基。
本发明的又一方面涉及开发磷酸二酯酶的配体的方法，所述酶包括分别与保守PDE4B活性部位残基的任意1个、2个、3个、4个、5个或6个残基相匹配的保守残基，所述方法通过确定一种化合物是否结合于磷酸二酯酶并与PDE4B晶体或PDE4B结合模型中的这些活性部位残基相互作用来实施，其中PDE4B晶体或PDE4B结合模型具有2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435的表1、2、3和/或4中的坐标，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。方法也可以包括，确定化合物是否调节磷酸二酯酶的活性。优选地，该磷酸二酯酶与等长的磷酸二酯酶结构域片段具有至少50％、55％、60％或70％的同一性。
在特定实施方案中，确定过程包括在磷酸二酯酶的结合部位中计算机拟合化合物和/或该方法包括形成磷酸二酯酶和化合物的共晶体。可以用这样的共晶体确定化合物与磷酸二酯酶的结合方向和/或提供磷酸二酯酶的结构信息，例如，关于结合部位和相互作用的氨基酸残基的结构信息。这样的结合定向和/或其它结构信息可以应用X线晶体学来完成。
本发明也提供了结合于和/或调节(例如抑制)PDE4B磷酸二酯酶活性的化合物，例如，由本文描述的方法鉴定的化合物。因此，在涉及PDE4B结合化合物、分子支架和配体或调节物的方面和实施方案中，化合物是弱结合化合物；中度结合化合物；强结合化合物；化合物与PDE中的一个或多个保守活性部位残基相互作用；化合物是小分子；化合物与多种不同的磷酸二酯酶(例如，至少2、3、4、5、7、10或更多种不同的磷酸二酯酶)结合。特别地，本发明涉及被鉴定或选择的化合物。
在又一实施方案中，本发明涉及通过利用特定的差异部位来鉴定在PDE4B和PDE4D之间具有选择性的化合物的方法。方法包括分析一种化合物是否在PDE4B和PDE4D中在至少一个差异部位有差异性相互作用，其中差异性相互作用提示了这种选择性。“差异部位(differential sites)”从晶体结构比较中被鉴定并且代表了具有不同化学性质的部位，所述化学性质例如，电荷密度、原子位置、水合程度和类似性质，这在被比较的结构之间的比较中观察到。
在特定实施方案中，分析包括在PDE4B和PDE4D的结合部位的电子表示中拟合化合物的电子表示，和根据所述拟合确定该化合物是否具有差异相互作用；方法包括选择与PDE4B和PDE4D都结合的起始化合物，在PDE4B和PDE4D的结合部位的电子表示中拟合起始化合物的电子表示，对具有与至少一个差异部位相互作用的至少一个部分的起始化合物的电子表示进行修饰，和确定修饰的化合物是否与PDE4B和PDE4D差异结合；修饰的化合物的差异结合比起始化合物具有更高的程度；方法也包括分析差异性相互作用的化合物对PDE4B和PDE4D的差异活性；起始化合物包括西地那非支架结构；起始化合物包括西地那非核心。
在涉及与结合化合物相关的PDE4B原子坐标的上述各个方面，坐标是通过本文所述方法得到的X线结晶结构提供的。随后可以用传统的模建方法调整那些坐标，以便拟合具有不同于西地那非的结构的化合物，因此那些坐标可以用来开发不同于目前描述的PDE4B调节物的PDE4B调节物。可以用本文所述方法提供的PDE4B晶体坐标替代以前描述的PDE4B晶体坐标。
通过下面的详细描述和权利要求书，其它方面和实施方案将是明显的。
附图简述

图1提供了具有多克隆位点的pET15S的核酸序列。
图2提供了如本文所述的研究中所用的PDE4B磷酸二酯酶结构域的核酸序列。
图3提供了如本文所述的研究中所用的PDE4B磷酸二酯酶结构域的氨基酸序列。
图4示出了PDE4B和PDE4D磷酸二酯酶结构域的比对，具有可以被开发用来设计选择性配体的被圈起的3个区域。
图5示出了PDE4B磷酸二酯酶结构域的带状图(ribbon diagram)示意性图示。
优选实施方案详述 式I的示范性化合物表示在表1A中。表1B示出了式I化合物的示范性活性数据。表1C示出了本发明的其它示范性化合物。
式II的示范性化合物表示在表2A中。表2B示出了式II化合物的示范性活性数据。
表3A示出了式III化合物的示范性化合物和活性数据。表3B示出了本发明的其它示范性化合物。
表1A、2A和3A中提供的系统化学名是通过ISIS Programn的AutoNom2000add-in feature(Elsevier MDL，San Leandro，California)自动生成的。在一种化学物质的图形描述和所述化学物质的系统命名有差异的情况下，该图形描述代表所意图的化学结构。
I.概述 本发明涉及作为PDE4B抑制剂的式I、式II和式III化合物，和应用PDE4B磷酸二酯酶结构，结构信息，和用于开发具有那些结构的调节PDE4B磷酸二酯酶活性的改进化合物的相关化合物。
许多专利出版物涉及PDE4抑制剂和它们的应用。大多数这些出版物着眼于PDE4D。例如，Marfat et al.的美国专利6,559,168描述了PDE4抑制剂，特别是PDE4D抑制剂，并且引用了描述其它PDE4抑制剂的其它专利出版物。这样的其它出版物包括Marfat et al.，WO 98/45268；Saccoomano et al.，美国专利4,861,891；Pon，美国专利5,922,557；和Eggleston，WO 99/20625。
Ait Ikhlef et al.，美国专利出版物20030064374，申请号10/983,754描述了对PDE4B具有活性的化合物和它们在治疗神经毒性中的应用，包括在神经变性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、亨延顿舞蹈病和脑缺血的治疗中的应用。
与PDE4B相关的示范性疾病 对PDE4B的调节已被关联到对许多不同疾病和状态的治疗。例如，AitIkhlef et al.，美国专利出版物20030064374，申请号10/983,754描述了对PDE4B具有活性的化合物和它们在治疗神经毒性中的应用，包括在神经变性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、亨延顿舞蹈病和脑缺血的治疗中的应用。
因此，可以将PDE4B调节剂用于治疗或预防与PDE4特别是PDE4B相关的这些状态。可以被治疗的其它状态包括急性或慢性肺疾病如阻塞性疾病(例如，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纤维化)，间质性肺疾病(例如，先天性肺纤维化、结节病)，血管性肺疾病(例如，肺动脉高压)，支气管炎，过敏性支气管炎和肺气肿，但不限于这些疾病或状态。考虑用本发明实施方案治疗的其它疾病或状态包括，例如，CNS疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和亨延顿舞蹈病；炎性自身免疫病如多发性硬化、类风湿性关节炎和Crohn病以及其它炎性疾病，如脑缺血、炎性肠病和溃疡性结肠炎；骨病如骨质疏松症、骨硬化病和佩吉特病；癌症如弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病；严重急性呼吸综合征；和早产，但不限于这些疾病或状态。
II.晶体PDE4B 晶体PDE4B包括天然晶体、磷酸二酯酶结构域晶体、衍生物晶体和共晶体。天然晶体一般包括基本上纯的多肽，对应于晶体形式的PDE4B。PDE4B磷酸二酯酶结构域晶体一般包括晶体形式的基本上纯的PDE4B磷酸二酯酶结构域。关于PDE4B磷酸二酯酶功能的抑制剂的开发，分别将PDE4B磷酸二酯酶结构域用于结构确定是有利的，因为减少的序列的应用简化了结构确定。为了用于这一目的，磷酸二酯酶结构域应当是有活性的和/或保持天然类型的结合，这从而表明磷酸二酯酶结构域具有基本上正常的3D结构。
应当理解，本发明的晶体磷酸二酯酶和磷酸二酯酶结构域不限于天然发生的或天然的磷酸二酯酶。事实上，本发明的晶体包括天然磷酸二酯酶的突变体的晶体。天然磷酸二酯酶的突变体是通过用不同的氨基酸残基置换天然磷酸二酯酶中的至少一个氨基酸残基，或通过在天然多肽内或天然多肽的N端或C端加入或删除氨基酸残基得到的，并且具有与得到突变体的天然磷酸二酯酶基本上相同的三维结构。
具有基本上相同的三维结构是指具有这样一组原子结构坐标，当其与衍生出突变体的天然磷酸二酯酶的原子结构坐标叠加，天然磷酸二酯酶结构域的至少约50％至100％的Cα原子被包含在该叠加中时，均方根差偏差小于或等于约2。
不明显干扰磷酸二酯酶三维结构的氨基酸取代、缺失和添加将部分取决于发生取代、添加或缺失的磷酸二酯酶区域。在分子的高度可变区，非保守性取代以及保守性取代可以被允许而不显著干扰分子的三维结构。在高度保守区域，或含有显著二级结构的区域，优选保守性氨基酸取代。通过PDE4B和其它磷酸二酯酶的序列比对，可以鉴定这样的保守区域和可变区域。
保守性氨基酸取代是本领域中已知的，包括在所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性基础上作出的取代。例如，负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有具有相似亲水性值的不带电的极性头部基团的氨基酸包括下列亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。其它保守性氨基酸置换是本领域中公知的。
对于全部或部分通过化学合成得到的磷酸二酯酶，对可以利用进行取代或添加的氨基酸的选择不限于遗传编码的氨基酸。事实上，本文所述的突变体可以包含非遗传编码氨基酸。许多普遍已知的非遗传编码氨基酸的保守性氨基酸取代是本领域中公知的。其它氨基酸的保守取代可以根据它们与遗传编码氨基酸性质相比的物理性质确定。
在一些情况下，对天然磷酸二酯酶取代、缺失和/或添加氨基酸残基是特别有益的或方便的，目的是在编码多肽的cDNA中提供方便的多克隆位点，以协助多肽的纯化和多肽的结晶。这样的基本上不改变天然磷酸二酯酶结构域的三维结构的取代、缺失和/或添加对本领域普通技术人员将是明显的。
应该指出，本文考虑的突变体不必都表现出磷酸二酯酶活性。事实上，干扰磷酸二酯酶活性但是不显著改变结构域的三维结构的氨基酸取代、添加或缺失被本发明特别考虑。可以用这样的晶体多肽、或从其得到的原子结构坐标来鉴定与天然结构域结合的化合物。这些化合物可以影响天然结构域的活性。
本发明的衍生晶体可以包括与一个或多个重金属原子共价连接的晶态磷酸二酯酶多肽。多肽可以对应于天然或突变的磷酸二酯酶。用于提供衍生物晶体的重金属原子的实例包括，金、汞、硒等，但不限于这些金属。
本发明的共晶体一般包括与一种或多种化合物缔合的晶体磷酸二酯酶结构域多肽。缔合可以是共价的或是非共价的。这样的化合物包括但不限于，辅因子、底物、底物类似物、抑制剂、别构效应物等。
III.应用X射线晶体学测定三维结构 X射线晶体学是解析分子三维结构的方法。应用晶体作为衍射光栅从X射线衍射图计算出分子的结构。蛋白质分子的三维结构从该蛋白质的浓缩水溶液中生长出的晶体得到。X射线晶体学方法可以包括下列步骤(a)合成和分离(或者以其它方式获得)多肽；(b)在含有调节物或不含有调节物的情况下，从含有所述多肽的水溶液中生长出晶体；和(c)收集来自所述晶体的X线衍射图，确定晶胞大小和对称性，测定电子密度，拟合所述多肽的氨基酸序列和电子密度，和精修该结构。
多肽的生成 本文所述的天然和突变的磷酸二酯酶多肽可以应用本领域公知的技术全部或部分地化学合成(参见，例如，Creighton(1983)Biopolymers 22(1)49-58)。
可选地，可以用本领域技术人员公知的方法构建含有天然或突变磷酸二酯酶多肽编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如，在Maniatis，T(1989).Molecular cloningA laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，New York.Cold Spring Harbor Laboratory Press；and Ausubel，F.M.et al.(1994)Current Protocolsin Molecular Biology.John Wiley & Sons，Secaucus，N.J.中描述的技术。
可以利用多种宿主表达载体系统来表达磷酸二酯酶编码序列。这些包括但不限于微生物例如用含有磷酸二酯酶结构域编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的细菌；用含有磷酸二酯酶结构域编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有磷酸二酯酶结构域编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有磷酸二酯酶结构域编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或用含有磷酸二酯酶结构域编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。这些系统的表达元件在其强度和特异性方面不同。
取决于所利用的宿主/载体系统，许多合适的转录元件和翻译元件中的任意元件，包括组成型启动子和诱导型启动子，都可以被用在表达载体中。例如，当在细菌系统中进行克隆时，可以应用诱导型启动子如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)和类似启动子；当在昆虫细胞系统中进行克隆时，可以应用启动子如杆状病毒多角体蛋白启动子；当在植物细胞系统中进行克隆时，可以应用来自植物细胞基因组的启动子(例如，热激启动子；RUBISCO小亚基的启动子；叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或来自植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV的包被蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中进行克隆时，可以应用来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；天花病毒7.5K启动子)；当产生含有多拷贝的磷酸二酯酶结构域DNA的细胞系时，可以应用带有合适的选择性标记的SV4O、BPV和EBV-型载体。
描述DNA操作方法、载体、应用的各种细胞类型、将载体整合入细胞的方法、表达技术、蛋白纯化和分离方法以及蛋白浓缩方法的示范性方法在PCT出版物WO 96/18738中详细公开。该出版物以整体并入本文作为参考，包括任何附图。本领域技术人员将理解，这样的描述可以用于本发明，并且可以容易地根据本发明进行调整。
晶体生长 通过多种技术，从含有纯化和浓缩多肽的水溶液生长晶体。这些技术包括分批法、液滴法、桥接、透析、蒸汽扩散法和悬滴法。McPherson(1982)John Wiley，New York；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.1891-23；Webber(1991)Adv.ProteinChem.411-36，上述被全部引入作为参考，包括所有图、表和附图。
一般而言，通过向多肽的浓缩溶液中加入沉淀剂来生长本发明的天然晶体。在恰好低于沉淀蛋白质必需的浓度下加入沉淀剂。通过受控制的蒸发去除水，产生沉淀条件，该沉淀条件被保持到晶体生长停止为止。
对于本发明的晶体，在实施例中描述了示例性结晶条件。本领域普通技术人员将意识到，该示例性结晶条件可以被改变。这样的改变可以被单独或组合使用。另外，可以发现其它结晶条件，例如通过使用结晶筛选板(crystallizationscreening plate)来鉴定这样的其它条件。如果需要提供较大的或较好质量的晶体，则可以最优化这些可选的条件。
通过将天然晶体浸在含有重金属原子的盐的母液中，可以获得本发明的衍生晶体。已经发现，将天然晶体浸在含有大约0.1mM至大约5mM硫柳汞、4-氯高汞苯甲酸或KAu(CN)2的溶液中大约2hr至大约72hr提供了适合用作测定X射线晶体结构的同晶置换的衍生晶体。
通过将天然晶体浸在含有结合该磷酸二酯酶的化合物的母液中可以获取本发明的共晶体，或者可以通过在结合化合物存在的情况下共结晶磷酸二酯酶多肽可以获取本发明的共晶体。
一般而言，使用经鉴定为在没有结合化合物的情况下结晶相应磷酸二酯酶的条件，可以完成磷酸二酯酶与结合化合物的共结晶。如果众多不同的结晶条件被鉴定用于磷酸二酯酶，这是有利的，并且可以试验这些条件，以确定哪个条件产生了最好的共晶体。最优化共结晶的条件也可以是有益的。可选地，可以确定新的结晶条件，用于获得共晶体，例如通过对结晶进行筛选，然后最优化这些条件。在实施例中提供了示例性的共结晶条件。
测定多肽或多肽复合物的晶胞大小和三维结构 一旦晶体生长，可以将其放置在玻璃毛细管中或其它固定设备(mountingdevice)中，并将其固定到与X射线发生器和X射线检测设备连接的夹具上。X射线衍射图形的收集被本领域技术人员充分记录。例如参见Ducruix and Geige，(1992)，IRL Press，Oxford，England，以及其中所引用的参考文献。X射线束进入晶体，然后从晶体衍射。X射线检测设备可以被用于记录从晶体发射的衍射图形。尽管在这些仪器的较老型号上的X射线检测设备是一片膜，而现代的仪器则数字记录了X射线衍射散射。X射线源可以是各种类型的，但有利地，使用高强度源，例如同步加速器束源。
用于获得多肽分子或分子复合物的晶形的三维结构的方法在本领域中是熟知的。例如参见Ducruix and Geige，(1992)，IRL Press，Oxford，England，以及其中所引用的参考文献。下面是在从X射线衍射数据测定分子或复合物的三维结构的过程中的步骤。
在从晶体收集X射线衍射图形之后，可以测定晶体中的晶胞大小和方向。根据衍射发射之间的间隔以及由这些发射而形成的图形可以测定它们。晶胞大小以埃(1＝10-10米)为单位在三维上表征，以及通过每一个顶点上的角度表征。在晶体中的晶胞的对称性也在该阶段被表征。通过鉴定重复图形，在晶体中的晶胞的对称性简化了所收集的数据的复杂性。晶胞对称性和维度的应用在下面予以描述。
每一个衍射图形发射被表征为向量(vector)，并且在本方法的该阶段所收集的数据测定了每个向量的振幅。使用多种技术可以测定向量的相位。在一种方法中，重金属原子可以被浸泡在晶体中，该方法被称为同晶置换，通过使用这些重原子作为X射线分析中的参考点，可以测定这些向量的相位。(Otwinowski，(1991)，Daresbury，United Kingdom，80-86)。同晶置换法通常利用不止一种重原子衍生物。
在另一种方法中，来自具有已测定结构的晶体多肽的向量的振幅和相位可以被应用于来自结构未知的晶体多肽的向量的振幅，并继而测定这些向量的相位。该第二种方法被称为分子置换，被用作参比的蛋白质结构必须具有与感兴趣的蛋白质密切相关的结构。(Naraza(1994)Proteins 11281-296)。因此，来自己知结构的磷酸二酯酶的向量信息，例如在本文中所报告的那些，对具有未知结构的另一种磷酸二酯酶的分子置换分析是有帮助的。
一旦测定了描述晶体的晶胞的向量的相位，向量振幅和相位、晶胞大小以及晶胞对称性可以被用作傅立叶转换函数中的术语。根据这些测量，傅立叶转换函数计算晶胞中的电子密度。描述晶胞中的分子之一或分子复合物之一的电子密度可以被称为电子密度图。然后，使用各种计算机程序，可以使序列的氨基酸结构或与该晶状多肽络合的化合物的分子结构被拟合到电子密度。所述过程的这一步骤有时被称为模建，并且可以通过使用计算机程序例如Turbo/FRODO或“O”来完成。(Jones(1985)Methods in Enzymology 115157-171)。
然后根据与试验测定的电子密度拟合的氨基酸结构，可以计算理论电子密度图。可以相互比较理论电子密度图与试验电子密度图，并且通过被称为R因子的参数可以描述这两种图之间的一致。低R因子值描述了理论与试验电子密度图之间的高度重叠。
然后，通过使用精修理论电子密度图的计算机程序最小化R因子。计算机程序例如X-PLOR可以被本领域技术人员用于进行模型精修。(Brünger(1992)Nature 355472-475.)。可以以迭代法实现精修。第一步需要更改在电子密度图中定义的原子的构象。通过模拟温度升高可以改变原子的构象，该温度升高将增加键的振动频率，并且修改原子在结构中的位置。在原子干扰过程中的具体点上，可以将力场应用于原子的系统，该力场一般用允许的键角与键长、范德华相互作用、氢键、离子相互作用和疏水相互作用定义了原子之间的相互作用。可以用自由能来描述有利的相互作用，并且在多次迭代中所述原子可以移动位置，直到获得自由能最小值。可以迭代该精修过程，直到R因子达到最小值。
通过以最小R值与理论电子密度拟合的原子来描述分子或分子复合物的三维结构。如本领域公知，然后可以建立该三维结构的文件，其通过三维的坐标定义了每个原子。
IV.PDE4B的结构 描述了晶状PDE4B磷酸二酯酶结构域和与示例性结合化合物共络合的PDE4B磷酸二酯酶结构域的高分辨率三维结构和原子结构坐标。在实施例中提供可用于获取该结构坐标的方法。在2004年5月6日提交的美国临时申请60/569435的表1中列出了晶状PDE4B磷酸二酯酶结构域的原子结构坐标，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。共晶体坐标可以以与蛋白质本身的坐标相同的方式被使用，例如用于本文所述的各个方面中，但是它们可能是有利的，因为这样的共晶体显示或证实了结合化合物的结合模式，并且也可以包括响应于存在的结合化合物而发生的蛋白质原子的移动。
本领域技术人员将意识到，通过X射线晶体分析法所测定的原子结构坐标不是没有误差的。因此，应当理解，一般而言，所获取的PDE的晶体的任何结构坐标组，不管是天然晶体、磷酸二酯酶结构域晶体、衍生晶体或共晶体，当使用骨架原子(N、Cα、C和O)，被叠加在目标结构上，具有小于或等于大约1.5的均方根偏差(“r.m.s.d.”)时，这些结构坐标组被认为是与目标结构相同的，此时至少大约50％至100％的结晶蛋白质骨架原子被包括在该重叠中。
V.晶体和原子结构坐标的用途 本发明的晶体特别是从那里所获取的原子结构坐标具有广泛的多种用途。例如，在此所述的晶体可以被用作本领域中已知的或后来发展的磷酸二酯酶的使用方法的任何一种中的起点。例如这样的使用方法包括鉴定与天然或突变的磷酸二酯酶催化结构域结合的分子。作为一种开发新型治疗剂的方法，晶体和结构坐标对鉴定调节磷酸二酯酶活性的配体特别有用。具体而言，晶体和结构信息在使用分子支架的配体开发的方法中是有用的。
在此所述的结构坐标可以被用作定相模型(phasing model)，用于测定另外的磷酸二酯酶的晶体结构，以及这样的磷酸二酯酶与配体例如抑制剂、激动剂、拮抗剂和其它分子的共晶体的结构。结构坐标以及从那里所获取的三维结构的模型也可以被用于帮助阐明天然或突变磷酸二酯酶的基于溶液的结构，例如那些通过NMR所获得的结构。
VI.磷酸二酯酶结构的电子表示 磷酸二酯酶或磷酸二酯酶部分(例如磷酸二酯酶活性部位)的结构信息可以以很多不同的方式来呈现。特别有用的是电子表示(electronic representation)，因为这样的表示允许快速及方便的数据操作和结构修改。电子表示可以被嵌入许多不同的存储(storage)或存储(memory)介质，经常是计算机可读式介质。例子包括而不限于计算机随机访问存储器(RAM)、软盘、磁盘、磁带(模拟的或数字的)、压缩盘(CD)、光盘、CD-ROM、存储卡、数字视盘(DVD)以及其它。存储介质可以是单独的或是计算机系统的一部分。这样的计算机系统可以是专用的、特殊目的或嵌入的系统，例如构成X射线晶体学系统的一部分的计算机系统，或者可以是通用计算机(其具有与其它设备例如X射线晶体学系统中的传感器件的数据连接)。在许多情况下，由此类电子表示提供的信息也可以被物理呈现，或者以两维或三维方式视觉地呈现在例如纸上，作为视觉展示(例如在计算机监视器上，作为两维或伪三维图像)，或者作为三维物理模型。也可以单独使用此类物理表示或结合电子表示使用此类物理表示。示例性的有用的表示包括但不限于下列原子坐标表示 一种类型的表示是呈现在分子结构、结构的部分或复合物(例如共晶体)中的具体原子的位置的原子坐标列表或表格。这样的表示也可以包括另外的信息，例如关于具体坐标的占用的信息。一种这样的原子坐标表示含有电子形式的2004年5月6日提交的美国临时申请60/569435中表1的坐标信息，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。
能量表面或相互作用的表面的表示 另一种表示是能量表面表示，例如活性部位或其它结合部位的能量表面表示，其表示电子或空间相互作用的能量表面。此类这样的表示也可以包括其它特征。一个例子是包括在具体氨基酸残基上的具体氨基酸残基或基团的表示，例如可以参与H键或离子相互作用的残基或基团的表示。使用众多可得的计算机程序的任何一种，从原子坐标表示可以容易地产生此类能量表面表示。
结构表示 另一种表示是结构表示，即，物理表示或这样的物理表示的电子表示。这样的结构表示包括分子或复合物的具体特征的相对位置的表示，经常是具有结构特征之间的连接。例如，结构可以被这样表示其中所有原子是连接的；非氢原子是连接的；主链原子是连接的，含有或不含有可以参与重要的电子相互作用的侧链原子的表示；以及其它。然而，并非所有的特征需要被连接。例如，对于分子或复合物的部分的结构表示，对该特征重要的结构特征可以被表示(例如，氨基酸残基的原子，其与结合部位上的配体可能具有重要的结合相互作用)。这些氨基酸残基可以不被彼此连接。
结构表示也可以是图示。例如，图示可以以图解方式表现二级结构和/或三级结构。具体的氨基酸残基或在残基上的基团可以被包括在多肽的这类图示中，例如在结合部位中的保守残基和/或可以与结合化合物相互作用的残基或基团可以被包括。例如，使用针对该功能而设计的计算机程序和/或通过基于对另一种形式的结构信息的理解用手动输入而构建电子表示，可以从原子坐标信息产生电子结构表示。可以产生物理表示，例如通过打印由计算机产生的图像的图，或者通过构建3D模型。
VII.使用结构坐标对具有未知结构的磷酸二酯酶的结构测定 使用结构坐标，例如在2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435中表1所列出的那些结构坐标，可以测定具有未知结构的磷酸二酯酶的三维结构，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。下面所述的方法可以将具有已知结构的多肽的结构坐标应用于另一个数据集，例如氨基酸序列、X射线晶体衍射数据或核磁共振(NMR)数据。本发明优选的实施方案涉及测定修饰的磷酸二酯酶、其它天然磷酸二酯酶或相关多肽的三维结构。
使用氨基酸同源性的结构 同源模拟法(homology modeling)是将已知结构的多肽的结构坐标应用于未知结构的多肽的氨基酸序列的方法。使用多肽或多肽复合物的三维结构的计算机表示、具有已知结构和未知结构的多肽的氨基酸序列的计算机表示以及氨基酸的结构的标准计算机表示完成该方法。同源模拟法一般包括(a)比对具有和没有已知结构的多肽的氨基酸序列；(b)将在已知结构中的保守氨基酸的坐标转移至未知结构的多肽的相应氨基酸；精修得到的三维结构；和(d)构建多肽的剩余部分的结构。本领域普通技术人员将意识到，可以从步骤(a)中的序列比对步骤确定两种蛋白质之间的保守氨基酸。
上述方法对本领域技术人员而言是熟知的。(Greer(1985)Science 2281055；Blundell et al.A(1988)Eur.J.Biochem.172513。可以被本领域技术人员使用进行同源模拟法的示例性计算机程序是由Accelerys Inc发布的Insight II建模包中的同源模块。
通过首先将具有已知结构的多肽的氨基酸序列的计算机表示放置在未知结构的多肽的氨基酸序列上，完成氨基酸序列的比对。然后比较序列中的氨基酸，并将同源的氨基酸组(例如，化学性质-脂族的、芳香的、极性的或带电的-类似的氨基酸)分在一起。该方法将检测多肽的保守区，并且考虑了氨基酸插入或缺失。使用序列比对和分析软件，也可以完全通过电子化实现这样的比对。
一旦比对了具有已知和未知结构的多肽的氨基酸序列，则将具有已知结构的多肽的计算机表示中的保守氨基酸的结构转移至其结构是未知的多肽的相应氨基酸。例如，在已知结构的氨基酸序列中的酪氨酸可以被苯丙氨酸取代，其为未知结构的氨基端序列中的相应的同源氨基酸。
通过使用标准肽几何学或分子模拟技术，例如分子动力学，位于非保守区中的氨基酸的结构将被人工操作分配。通过使用分子动力学和/或能量最小化精修完整的结构，完成该过程中的最后一步。同源模拟法是对于本领域技术人员而言是熟知的，并且已经使用不同的蛋白质分子被实践。例如，对应于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的催化结构域的多肽，肌球蛋白轻链蛋白激酶，的三维结构从cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基同源模拟而得。(Knighton et al.(1992)Science 258130-135.)使用分子置换的结构 分子置换是将已知结构的多肽的X射线衍射数据应用于未知序列的多肽的X射线衍射数据的方法。当仅有振幅已知时，可以利用该方法定义描述未知结构的多肽的X射线衍射数据的相位。X-PLOR是普遍被使用的用于进行分子置换的计算机软件包。Brünger(1992)Nature 355472-475。AMORE是用于分子置换的另一种程序。Navaza(1994)Acta Crystallogr.A50157-163。优选地，所形成的结构不表现出大于3的均方根偏差。
分子置换的目标是通过匹配来自两种晶体的电子衍射数据而比对在晶胞中的原子的位置。程序例如X-PLOR可以包括四个步骤。第一步可以是测定在晶胞中的分子的数目，并且定义它们之间的角度。第二步可以包括旋转衍射数据以定义晶胞中的分子的方向。第三步可以是翻译三维的电子密度，以正确地定位分子在晶胞中的位置。一旦确定了X射线衍射数据的振幅和相位，通过比较从参考数据组实验上计算而得的电子衍射图与从新数据组计算的电子衍射图，可以计算R因子。30-50％之间的R因子表示，在晶胞中的原子的方向通过该方法被合理地确定。在该方法中的第四步可以是通过使用在此所述的且为本领域普通技术人员已知的迭代精修技术(iterative refinement techniques)精修新电子密度图而将R因子减小至大约20％。
使用NMR数据的结构 由X射线晶体学技术得到的多肽或多肽复合物的结构坐标可以被用于阐明来自核磁共振(NMR)数据的多肽的三维结构。该方法被本领域技术人员使用。(Wuthrich，(1986)，John Wiley and Sons，New York176-199；Pflugrath et al.(1986)J.Mol.Biol.189383-386；Kline et(1986)J.Mol.Biol.189377-382)。尽管通过使用二维NMR数据，经常容易地确定多肽的二级结构，然而，各个部分的二级结构之间的空间连接并非是容易确定的。定义由X射线晶体学技术得到的多肽三维结构的坐标可以指导NMR光谱分析人员理解在相关结构的多肽中的二级结构元件之间的这些空间相互作用。
了解二级结构元件之间的空间相互作用可以极大地简化来自二维NMR试验的核欧沃豪斯效应(NOE)数据。另外，在通过NMR技术确定二级结构之后，应用晶体学坐标仅简化了与在多肽序列中的具体氨基酸有关的NOEs的指定，而不会严重地给多肽结构的NMR分析带来负面影响。相反，当确定多肽的二级结构时使用晶体学坐标来简化NOE数据将会使蛋白质结构的NMR分析产生偏差。
VIII.使用结构坐标对磷酸二酯酶功能的调节物的基于结构的设计 基于结构的调节物设计和鉴定方法是强有力的技术，其可以包括搜索计算机数据库，该数据库含有众多潜在的调节物和化学官能团。调节物的计算机化设计和鉴定是有用的，因为计算机数据库含有比化学文库多的化合物，经常有数量级的差别。关于基于结构的药物设计与鉴定的综述(参见Kuntz et al.(1994)，27117；Guida(1994)Current Opinion in Stuc.Biol.4777；Colman(1994)CurrentOpinion in Struc.Biol.4868)。
由结构坐标定义的多肽的三维结构可以为这些设计方法所用，例如，在2004年5月6日提交的美国临时申请号60/569435的表1中的结构坐标，所述申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。另外，通过在此所述的同源技术、分子置换技术和NMR技术所测定的磷酸二酯酶三维结构也可以被应用于调节物设计与鉴定方法。
为了鉴定调节物，可以使用天然磷酸二酯酶的结构信息，特别地，使用磷酸二酯酶的活性部位的结构信息。然而，利用来自磷酸二酯酶与一个或多个结合化合物的一个或多个共晶体的结构信息可能是有利的。如果结合化合物具有与试验化合物相同的结构核心也可能是有利的。
通过搜索分子数据库的设计 合理的设计的一种方法是通过对接(docking)分子数据库中的化合物的计算机表示来搜索调节物。公众可得的数据库包括，例如a)来自Molecular Designs Limited的ACDb)来自国家癌症中心(National Cancer Institute)的NCIc)来自剑桥晶体学数据中心(Cambridge Crystallographic Data Center)的CCDCd)来自Chemical Abstract Service的CASTe)来自Derwent Information Limited的Derwentf)来自Maybridge Chemical Company LTD的Maybridgeg)来自Aldrich Chemical Company的Aldrichh)来自Chapman & Hall的天然产物目录(Directory of Natural Products) 一种此类数据库(由Molecular Designs Limited Information Systems发布的ACD)含有合成而得的化合物或为天然产物的化合物。本领域技术人员可利用的方法可以将以二维表示的数据组转化为以三维表示的数据组。通过此类计算机程序如来自Tripos Associates的CONCORD或来自Molecular Simulations Limited的DE-Converter可以实现这些方法。
基于结构的调节物设计的多种方法是本领域技术人员已知的。(Kuntz et al.，(1982)J.Mol.Biol.162269；Kuntz et aZ.，(1994)，Acc.Chern.Res.27117；Meng et al.，(1992)，J.Compt.Chem.13505；Bohm，(1994)，J.Comp.Aided Molec.Design 8623。) 合理的调节物设计领域中的技术人员广泛使用的计算机程序是来自加利福尼亚大学旧金山分校的DOCK。在下面的三个申请中描述了被本计算机程序以及与它类似的程序所利用的一般方法。关于部分这些技术的更详细信息可以在Accelerys User Guide，1995中找到。用于该目的的典型的计算机程序可以执行包括下述步骤或功能的过程(a)从蛋白质去除存在的化合物；(b)使用计算机程序(例如DOCK)，或通过交互式地将化合物移动到活性部位中，将另一个化合物的结构对接(dock)到所述活性部位中；(c)表征化合物与活性部位原子之间的空间；(d)搜索文库，寻找分子片段，其(i)可以拟合到化合物与活性部位之间的空的空间内，和(ii)可以与化合物连接；和(e)将上面所发现的片段连接到所述化合物，并评价新的修饰化合物。
(c)部分指的是表征在所述活性部位的原子与所述化合物之间所形成的几何学和互补相互作用。当在化合物与活性部位原子之间共享显著的表面积，而不形成不利的空间相互作用时，可以获得有利的几何拟合。本领域技术人员将注意到，通过忽略(d)部分和(e)部分和筛选许多化合物的数据库可以执行本方法。
磷酸二酯酶功能的调节物的基于结构的设计和鉴定可以与分析筛选(assayscreening)结合使用。由于可以在数小时或者更少时间内搜索化合物的大型数据库(大约10,000个化合物)，所以基于计算机的方法可以缩小试验化合物在生化或细胞试验中作为潜在的磷酸二酯酶功能调节物的范围。
上面的基于结构的调节物设计的描述并非具有完全包含性，其它方法在文献中被报道并且可以使用，例如(1)CAVEATBartlett et al.，(1989)，in Chemical and Biological Problems inMolecular Recognition，Roberts，S.M.；Ley，S.V.；Campbell，M.M.eds.；RoyalSociety of ChemistryCambridge，pp.182-196。
(2)FLOGMiller et al.，(1994)，J.Comp.Aided Molec.Design 8153。
(3)PRO ModulatorClark et al.，(1995)，J.Comp.Aided Molec.Design 913。
(4)MCSSand Karplus，(1991)，ProteinsStructure，Function，and Genetics 1129。
(5)AUTODOCKGoodsell and Olson，(1990)，ProteinsStructure，Function，and Genetics 8195。
(6)GRIDGoodford，(1985)，J.Med.Chem.28849。
通过修饰与PDE4B络合的化合物的设计 鉴定化合物作为潜在调节剂的另一种方法是修饰在多肽活性部位上的现有调节剂。例如，调节剂的计算机表示可以在PDE4B的活性部位的计算机表示中被修饰。例如可以在Accelerys User Manual，1995 in LUDI中找到有关该技术的详细说明。一般通过删除一个或多个化学基团或者通过添加一个或多个化学基团来修饰调节剂的计算机表示。
在对化合物进行每一个修饰之后，修饰化合物和活性部位的原子可以在构象上被变化，并且可以对调节剂与活性部位原子之间的距离以及在两个分子之间形成的任何互补相互作用进行评分。当获得有利的几何配合和有利的互补相互作用时，评分可以完成。具有有利得分的化合物是潜在的调节剂。
通过修饰与PDE4B结合的化合物的结构的设计 基于结构的调节剂设计的第三个方法是筛选通过调节剂建立或调节剂搜索计算机程序而设计的化合物。在Molecular Simulations Package，Catalyst中可以找到这些类型的程序的例子。关于使用该程序的描述被记录在MolecularSimulations User Guide(1995)中。在该应用中使用的其它计算机程序是来自Molecular Designs Limited的ISIS/HOST、ISIS/BASE、ISIS/DRAW和来自TriposAssociates的UNITY。
可以在化合物的结构上运行这些程序，该化合物已经从化合物-磷酸二酯酶复合物的三维结构的活性部位中脱离。在这样的化合物上运行程序是优选的，因为该化合物处于生物学上活性的构象。
构建调节剂的计算机程序是这样的计算机程序，其可以被用于用计算机数据库的基团取代化学基团的计算机表示，所述化学基团是与磷酸二酯酶或其它生物分子络合的化合物中的化学基团。调节剂搜索的计算机程序是可以被用于搜索来自计算机数据库的化合物的计算机表示的计算机程序，所述化合物具有与结合于特定生物分子的化合物相似的三维结构和相似的化学基团。
通过使用下列一般步骤，典型的程序可以运行(a)通过化学特征，例如通过氢键供体或受体、疏水/亲脂部位、正可电离部位或负可电离部位，绘制化合物；(b)对所绘制的特征添加几何约束；和(c)用在(b)中产生的模型搜索数据。
本领域技术人员也将意识到，并非化合物的所有可能化学特征都必须出现在(b)的模型中。人们可以使用该模型的任何亚部分(subset)产生不同的模型用于数据库搜索。
使用分子支架的调节剂设计 本发明也可以有利地利用设计可以广泛作用于分子家族的化合物的方法，所述化合物被指定为分子支架，和/或使用分子支架设计配体的方法，所述配体以那些家族的单独或多个成员为靶标。使用分子支架的此类设计在Hirth和Milburn的美国专利申请10/377,268中得以描述，该申请在此被全部引入作为参考。使用分子支架的此类设计和开发被部分描述如下。
在优选的实施方案中，分子可以是蛋白质和可以被组装的一组化学化合物，其具有的性质使得它们1)化学上被设计为对一些蛋白质家族起作用和/或2)表现为更像分子支架，这意味着它们具有使它们特异性结合感兴趣家族中的一种或多种蛋白质的化学亚结构。可选地，可以设计优先对单独的靶分子起作用的分子支架。
分子支架的有用的化学性质可以包括一种或多种下列特征，但并不限于此平均分子量小于大约350道尔顿，或在大约150至大约350道尔顿之间，或从大约150至大约300道尔顿之间；具有小于3的clogP；可旋转键数目小于4；氢键供体和受体数目低于5或低于4；极性表面积小于502；以一个方向在蛋白质结合部位处进行结合，以使来自组合文库的附着于支架的化学取代基可以被伸入到蛋白质结合部位的口袋中；和在其可以被修饰的取代基附着点处具有化学上易处理的结构，因此能够进行快速的文库构建。
“clog P”是指化合物的计算出的log P，“P”是指辛醇与水之间的分配系数。
术语“分子极性表面积(Molecular Polar Surface Area(PSA))”指的是在分子中的极性原子(通常是氧、氮和附着的氢)的表面份额(surface contribution)的总和。极性表面积已经显示与药物转运性质例如肠吸收或血脑屏障穿透具有相当关联。
包括在组合文库中的不同化合物的另外的有用的化学性质包括将化学部分附着于该化合物的能力，这不会干扰所述化合物与至少一种感兴趣的蛋白质的结合，并且对文库成员提供期望的性质，例如，使文库成员被活性转运到细胞和/或感兴趣的器官，或附着于设备的能力，例如附着于层析柱(例如，通过分子例如生物素的链霉抗生物素柱)，用于诸如组织和蛋白质组学的谱图表征目的。
本领域普通技术人员将意识到，也可以以类似的方式搜寻和鉴定其它的性质，以及具有这些性质的化合物，所述性质可以是支架或文库成员期望拥有的，这取决于用途的特定要求。选择化合物进行试验的方法是本领域普通技术人员已知的，例如描述在美国专利6,288,234、6,090,912、5,840,485中的方法和化合物，所述每一个在此被全部引入作为参考，包括所有图表和附图。
在各种各样的实施方案中，本发明提供了设计与分子家族众多成员结合的配体的方法，其中所述配体含有共同的分子支架。因此，可以测定分析化合物组与分子家族例如蛋白质家族的众多成员的结合。与众多家族成员结合的一个或多个化合物可以被鉴定为分子支架。当在靶分子的结合部位上的支架的方向已经被确定，并且化学上易处理的结构已经被鉴定时，可以用一个或几个分子支架开始合成一组配体，以获得众多配体，其中，每一个配体与分子家族的单独的靶分子结合，其相对于所述支架具有更改或变化的结合亲和性或结合特异性。因此，基于相同的分子支架，众多的药物前导分子可以被设计为优先以分子家族的单独分子为靶标，并且以特异性的方式对它们起作用。
IX.结合分析 本发明的方法可以包括能够检测化合物与靶分子的结合的分析试验。此类结合处于统计学上显著的水平，优选具有至少90％的置信水平，更优选至少95％、97％、98％、99％或更大的置信水平，试验信号表示与靶分子的结合，即不同于背景。优选地，对照被用于区分目标结合与非特异性结合。本发明的测定也可以包括测定与靶分子低亲和性结合的化合物。很多指示结合的试验是已知的，可用于不同的靶类型，并且可以用于本发明。广泛作用于蛋白质家族的化合物不太可能具有针对单独目标的高亲和性，原因在于其广泛的结合本质。因此，在此所述的试验允许鉴定低亲和性、非常低的亲和性和极低亲和性下结合的化合物。因此，效价(potency)(或结合亲和性)不是鉴定潜在有用的结合化合物时的第一位的指标，或甚至不是最重要的指标。更确切的是，甚至那些在低亲和性、非常低的亲和性或极低亲和性情况下结合的化合物可以被认为是可以继续配体设计过程的下一阶段的分子支架。
在“低亲和性(low affinity)”下的结合意指在标准条件下与靶分子的结合具有1μM以上的解离常数(kd)。在“非常低亲和性(very low affinity)”下的结合意指在标准条件下具有大约100μM以上的kd的结合。在“极低亲和性(lowaffinity)”下的结合意指在标准条件下在大约1mM以上的kd下的结合。“中等亲和性(moderate affinity)”是指在标准条件下具有大约200nM至1μM的kd的结合。“适度高亲和性(moderately high affinity)”是指在大约1nM至大约200nM的kd下的结合。在“高亲和性(high affinity)”下的结合是指在标准条件下在低于大约1nM的kd下的结合。例如，低亲和性结合可以发生，是因为相对于发生较高亲和性结合的情况，与靶分子的结合部位的拟合较差，或者因为导致支架或配体与靶分子的结合部位发生结合的非共价键数量较少或共价键较弱。结合的标准条件是在pH7.2，在37℃下1小时。例如，100μl/孔可以被用于pH7.2的HEPES 50mM缓冲液、NaCl 15mM、ATP 2μM和牛血清白蛋白1ugl/孔中，37℃，1小时。
结合化合物也可以以它们对靶分子的活性的影响来表征。因此，“低活性(low activity)”化合物在标准条件下具有1μM以上的抑制浓度(IC50)或激发浓度(excitation concentration)(EC50)。“非常低的活性(very low activity)”是指在标准条件下100μM以上的IC50或EC50。“极低活性(extremely low activity)”是指在标准条件下1mM以上的IC50或EC50。“中等活性(moderate activity)”是指在标准条件下200nM至1μM的IC50或EC50。“适度高活性(moderately highactivity)”是指1nM至200nM的IC50或EC50。“高活性(high activity)”是指在标准条件下低于1nM的IC50或EC50。IC50(或EC50)被定义为化合物的浓度，在该浓度下，相对于无化合物存在时的活性，被测靶分子(例如酶或其它蛋白质)活性的50％的活性损失(或得到)。使用本领域普通技术人员已知的方法可以测量活性，例如通过测量由酶反应的发生而产生的任何可检测产物或信号，或者通过被测蛋白质的其它活性。
关于结合试验的“背景信号(background signal)”是指在不存在与靶分子结合的试验化合物、分子支架或配体的情况下，在标准条件下记录的具体测定的信号。本领域普通技术人员将意识到，存在已被接受的方法，并且它们对测定背景信号而言是广泛可得的。
“标准差(standard deviation)”是指方差的平方根。方差是分布如何被展开的量度。它被计算为每一个数与其平均值的平方差之平均值。例如，对于数1、2和3，平均数为2，方差为
σ2=(1-2)2+(2-2)2+(3-2)23=0.667.]]> 为了设计或发现对蛋白质家族广泛起作用的支架，可以针对化合物集合或化合物组分析感兴趣的蛋白质。分析试验可以优选是酶试验或结合试验。在一些实施方案中，可以期望的是，提高被筛选化合物的溶解度，然后分析在试验中显示活性的所有化合物，包括那些在低亲和性下结合或者产生具有比背景信号的标准差高约三倍的信号的化合物。分析试验可以是任何合适的试验，例如测量两个结合伴侣之间的结合亲和性的结合试验。可以对本发明的实践有帮助的各种类型的筛选试验在本领域中是已知的，例如那些在美国专利5,763,198、5,747,276、5,877,007、6,243,980、6,294,330和6,294,330中所述的测定，所述每一个在此被全部引入作为参考，包括所有图表和附图。
在分析试验的各种各样的实施方案中，至少一种化合物、至少大约5％、至少大约10％、至少大约15％、至少大约20％或至少大约25％的化合物可以在低亲和性下结合。一般而言，可达大约20％的化合物可以在筛选试验中显示活性，然后用高通量共晶体法(high-throughput co-crystallography)、计算分析法直接分析这些化合物，以将所述化合物归入具有共同结构性质(例如结构核心和/或形状和极性特征)的组中，并鉴定显示活性的化合物之间的共同化学结构。
本领域普通技术人员将意识到，决策可以基于适合具体情况需要的标准，并且决策可以通过计算机软件程序作出。可以建立含有几乎任何数目的支架的组，并且所选择的标准可以基于愈加严格的标准，直到对于每组达到被认为是有利的任意数目的支架。
表面等离子共振 使用表面等离子共振，例如用涂布有固定化结合组分的BIAcore芯片(Biacore，Japan)，可以测量结合参数。表面等离子共振被用于表征sFv或其它配体直接针对靶分子之间的反应的微观缔合常数和解离常数。在下面的文献中描述了此类方法，这些文献在此被引入作为参考。Vely et al.，(2000)BIAcoreanalysis totest phosphopeptide-SH2 domain interactions，Methods in Molecular Biology.121313-21；Liparoto et al.，(1999)Biosensor analysis of the interleukin-2 receptorcomplex，Journal of Molecular Recognition.12316-21；Lipschultz et al.，(2000)Experimental design for analysis of complex kinetics using surface plasmon resonance，Methods.20(3)310-8；Malmqvist(1999)BIACOREan affinity biosensor system forcharacterization of biomolecular interactions，Biochemical Society Transactions 27335-40；Alfthan，(1998)Surface plasmon resonance biosensors as a tool in antibodyengineering，Biosensor & Bioelectronics.13653-63；Fivash et al.，(1998)BIAcore forMacromolecule interaction，Current Opinion in Biotechnology.997-101；Price et al.；(1998)Summary report on the ISOBM TD-4 Workshopanalysis of 56monoclonalantibodies against the MUC1 mucin.Tumour Biology 19 Suppl 11-20；Malmqvist et al，(1997)Biomolecular interaction analysisaffinity biosensor technologies for functionalanalysis of proteins，Current Opinion in Chemical Biology.1378-83；O′Shannessy et al.，(1996)Interpretation of deviations from pseudo-first-order kinetic behavior in thecharacterization of ligand binding by biosensor technology，Analytical Biochemistry.236275-83；Malmborg et al.，(1995)BIAcore as a tool in antibody engineering，Journal of Immunological Methods，1837-13；Van Regenmortel，(1994)Use ofbiosensors to characterize recombinant proteins，Developments in BiologicalStandardization.83143-51；和O′Shannessy，(1994)Determination of kinetic rate andequilibrium binding constants for macromolecular interactionsa critique of the surfaceplasmon resonance literature，Current Opinions in Biotechnology.565-71。
BIAcore利用表面等离子共振(SPR)的光学性质检测结合于葡聚糖基质的蛋白质浓度的变化，所述葡聚糖基质平放在金/玻璃传感器芯片表面上，即为葡聚糖生物传感器基质。简言之，蛋白质以已知的浓度与葡聚糖基质共价结合，而蛋白质的配体被注入通过葡聚糖基质。定向于传感器芯片表面的相反面的近红外光被反射，并且还在金膜中诱导出消散波，该消散波又引起反射光在特定角度上的强度最低(intensity dip)，该角被称为共振角。如果传感器芯片表面的折射率被改变(例如通过与结合蛋白结合的配体)，则共振角发生改变。这个角的变化可以被测量，并以共振单位(RUs)表示，1000Rus相当于1ng/mm2的表面蛋白质浓度的变化。沿传感图的y轴，这些变化相对于时间而被显示，所述传感图描述了任何生物反应的缔合和解离。
高通量筛选(HTS)分析试验 HTS一般使用自动化分析来搜索大量化合物寻求期望的活性。一般地，通过筛选作用于特定酶或分子的化学品，HTS分析被用于发现新药。例如，如果化学品钝化酶，它可以证明对预防细胞中引起疾病的过程是有效的。使用机器人处理系统(robotic handling system)和自动化的结果分析，高通量方法使研究人员能够非常迅速地针对每一个靶分子测定数千种不同的化学品。
如此处所用，“高通量筛选(high throughput screening)”或“HTS”指的是大量化合物(文库)的快速的体外筛选；一般而言为数十至几十万化合物，其中使用机器人筛选分析。超高通量筛选(uHTS)一般指的是被加速为大于每天100,000次检测的高通量筛选。
为了实现高通量筛选，将样品放置在多容器载体或平台上是有利的。多容器载体有利于同时测定众多候选化合物的反应。多孔微孔板可以被用作载体。此类多孔微孔板以及它们在很多试验中的使用方法在本领域中都是熟知的，并且是商业可得的。
筛选试验可以包括对照，目的是对试验的组分的适当操作进行校准和确认。含有所有反应物而不含化学文库成员的空白孔通常被包括在内。作为另一个实施例，其调节物被寻求的酶的已知抑制剂(或激活剂)可以与试验的一个样品温育，并且在酶活性上产生的减少(或增加)被用作比较(comparator)或对照。应当意识到，调节物也可以与酶激活剂或抑制剂组合，以发现抑制酶活化或阻遏的调节物，所述酶活化或阻遏是另外由已知的酶调节物的存在而引起的。同样，当寻找针对鞘脂靶标的配体时，所述靶标的已知配体可以存在于对照/校准试验孔中。
在筛选试验中测量酶反应和结合反应 测量例如在多容器载体中的酶反应和结合反应进展的技术在本领域是已知的，并且包括但不限于下述。
分光光度法和分光荧光测定在本领域中是熟知的。此类测定的例子包括使用比色测定来检测过氧化物，如在Gordon，A.J.and Ford，R.A.，(1972)TheChemist′s CompanionA Handbook Of Practical Data，Techniques，And References，John Wiley and Sons，N.Y.，Page 437中所述。
荧光光谱法可以被用于监测反应产物的产生。荧光方法一般比吸收方法更敏感。荧光探针的使用对于本领域技术人员是已知的。有关综述，参见Bashford etal.，(1987)Spectrophotometry and SpectrofluorometryA Practical Approach，pp.91-114，IRL Press Ltd.；和Bell，(1981)Spectroscopy In Biochemistry，Vol.pp.155-194，CRC Press。
在分光荧光法中，酶被暴露于当被靶酶加工时会改变它们的固有荧光的底物。一般地，底物是非荧光的，并且通过一个或多个反应被转化为荧光团。作为一个非限定的例子，使用AmplexRed试剂(Molecular Probes，Eugene，OR)可以检测SMase活性。为了使用AmplexRed测量鞘磷脂酶活性，下面的反应发生了。首先，SMase水解鞘磷脂，产生神经酰胺和磷酸胆碱。第二，碱性磷酸酶水解磷酸胆碱产生胆碱。第三，胆碱被胆碱氧化酶氧化为甜菜碱。最后，在辣根过氧物酶存在下，H2O2与AmplexRed反应生成荧光产物，Resorufin，使用分光荧光法检测其中的信号。
荧光偏振(FP)基于荧光团的分子旋转速度的降低，这发生在与较大分子例如受体蛋白结合之后，这使得通过结合配体发生偏振荧光发射。在用平面偏振光激发之后，通过测量荧光团发射的垂直和水平分量，FP被经验性地确定。当荧光团的分子旋转减少时，偏振发射增加。当荧光团与较大分子(即受体)结合时，减缓了荧光团的分子旋转，荧光团产生较大的偏振信号。偏振信号的量级与荧光配体结合的程度在数量上相关。因此，“结合”信号的偏振取决于高亲和性结合的保持。
FP是均相技术，且反应非常迅速，达到平衡需数秒至数分钟。试剂是稳定的，可以制备大批量，这导致高的可重复性。因为这些性质，FP已经证明是高度可自动化的，经常用与单一试剂、预混合的试剂、示踪物-受体试剂的单温育进行。有关综述，参见Owickiet et al.，(1997)，Application of Fluorescence PolarizationAssays in High-Throughput Screening，Genetic Engineering News，1727。
FP是特别有利的，因为其读数不依赖发射强度(Checovich，W.J.，et al.，(1995)Nature 375254-256；Dandliker，W.B.，et al.，(1981)Methods in Enzymology 743-28)，因此对淬灭荧光发射的有色化合物的存在不敏感。FP和FRET(参见下文)非常适合鉴定阻断鞘脂受体与它们的配体之间相互作用的化合物。例如，参见Parker et al.，(2000)Development of high throughput screening assays usingfluorescence polarizationnuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphataseassays，J Biomol Screen 577-88。
可以被用于FP分析中的来自鞘脂的荧光团是商业可得的。例如MolecularProbes(Eugene，OR)目前出售鞘磷脂和一种神经酰胺荧光团。这些分别是N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-戊酰基)鞘氨基(sphingosyl)磷酸胆碱(BODIPYFL C5-鞘磷脂)；N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-十二酰基)鞘氨基磷酸胆碱(BODIPYFL C12-鞘磷脂)；和N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-戊酰基)鞘氨醇(BODIPYFL C5-神经酰胺)。美国专利4,150,949(庆大霉素的免疫测定(Immunoassay for gentamicin))公开了荧光素标记的庆大霉素，包括荧光素硫代氨基甲酰庆大霉素。使用本领域技术人员熟知的方法，可以制备另外的荧光基团。
示例性的正交偏振荧光读数器包括POLARION荧光偏振系统(Tecan AG，Hombrechtikon，瑞士)。用于其它分析的普通多孔板读数器是可得的，例如VERSAMAX读数器和SPECTRAMAX多孔板分光光度计(均来自MolecularDevices)。
荧光共振能量转移(FRET)是用于检测相互作用的另一种有用的测定，并且已经被描述。例如参见Heim et al.，(1996)Curr.Biol.6178-182；Mitra et al.，(1996)Gene 17313-17；和Selvin et al.，(1995)Meth.Enzymol.246300-345。FRET检测紧密靠近的两种荧光物质之间的能量转移，其具有已知的激发波长和发射波长。举例来说，蛋白质可以被表达为与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白。当两种荧光蛋白靠近时，例如当蛋白质与靶分子特异性相互作用时，共振能量可以从一个受激发的分子转移到另一个分子。结果，样品的发射光谱移动了，这可以通过荧光计来测量，例如fMAX多孔荧光计(Molecular Devices，Sunnyvale Calif.)。
闪烁亲近测定法(SPA)是用于检测与靶分子的相互作用的特别有用的分析方法。SPA被广泛用于制药行业，并且已经被描述(Hanselman et al.，(1997)J.LipidRes.382365-2373；Kahl et al.，(1996)in proximity 243282-283；Undenfriend et al.，(1987)Anal.Biochem.161494-500)。也可参见美国专利4,626,513和4,568,649和欧洲专利0,154,734。一种商业可得的系统使用了闪烁体包被板(scintillant-coatedplates)(NEN Life Science Products，Boston，MA)。
通过多种熟知的方法，靶分子可以与闪烁剂板结合。被衍生化处理以结合融合蛋白例如GST、His6或Flag融合蛋白的闪烁剂板是可得的。当靶分子为蛋白质复合物或多聚体时，一种蛋白质或亚基首先可以被附着到板上，然后在结合条件下，复合物的其它组分被加入，导致结合复合物。
在一个典型的SPA测定中，将表达库中的基因产物进行放射性标记，然后加入孔中，并使其与固相相互作用，所述固相为固定的靶分子和在孔中的闪烁体涂层。该试验可以立刻被测量，或允许达到平衡。任何方式下，当放射性标记与闪烁体涂层充分接近时，其产生了由例如TOPCOUNT NXT微板闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden Conn.)的装置可检测的信号。如果放射性标记的表达产物与靶分子结合，则放射性标记保持与闪烁体接近足够长时间，这足以产生可检测的信号。
相反，不与靶分子结合或者仅仅短暂结合的标记蛋白质不会保持在闪烁体的附近足以产生高于本底的信号的长时间。由随机的布朗运动引起的在闪烁体附近所耗用的任何时间也不会导致显著量的信号。同样，在表达步骤过程中所使用的残留的未掺入的放射性标记可能存在，但不会产生明显的信号，因为它处于溶液中，而不是与靶分子相互作用。因此，这些非结合性相互作用会引起某一水平的本底信号，所述本底信号在数学上可以被去除。如果得到太多的信号，可以直接向测定板中加入盐或其它改性剂，直到获得期望的特异性(Nichols et al.，(1998)Anal.Biochem.257112-119)。
测定用化合物和分子支架 支架的优选特征包括具有低分子量(例如350Da以下，或从大约100至大约350道尔顿，或从大约150至大约300道尔顿)。优选地，支架的clogP为-1至8，更优选为6、5或4以下，最优选为3以下。在具体的实施方案中，clogP在-1至上限为2、3、4、5、6或8的范围内；或在0至上限为2、3、4、5、6或8的范围内。优选地，可旋转键的数目为5以下，更优选为4以下。优选地，氢键供体和受体的数目低于6，更优选低于5。可以有用的另外的标准是5以下的极性表面积。在Lipinski et al.，(1997)Advanced Drug Delivery Reviews 233-25中可以找到对鉴定具体应用的标准有帮助的手册，其在此被全部引入作为参考。
支架可以优选与构型中的特定的蛋白结合部位结合，该构型使得支架的取代基部分位于该蛋白结合部位的口袋中。同样，具有化学上易处理的基团可以是支架的一个优选的特征，所述化学上易处理的基团可以被化学修饰，特别是通过合成反应，从而可以容易地建立组合文库。同样，在支架上具有其它的部分可以被附着其上的位置可以是优选的，这不干扰支架与感兴趣蛋白质(一种或多种)的结合，却使得所述支架获得期望的性质，例如支架到细胞和/或器官的活性转运，使支架能够附着于层析柱以方便分析，或另外的期望性质。分子支架可以与靶分子在任何亲和性下结合，例如在高亲和性、中等亲和性、低亲和性、非常低亲和性或极低亲和性下的结合。
因此，上述标准可以被用于选择具有期望特征的许多化合物进行试验。许多具有所述标准的化合物在商业市场是可得的，并且可以被选择用于测定法中，这取决于所述方法所适用的特定需求。
“化合物文库(compound library)”或“文库(library)”为具有不同化学结构的不同化合物的集合。化合物文库是可筛选的，即，其中的化合物文库成员可以经受筛选分析。在优选的实施方案中，文库成员可以具有从大约100至大约350道尔顿的分子量，或者从大约150至大约350道尔顿的分子量。上文提供了文库的例子。
本发明的文库可以含有至少一种在低亲和性下与靶分子结合的化合物。通过很多不同的分析法可以分析候选化合物的文库，例如上文所描述的那些分析测定，例如荧光偏振测定。文库可以由化学合成肽、肽模拟物(peptidomimetics)或者大的或小的、聚集的(focused)或非聚集(nonfocused)的组合化学品的阵列组成。“聚集的”，其意为化合物的集合是利用以前表征的化合物和/或药效团而制备的。
化合物文库可以含有从天然来源分离的分子、人工合成的分子或以使其可以具有一个或多个可变部分的方式合成、分离或另外制备的分子，例如所述部位是独立地分离的或随机合成的。在化合物文库中的分子的类型包括但不限于有机化合物、如那些在本文被使用的术语的多肽和核酸以及它们的衍生物、偶联物和混合物。
本发明的化合物文库可以在商业市场上购买、制备或通过任何方法获得，所述方法包括但不限于组合化学技术、发酵方法、植物与细胞提取程序以及类似方法(例如参见Cwirla et al.，(1990)Biochemistry，87，6378-6382；Houghten et al.，(1991)Nature，354，84-86；Lam et al.，(1991)Nature，354，82-84；Brenner et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，5381-5383；R.A.Houghten，(1993)Trends Genet.，9，235-239；E.R.Felder，(1994)Chimia，48，512-541；Gallop et al.，(1994)J.Med.Chem.37，1233-1251；Gordon et al.，(1994)J.Med.Chem.，37，1385-1401；Carell etal.，(1995)Chem.Biol.，3，171-183；Madden et al.，Perspectives in Drug Discovery andDesign 2，269-282；Lebl et al.，(1995)Biopolymers，37 177-198)；装配在共用分子结构周围的小分子；通过各种商业基团和非商业基团、天然产物而被组合的化学品的集合；海洋生物体、真菌、细菌和植物的提取物。
可以在均质反应混合物中制备优选的文库，并且在筛选之前，不需要将未反应的试剂与文库的成员分离。尽管许多组合化学方法基于固相化学，然而液相组合化学能够产生文库(Sun CM.，(1999)Recent advances in liquid-phasecombinatorial chemistry，Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening.2299-318)。
多种类型的分子的文库被制备，目的是从那里获取具有一个或多个预选特性的成员，其可以通过多种技术来制备，包括但不限于平行阵列合成(Houghton，(2000)Annu Rev Pharmacol Toxicol 40273-82，Parallel array and mixture-basedsynthetic combinatorial chemistry；solution-phase combinatorial chemistry(1998)Comb Chem High Throughput Screen 1(2)57-72，Solution phase combinatorialchemistry，Coe et al.，(1998-99)Mol Divers；4(1)31-8，Solution-phase combinatorialchemistry，Sun，(1999)Comb Chem High Throughput Screen 2(6)299-318，Recentadvances in liquid-phase combinatorial chemistry)；在可溶性聚合物上的合成(Gravertet(1997)Curr Opin Chem Biol 1(1)107-13，Synthesis on soluble polymersnewreactions and the construction of small molecules)；以及类似技术。例如参见Dolle etal.，(1999)J Comb Chem 1(4)235-82，Comprehensive survey of combinatorial librarysynthesis1998；Freidinger RM.，(1999)Nonpeptidic ligands for peptide and proteinreceptors，Current Opinion in Chemical Biology；和Kundu et al.，Prog Drug Res；5389-156，Combinatorial chemistrypolymer supported synthesis of peptide andnon-peptide libraries)。化合物可以被临床标记，以便于鉴定(Chabala，(1995)CurrOpin Biotechnol 6(6)633-9，Solid-phase combinatorial chemistry and novel taggingmethods for identifying leads)。
含有寡糖的碳水化合物和文库的组合合成已经得以描述(Schweizer et al.，(1999)Curr Opin Chem Biol 3(3)8，Combinatorial synthesis of carbohydrates)。天然产物型化合物文库的合成已经得以描述(Wessjohann，(2000)Curr Opin Chem Biol 4(3)303-9，Synthesis of natural-product based compound libraries)。
通过各种技术制备核酸的文库，作为非限定性例子，包括在此所述的技术，用于适配子(aptamers)的分离。在链霉抗生物素磁珠上展示的包括寡核苷酸和聚氨基寡核苷酸(polyaminooligonucleotides)的文库(Markiewicz et al.，(2000)Syntheticoligonucleotide combinatorial libraries and their applications，Farmaco.55174-7)是已知的。可以与平行取样偶联并且不需要复杂步骤而可去卷积的核酸文库是已知的，所述复杂步骤例如自动化质谱法(Enjalbal C.Martinez J.JL，(2000)Massspectrometry in combinatorial chemistry，Mass 19139-61)和平行标记。(Perrin DM.，Nucleic acids for recognition and catalysislandmarks，limitations，and looking to thefuture，Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 3243-69)。
使用组合化学和固相合成鉴定肽模拟物(Peptidomimetics)(Kim HO.KahnM.，(2000)A merger of rational drug design and combinatorial chemistrydevelopmentand application of peptide secondary structure mimetics，Combinatorial Chemistry &High Throughput Screening 3167-83；al-Obeidi，(1998)Mol Biotechnol 9(3)205-23，Peptide and peptidomimetric libraries.Molecular diversity and drug design)。所述合成可以是完全随机的，或者部分基于已知的多肽。
多肽文库可以根据各种技术来制备。简言之，噬菌体展示技术可以被用于产生多肽配体(Gram H.，(1999)Phage display in proteolysis and signal transduction，Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening.219-28)，其可以被用作肽模拟物的合成的基础。多肽、约束肽、蛋白质、蛋白质结构域、抗体、单链抗体片段、抗体片段以及抗体结合区被展示在丝状噬菌体上用于选择。
已经产生了人单链Fv抗体的各个变体的大文库。例如参见Siegel RW.AllenB.Pavlik P.Marks JD.Bradbury(2000)Mass spectral analysis of a protein complexusing single-chain antibodies selected on a peptide targetapplications to functionalgenomics，Journal of Molecular Biology 302285-93；Poul MA.Becerril B.UB.Morisson P.Marks JD.，(2000)Selection of tumor-specific internalizing humanantibodies from phage libraries.Source Journal of Molecular Biology.3011149-61；Amersdorfer P.Marks JD.，(2001)Phage libraries for generation of anti-botulinumantibodies，Methods in Molecular Biology.145219-40；Hughes-Jones NC.Bye JM.Gorick BD.Marks JD.Ouwehand WH.，(1999) Synthesis of Rh Fv phage-antibodiesusing VH and VL genes，British Journal of Haematology.105811-6；McCall AMAmoroso AR.Sautes C.Marks JD.Weiner LM.，(1998)Characterization of anti-mouseFc gamma RII single-chain Fv fragments derived from human phage display libraries，Immunotechnology.471-87；Sheets MD.Amersdorfer P.Finnern R.Sargent P.Lindquist E.Schier R.G.Wong C.Gerhart JC.Marks JD.Lindquist E.，(1998)Efficient construction of a large nonimmune phage antibody librarythe production ofhigh-affinity human single-chain antibodies to protein antigens(在Proc Natl Acad SciUSA 1999 96795中公开的勘误表)，Proc Natl Acad Sci USA 956157-62)。
在涉及计算化学的成熟策略(例如Kundu B.Khare SK.Rastogi SK.，(1999)Combinatorial chemistrypolymer supported synthesis of peptide and non-peptidelibraries，Progress in Drug Research 5389-156)的帮助下，应用基于结构的配体，使用数据库搜索和对接(docking)，从头的药物设计和配体结合亲和力的评估，(Joseph-McCarthy D.，(1999)Computational approaches to structure-based liganddesign，Pharmacology & Therapeutics 84179-91；Kirkpatrick DL.Watson S.Ulhaq S.，(1999)Structure-based drug designcombinatorial chemistry and molecular modeling，2211-21；Eliseev AV.Lehn JM.，(1999)Dynamic combinatorial chemistryevolutionaryformation and screening of molecular libraries，Current Topics in Microbiology &Immunology 243159-72；Bolger et al.，(1991)Methods Enz.20321-45；Martin，(1991)Methods Enz.203587-613；Neidle et al.，(1991)Methods Enz.203433-458；美国专利6,178,384)，可以设计聚集的(focused)或灵敏的化学品和药效团文库。
X.晶体学 在结合化合物已经被确定之后，测定与靶结合的化合物的方向。优选地，该测定涉及分子支架化合物与靶的共晶体上的晶体学。大多数蛋白质晶体学平台可以优选被设计为分析可达大约500个与蛋白质靶结合的化合物、配体或分子支架的共复合物，原因在于仪器的物理参数和操作的便利。如果具有结合活性的支架的数目超过了便于应用晶体学方法的数目，则该支架可以被置于基于具有至少一个共同化学结构或其它期望特征的组中，并且可以从一个或多个类中选择代表性的化合物。可以在愈加严格的标准下建立类，直到获得期望数量的类(例如500)。所述类可以基于在所述类中的分子支架之间的化学结构相似性，例如，所有都具有吡咯环、苯环或其它化学特征。同样，类别可以基于形状特征，例如空间填充(space-filling)特征。
在筛选试验中显示出活性的支架浓度下，通过共络合每个支架和其靶标，可以进行共晶体学分析。该共络合可以在使用含有靶分子的低百分数有机溶剂，然后浓缩所述靶与每一个支架来完成。在优选的实施方案中，这些溶剂为于水或另一种水性溶剂中的5％以下的有机溶剂例如二甲亚砜(DMSO)、乙醇、甲醇或乙二醇。然后可以在4度和20度，在合适数量的结晶筛选条件下，筛选与靶分子络合的每一个支架。在优选的实施方案中，可以执行大约96个结晶筛选条件，目的是获取关于共络合和结晶条件以及在靶分子的结合部位处的支架的方向的充分信息。然后可以分析晶体结构，以确定结合的支架是如何在结合部位内或在分子家族成员的一个或多个结合口袋(bindingpocket)内物理定向。
确定与靶蛋白结合的化合物的原子坐标是期望的，目的是确定哪个是蛋白质家族最合适的支架。X射线晶体分析因此对测定原子坐标是最优选的。应用药物化学可以进一步试验所选择的化合物。基于化合物在靶分子中的结合位置可以选择用于药物化学试验的化合物。例如，当所述化合物在结合部位结合时，在靶分子的结合部位中的所述化合物的结合位置可以被考虑，被考虑的方面涉及在所述化合物的化学上易处理结构或亚结构上进行的化学术，以及所述化合物上的这类修饰可以如何与靶的结合部位上的结构或亚结构相互作用。因此，人们可以探究靶的结合部位和支架的化学性质，以决定如何修饰该支架以获得具有更高效价和/或更高选择性的配体。该方法通过利用从共复合物直接获取的结构和化学信息，使得可以更直接地设计配体，从而能够使人们更有效地和快速地设计可能导致有益的药物产品的前导化合物。在各种各样的实施方案中，可以期望的是，对结合的所有支架进行共晶体分析法，或仅对那些在特定亲和性下结合例如仅对那些在高亲和性、中等亲和性、低亲和性、非常低的亲和性或极低亲和性下结合的支架进行共晶体分析法。对在亲和性的任何组合下结合的支架的选择进行共晶体分析也可以是有利的。
可以在共晶体上进行标准X射线蛋白质衍射研究，例如通过使用具有X射线成像板检测器或同步加速器光束线(synchrotron beam-line)的RigakuRU-200(日本，东京，Rigaku)，并且可以在标准X射线检测器例如CCD检测器或X射线成像板检测器上测量衍射数据。
在大约200个共晶体上进行X射线晶体分析法一般应当导致大约50个共晶体结构，其应当提供大约10个支架，用于化学上确认，其最终应当导致针对靶分子的大约5个选择性前导物(lead)。
虚拟测定(Virtual Assays) 商业可得的软件可以被用于图解和研究当与靶结合时化合物是如何定向的，所述软件可以从所提供的一组坐标产生络合的靶与化合物的三维图形表示。(例如QUANTAAccelerys，San Diego，CA)。因此，在本发明中，在所述靶的结合部位处的结合口袋的存在是特别有用的。这些结合口袋通过晶体学结构测定而被展现，并且显示了在化合物与靶的结合部位的结合中所涉及的精确的化学相互作用。本领域普通技术人员将意识到，通过考虑未占据空间在复合物中位于何处，以及哪些化学亚结构可能具有合适的大小和/或电荷特征来填充该未占据空间，所述图解也可以被用于决定在哪里可以将化学基团加入、取代或从支架删除，以增强结合效应或另外的期望效应。本领域普通技术人员也将意识到，在结合部位中的区域可以是柔性的，并且其性质可以因支架结合而改变，并且化学基团可以特异性地靶向于那些区域以达到期望的效应。在分子支架上的特定位点可以被考虑，其涉及合适的化学亚结构在何处以何种构象被附着，以及哪个位点具有可利用的最有利的化学性质。
对结合化合物与靶蛋白的作用力的理解揭示了哪些化合物可以最有利地被用作支架，以及在配体的设计中哪些性质可以被最有效地操作。本领域普通技术人员将意识到，空间作用力、离子作用力、氢键作用力和其它作用力可以被认为是有助于靶-化合物复合物的保持或增强。用自动化计算方法，例如对接(docking)和/或自由能微扰法(Free Energy Perturbation)(FEP)，可以获取另外的数据，以解释其它能量效应，例如去溶剂化障碍(desolvation penalties)。所选择的这些化合物可以被用于产生关于与靶的化学相互作用的信息，或者用于阐明可以提高化合物结合的选择性的化学修饰。
使用来自共晶体结构的数据可以构建计算机模型，例如同源模型(即，基于已知的、试验衍生出的结构)。当靶分子是蛋白质或酶时，用于制作同源模型的优选的共晶体结构在被建模的蛋白质序列的结合部位中含有高的序列同一性，并且所述蛋白质将优先在相同类和/或折叠家族(fold family)内。对蛋白质类的活性部位中的保守残基的了解可以被用于选择精确地表示结合部位的同源模型。同源模型也可以被用于绘制来自替代物蛋白质的结构信息，其中脱辅基(apo)或共晶体结构存在于该靶蛋白。
虚拟筛选方法，例如对接，也可以被用于在同源模型中预测支架、化合物和/或组合文库成员的结合构型和亲和性。使用该数据，并且使用计算机软件执行“虚拟试验”可以节省大量的资源，并且允许本领域普通技术人员决定哪些化合物可能是合适的支架或配体，而不必真正地合成配体和进行共结晶。因此可以决定哪些化合物值得真正合成和共结晶。对此类化学相互作用的理解有助于发现和设计药物，所述药物更有利地与靶蛋白相互作用和/或对一个蛋白质家族成员较其它更具有选择性。因此，应用这些原则，可以发现具有优良性质的化合物。
促进共结晶的添加剂当然可以被包括在靶分子制剂中，目的是增强共晶体的形成。在蛋白质或酶的情况下，待试验的支架可以被加入蛋白质制剂中，其优选以大约1mg/ml的浓度存在。所述制剂也可以含有在0％-10％(v/v)之间的有机溶剂，例如DMSO、甲醇、乙醇、丙二醇或1，3-二甲基丙二醇(MPD)或这些有机溶剂的一些组合。化合物优选在大约10mM的浓度下溶解在有机溶剂中，并在大约100mM的浓度下被加入到蛋白质样品中。然后将蛋白质-化合物复合物浓缩为大约5mg/ml至大约20mg/ml的蛋白质的终浓度。使用96孔格式编排的浓缩设备(例如Amicon Piscataway，NJ)，可以方便地进行络合与浓缩步骤。存在于被结晶的制剂中的缓冲液和其它试剂可以含有促进结晶或与结晶条件相容的其它成分，例如DTT、丙二醇、甘油。
通过将小等份试样的浓缩蛋白质-化合物复合物(1μl)放置在96孔格式中，并在96个结晶条件下取样，可以建立结晶试验。(可以使用其它筛选格式，例如具有多于96孔的板)。使用标准结晶步骤，其可以包括96孔结晶板被置于不同的温度下，一般可以获得晶体。如果需要的话，对于每一个蛋白质-化合物复合物，也可以考虑除了温度之外的共结晶变化因素。例如大气压、光或氧气的存在或缺乏、重力上的变化以及许多其它变量都可以进行试验。本领域普通技术人员将意识到，其它变量可以有利地被改变和考虑。
配体设计与制备 通过考虑一组活性支架之间共有的化学结构，在有或没有结构和/或共结晶数据的情况下，可以进行配体的设计和制备。在该方法中，可以形成结构-活性假设，并且被发现存在于大量支架中的那些化学结构，包括那些在低亲和性下结合的化学结构，可以被假定对支架的结合有一些影响。当这种结合发生在生物体系(例如治疗的哺乳动物)中时，其可以被假定诱导期望的生化效应。可以试验衍生自支架的新或修饰的支架或组合文库，以反驳最大数量的结合和/或结构-活性假设。然后，保留的假设可以被用于设计实现期望的结合和生化效应的配体。
但是在许多情况下，具有共晶体学数据以便考虑如何修饰支架以实现期望的结合效应(例如，在较高亲和性下或具有较高选择性的结合)是优选的。使用蛋白质和酶的情况，共晶体学数据显示了分子支架结合于结合部位的蛋白质的结合口袋，并且对支架上的化学易处理基团可以进行修饰是显而易见的。例如，在蛋白质结合部位或口袋处的小空间体积可以被填充，其通过修饰支架以包括填充所述体积的小的化学基团。填充空隙体积可以有望导致更大的结合亲和性，或与蛋白质家族的其它成员的不期望的结合的丧失。同样，共晶体学数据可以显示删除支架上的化学基团可能减少结合的阻碍，且导致更大的结合亲和性或特异性。
利用位于蛋白质的结合部位或口袋处的带电化学基团的存在可以是期望的。例如，带正电的基团可以用在分子支架上引入的带负电的基团互补。这可以有望增加结合亲和性或结合特异性，从而导致更期望的配体。在许多情况下，已知的是，蛋白质结合部位区或口袋区从一个家族成员到另一个家族成员是变化的，该变化基于在这些区中的氨基酸差异。在这些区中的化学加合(chemical addition)可以导致某些相互作用(例如疏水、静电或熵)的建立或消除，这使得化合物对一个蛋白质靶标较另一个更具有特异性，或者在更大的亲和性下结合，因此使人们能够合成对特定的家族成员具有较大选择性或亲和性的化合物。另外，一些区可以含有已知比其它氨基酸更柔性的氨基酸。这经常发生在包含在蛋白质的二级结构例如α螺旋或β片的环连接元件的氨基酸中。化学部分的加合也可以定向于这些柔性区，目的是增加发生在感兴趣的蛋白质靶和化合物之间的特定相互作用的可能性。也可以在计算机上进行虚拟筛选方法，以评价在化合物上的化学加合、删减、修饰和/或取代对蛋白质家族或类别成员的影响。
可以用任何合适的化学部分进行针对支架的化学结构或亚结构的加合、减去或修饰。例如可以使用下列的部分，其作为例子提供，并非意欲限定氢、烷基、烷氧基、苯氧基、链烯基、炔基、苯基烷基、羟烷基、卤烷基、芳基、芳基烷基、烷氧基、烷硫基、链烯基硫代、苯基、苯基烷基、苯基烷硫基、羟烷基硫代、烷硫基氨基甲酰硫代、环己基、吡啶基、哌啶基、烷基氨基、氨基、硝基、巯基、氰基、羟基、卤原子、卤甲基、氧原子(例如形成酮或N-氧化物)或硫原子(例如形成硫醇、硫酮、二烷基亚砜或砜)都是可以使用的部分的例子。
可以使用的结构或亚结构的另外的例子是芳基，其可选地用一个、两个或三个取代基取代，所述取代基独立地选自烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸盐(酯)、甲酰胺、硝基和酯部分；式-NX2X3的胺，其中X2和X3独立选自氢、饱和或不饱和烷基，和同素环或杂环部分；卤素或三卤甲基；式-COX4的酮，其中X4选自烷基和同素环或杂环部分；式-(X5)nCOOH的羧酸或式-(X6)NCOOX7的酯，其中X5、X6和X7独立选自烷基和同素环或杂环部分，其中n是0或1；式(X8)nOH的醇或式-(X8)nOX9的烷氧基部分，其中X8和X9独立选自饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分，其中所述环任选地用一个或多个独立选自烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸盐(酯)、硝基和酯的取代基取代，其中n是0或1；式NHCOX10的酰胺，其中X10选自烷基、羟基和同素环或杂环部分，其中所述环任选地用一个或多个独立选自烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸盐(酯)、硝基和酯的取代基取代；SO2、NX11X12，其中X11和X12选自氢、烷基和同素环或杂环部分；同素环或杂环部分，其任选地用一个、两个或三个独立选自烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸盐(酯)、甲酰胺、硝基和酯部分的取代基取代；式-CHO的醛；式SO2X13的砜，其中X13选自饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分；和式-NO2的硝基。
在分子支架和配体上的附着位点的鉴定 除了鉴定和开发磷酸二酯酶和其它酶的配体之外，对在结合部位处的分子支架或其它结合化合物的方向的测定使得可以鉴定能量上允许的部位，该部位可用于所述结合分子与另一个成分的附着。对于此类部位，与附着成分的存在有关的任何自由能变化不会使化合物与磷酸二酯酶的结合不稳定到破坏此结合的程度。优选地，具有该附着的结合能应当为至少4kcal/mol.，更优选地，为至少6、8、10、12、15或20kcal/mol.。优选地，在具体部位的附着的存在减少了不超过3、4、5、8、10、12或15kcal/mol的结合能。
在许多情况下，合适的附着位点是那些当结合化合物结合在结合部位中时暴露于溶剂的部位。在一些情况下，可以使用将导致酶的一部分发生小的移位而没有过度能量损失的附着位点。可以以各种方式鉴定暴露部位。例如，使用图形显示或3维模型可以鉴定暴露部位。在图形显示例如计算机显示中，可以在视觉上观察结合在结合部位中的化合物的图像，以展示在所述化合物上的原子或基团，所述原子或基团暴露于溶剂，并且被定向以使在这样的原子或基团上的附着不会阻碍酶和结合化合物的结合。基于由附着以及熵变引起的变化或扭变，可以计算出附着的能量损失。
可以附着许多不同种类的成分。技术人员熟悉各种各样的附着所使用的化学术。可以被附着的成分的例子包括而不限于固相成分，例如珠子、板、芯片和孔；直接或间接标签；连接体，其可以是无痕(traceless)的连接体；以及其它。此类连接体本身可以附着于其它组分，例如附着于固相介质、标签和/或结合部分。
使用众多可得的软件中的任何一种或通过手动计算，可以近似计算出化合物的结合能以及该分子与另一个成分附着对结合能的影响。例子如下 进行计算，以估计不同有机分子对两种激酶PIM-1和CDK2的结合能。所考虑的有机分子包括星形孢菌素、经鉴定结合PDE5A的化合物以及几种连接体。
使用Tripos软件套件中的FlexX score(执行Bohm记分功能)，获得计算的蛋白质-配体复合物之间的结合能。该方程式的形式如下面的方程所示ΔG结合＝ΔGtr+ΔGhb+ΔGion+ΔGlipo+ΔGarom+ΔGrot 其中ΔGtr是说明配体的转动熵和平移熵的总损失的常数项，ΔGhb说明在配体和蛋白质之间形成的氢键，ΔGion说明配体与蛋白质之间的离子相互作用，ΔGlipo说明对应于蛋白质与配体接触表面的亲脂相互作用，ΔGarom说明在蛋白质和配体中的芳环之间的相互作用，ΔGrot说明在结合之后的配体中限制旋转键的熵减(entropic penalty)。
本方法评估了先导化合物针对具有晶体结构的靶蛋白应当具有的自由能，并且它说明了柔性连接体的熵减。因此，它可以被用于评估由于使连接体附着于被筛选的分子而引起的自由能减(free energy penalty)，以及为了克服该连接体的自由能减先导化合物应当具有的结合能。本方法不考虑溶剂化的因素，对于其中连接体是通过另一个结合复合物例如生物素:链霉抗生物素复合物与固相结合的情况，熵减很可能被高估。
通过用CDK2中的相应残基叠加PIM-1的残基，比对共晶体。用于这些计算的PIM-1结构为PIM-1与结合化合物的共晶体。所使用的CDK2星形孢菌素共晶体来自Brookhaven数据库文件laq1。氢原子被添加到蛋白质上，并使用Syby1中的AMBER95参数分配原子电荷。用来自Tripos的Syby1建模套件对所述化合物进行修饰。
这些计算表明，强烈结合到给定靶(例如星形孢菌素CDK2)的化合物的计算出的结合能可低于-25kcal/mol.，而优良支架或未最优化的结合化合物的计算出的结合亲和性可以在-15至-20的范围内。附着于连接体例如乙二醇或己三烯的自由能减被估计为一般在+5至+15kcal/mol的范围内。
连接体 适合在本发明中使用的连接体可以是很多不同类型。基于多种因素，例如适宜附着于结合化合物和在具体应用中所用的其它成分的连接体化学，连接体可以被选择用于具体应用。另外的因素可以包括而不限于连接体长度、连接体稳定性和在适当时间去除连接体的能力。示例性连接体包括但不限于己基、己三烯基、乙二醇和肽连接体。也可以使用无痕迹连接体，如在Plunkett，M.J.，and Ellman，J.A.，(1995)，J.Org.Chem.606006中所述。
被用于连接结合化合物(一个或多个)的典型的官能团包括但不限于羧酸、胺、羟基和硫醇。(在Solid-supported combinatorial and parallel synthesis of smallmolecular weight compound libraries；(1998)Tetrahedron organic chemistry series Vol.17；Pergamon；p85中可以找到例子)。
标记 如上所述，也可以将标记附着于结合化合物或附着于附着在结合化合物上的连接体。这样的附着可以是直接的(直接附着于结合化合物)或间接的(附着在直接或间接附着于结合化合物的成分上)。此类标记允许直接或间接检测所述化合物。使用常规化学可以进行标记的附着。标记可以包括，例如，荧光标记、放射性标记、光散射颗粒、光吸收颗粒、磁性颗粒、酶和特异结合剂(例如生物素或抗体靶部分)。
固相介质 可以被直接或间接附着于结合化合物的成分的另外的例子包括各种固相介质。类似于连接体和标记的附着，使用常规化学可以进行与固相介质的附着。这样的固相介质可以包括，例如，小成分例如珠子、纳米颗粒和纤维(例如在悬浮液中或在凝胶或层析基质中)。同样，固相介质可以包括较大物体，例如板、芯片、载片和管。在许多情况下，结合化合物将仅仅附着在这样的物体的一部分上，例如在点上，或大致平面上的其它局部部位中，或在孔中或孔的一部分中。
生物试剂的鉴定 对关于蛋白质的结构信息的拥有也提供了对有用的生物试剂例如用于抗体开发的表位的鉴定，被期望影响活性的突变位点的鉴定，以及允许蛋白质与诸如标记、连接体、肽和固相介质的物质附着的附着位点的鉴定。
在众多领域中抗体(Abs)得到了多种应用，包括生物技术、医学和诊断，并且它们确实是生命科学研究的最强有力的工具之一。针对蛋白质抗原的抗体可以识别线性或天然三维(3D)表位。识别3D表位的Abs的获取要求使用全天然蛋白质(或使用呈现为天然构象的部分)作为免疫原。不幸的是，这并非总是可以选择的，原因在于各种技术原因例如，天然蛋白质刚好是不可得的，蛋白质是有毒的，或使用高密度抗原呈递是期望的。在这样的情况下，用肽免疫是可供选择的办法。当然，以这种方式产生的Abs将识别线性表位，并且它们可以或不可以识别来源天然蛋白质，然而它们对标准试验室应用例如蛋白质印迹是有用的。通过下面的具体选择规则和/或表位预测软件的使用，可完成对用作免疫原的肽的选择。
虽然预测抗原肽的方法并非总是可靠的，然而存在几种可以遵循的规则，以确定来自蛋白质的哪些肽片段有可能是抗原性的。这些规则也被规定以增加针对特定肽的Ab识别天然蛋白质的可能性。
●1.抗原肽应当位于溶剂可及区，且含有疏水和亲水残基。
○对于已知3D结构的蛋白质，使用多种程序例如DSSP、NACESS或WHATIF以及其它程序可以确定溶剂可及性。
○如果3D结构是未知的，使用以下任何一种网络服务器预测可及性PHD、JPRED、PredAcc(c)、ACCpro。
●2.优选地，选择位于连接二级结构(SS)基序的长环中的肽，避免位于螺旋区中的肽。这将增加Ab识别天然蛋白质的几率。例如，可以根据晶体结构或基于晶体结构的同源模型识别这样的肽。
○对于具有已知3D坐标的蛋白质，可以从Brookhaven data bank的相关条目的序列链接中获取SS。PDBsum服务器也可以提供pdb记录的SS分析。
○当没有结构可利用时，可以从下列服务器的任何一个获得二级结构预测PHD、JPRED、PSI-PRED、NNSP等。
●3.当可能时，选择位于蛋白质的N-端区和C-端区的肽。因为蛋白质的N-端区和C-端区通常是溶剂可及且松散的。针对这些区的Abs也有可能识别天然蛋白质。
●4.对于细胞表面糖蛋白，从最初的肽中除出那些含有N-糖基化的共有位点(consesus site)的肽。
○使用Scanprosite或NetNGlyc可以检测N-糖基化位点。
另外，几种基于实验测定表位的各种物理-化学性质(柔性、亲水性、可及性)的方法已经被公开，用于预测抗原决定簇，并且可以使用。The antigenic index和Preditop是例子。
用于预测抗原决定簇的有利的方法是Kolaskar和Tongaonkar的方法，所述方法基于氨基酸残基在实验测定表位中的出现。(Kolaskar and Tongaonkar(1990)Asemi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens.FEBBS Lett.276(1-2)172-174)。预测算法如下运行●1.计算每一个重叠7-mer的平均倾向(average propensity)，并将此结果分配给7-mer的中央残基(i+3)。
●2.计算全蛋白质的平均值。
●3.(a)如果全蛋白质的平均值高于1.0，则平均倾向高于1.0的所有残基潜在地具有抗原性。
●3.(b)如果全蛋白质的平均值低于1.0，则具有高于全蛋白平均值的所有残基潜在地具有抗原性。
●4.找到8-mers，其中所有的残基通过上面的步骤3选择(在原始论文中为6-mers)。
Kolaskar和Tongaonkar方法也可从GCG包获得，并且它使用命令egcg运行。
晶体结构也允许残基的鉴定，在该残基上突变有可能改变蛋白质的活性。例如这样的残基包括与底物相互作用的残基、保守活性部位残基以及在三级相互作用中所涉及的有序二级结构的区域中的残基。有可能影响活性的突变将根据不同分子环境而变化。将影响活性的在活性部位中的突变一般为消除电荷-电荷相互作用或氢键相互作用或引入位阻干涉的取代或删除。有可能影响活性的在二级结构区或分子相互作用区中的突变包括，例如，取代，所述取代改变了接近或包括活性部位的区域的疏水性/亲水性，或者在该区域中引入足够的应变，从而使该活性部位中的关键残基(一个或多个)被置换。这样的取代和/或删除和/或插入被识别，并且使用常规软件，可以计算突变的预测的结构效应和/或能量效应。
XI.磷酸二酯酶活性测定 可以使用大量不同的磷酸二酯酶活性测定，用于分析活性调节剂和/或确定一种具体磷酸二酯酶或多种磷酸二酯酶的调节剂的特异性。除了在下面的实施例中所提及的测定，本领域普通技术人员知道存在可以使用的其它测定，并且可以针对具体应用调整测定。例如，涉及PDEs的众多论文描述了可以被使用的测定。例如，有用的测定在Fryburg et al.，美国专利申请公开号2002/0165237，Thompsonet al.，美国专利申请公开号2002/0009764，Pamukcu et al.，美国专利申请09/046,739和Pamukcu et al.，美国专利6,500,610中被描述。
根据下面的步骤，使用纯化的PDE4B，使用在实施例中所述的步骤，可以进行可被用于PDE4B的磷酸二酯酶活性测定。
另外的可选测定可以使用结合测定。例如，以荧光共振能量转移(FRET)形式，或者使用AlphaScreen(放大的发光的邻近均相测定(amplified luminescentproximity homogeneous assay))形式，通过使附着于链霉抗生物素或磷光体特异抗体的供体和受体试剂变化，该种测定被格式化。
XII.有机合成技术 基于计算机的调节剂设计和鉴定的多功能性在于由计算机程序所筛选的结构的多样性。计算机程序可以搜索含有极大量分子的数据库，并且可以用广泛众多的化学官能团修饰已经与酶络合的调节剂。该化学多样性的结果是潜在的磷酸二酯酶功能调节剂可以采取不可预测的化学形式。在本领域中存在大量的有机合成技术，以满足构建这些潜在调节剂的挑战。这些有机合成方法中的很多种在本领域技术人员所用的标准参考来源中得以详细描述。这样的参考的一个例子是March，1994，Advanced Organic Chemistry；Reactions，Mechanisms and Structure，New York，McGraw Hill。因此，用来合成通过基于计算机方法而鉴定的潜在的磷酸二酯酶功能调节剂的技术对于有机化学合成领域的技术人员而言是方便可得的。
XIII.给药 所述方法和化合物一般将被用于人类患者的治疗中。然而，它们也可以被用于治疗在其它脊椎动物中的相似的或相同的疾病，所述其它脊椎动物例如其它灵长类、运动动物和宠物如马、狗和猫。
合适的剂型，部分地取决于给药的用途或途径，例如经口、经皮、经粘膜、吸入或通过注射(肠胃外)。此类剂型应当使化合物到达靶细胞。其它因素在本领域中是熟知的，包括需要考虑的事项，例如毒性和延迟化合物或组合物发挥其效应的剂型。技术和配方一般可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thed.，MackPublishing Co.，Easton，PA，1990(引入于此作为参考)中找到。
化合物可以被配制为药物学可接受盐。药物学可接受盐在它们被施用的量和浓度下是无毒的。在不阻止其发挥生理效应的情况下，通过改变化合物的物理特性，这样的盐的制备可以促进药理学应用。在物理性质上有用的改变包括降低熔点以促进经粘膜给药，及增加溶解度以促进施用更高浓度的药物。
药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如那些含有硫酸盐、氯化物、氢氯化物、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己氨基磺酸盐和奎尼酸盐的盐。药物学可接受盐可以从酸获取，例如盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己氨基磺酸、延胡索酸和奎尼酸。
当酸性官能团例如羧酸或酚存在时，药学上可接受的盐也包括碱加成盐，例如那些含有苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌的盐。例如，参见Remington′sPharmaceutical Sciences，19thed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，Vol.2，p.1457，1995。使用合适的相应的碱可以制备此类盐。
通过标准技术，可以制备药学上可接受的盐。例如，将自由碱形式的化合物溶解在合适的溶剂中，例如含有适宜酸的水性溶液或水-醇溶液，然后蒸发溶液进行分离。在另一个实例中，通过使自由碱与在有机溶剂中的酸反应来制备盐。
不同化合物的药学上可接受的盐可以作为络合物存在。络合物的例子包括8-氯茶碱络化物(类似于，例如，茶苯海明∶苯海拉明8-氯茶碱(1∶1)络合物；晕海宁)和各种各样的包合环糊精的络合物。
载体或赋形剂可以被用于产生药物组合物。所述载体或赋形剂可以被选择为促进化合物的给药。载体的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖例如乳糖、葡萄糖或蔗糖、或淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理相容溶剂。生理相容溶剂的例子包括注射用水(WFI)无菌溶液、盐溶液和葡萄糖。
可以通过不同的路径施用化合物，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经口、经粘膜、直肠、吸入或经皮。优选口服。对口服而言，例如，化合物可以被配制为常规口服剂型，例如胶囊、片剂，以及液体制剂，例如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。
可以获得口服用途的药物制剂，例如通过组合活性化合物与固体赋形剂，任选研磨所形成的混合物，以及加工颗粒的混合物，这在加入合适的辅剂之后，如果需要辅剂的话，从而获得片剂或糖衣丸。合适的赋形剂，具体而言是，填料例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP聚维酮(povidone))。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或它们的盐，例如藻酸钠。
糖衣丸被提供为具有合适的糖衣。对于此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选含有例如阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡巴普凝胶、聚乙二醇(PEG)和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖衣丸糖衣中，用于识别或者表征活性化合物剂量的不同组合。
可以经口服用的药物制剂包括由明胶(“gelcaps”)制成的推合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的软的、密封胶囊。推合胶囊可以含有活性成分，其与填料例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁，以及可选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇(PEGs)中。另外，可以加入稳定剂。
可选地，可以使用注射(肠胃外给药)，例如肌内的、静脉内的、腹膜内的和/或皮下的。对于注射而言，本发明的化合物被配制为无菌液体溶液，优选在生理相容的缓冲液或溶液中，例如盐溶液、Hank′s溶液或Ringer′s溶液。另外，化合物可以被配制为固体形式，并在使用之前立刻被再溶解或悬浮。也可以生产冻干形式。
给药也可以通过经粘膜、经皮或吸入方式。对于经粘膜、经皮或吸入给药，在配方中使用适合待穿透的屏障的穿透剂。这样的穿透剂在本领域中是普遍已知的，包括，例如，对于经粘膜给药，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。另外，可以使用去垢剂以促进穿透。经粘膜给药，例如，可以通过鼻喷雾或栓剂(经直肠或阴道)。
对于吸入剂，可以将本发明的化合物配制为干粉或合适的溶液、悬浮液或气雾剂。粉末和溶液可以和本领域已知的合适的添加剂配制。例如，粉末可以包括合适的粉末基质(powder base)如乳糖或淀粉，溶液可以包括丙二醇、无菌水、乙醇、氯化钠和其它添加剂如酸、碱和缓冲盐。可以经喷雾、泵、喷雾器或雾化器等等通过吸入给予这种溶液或悬浮液。本发明的化合物也可以与其它吸入疗法联合应用，例如，皮质类固醇如氟替卡松丙酸酯、倍氯米松二丙酸酯、丙炎松(triamcinolone acetonide)、布德松和莫米松糠酸酯(mometasone furoate)；β受体激动剂如沙丁胺醇、沙美特罗和福莫特罗；抗胆碱能剂如异丙托溴胺(ipratropriumbromide)或噻托(tiotropium)；血管扩张剂如treprostinal和伊洛前列素(iloprost)；酶如DNA酶；治疗性蛋白；免疫球蛋白抗体；寡核苷酸如单链或双链DNA或RNA、siRNA；抗生素如妥布霉素；毒蕈碱受体拮抗剂；白三烯拮抗剂；细胞因子拮抗剂；蛋白酶抑制剂；色甘酸钠(cromolyn sodium)；nedocril sodium和色甘酸钠(sodiumcromoglycate)。
应该理解，联合应用包括以任何制剂共同输送本发明化合物和一种或多种其它吸入治疗，包括两种化合物被化学连接的制剂，这样，在施用时它们保持其治疗活性。联合应用包括给予共制剂或化学连接化合物制剂，或共同给予单独制剂中的化合物。可以通过从相同的吸入设备传输共同给予单独的制剂，或者可以分开的吸入设备共同给予单独的制剂，这种情况下的共同给予是指在彼此的短时间内给予。本发明化合物和一种或多种附加吸入治疗的共制剂包括共同制备物质，由此，它们可以由一个吸入设备给予，所述设备含有组合在一种制剂中的单独化合物，或者被修饰以至于被化学连接而仍然保持其生物学活性的化合物。
通过标准程序可以确定待施用的各种化合物的量，考虑的因素例如所述化合物IC50、所述化合物的生物半衰期、患者的年龄、大小和体重以及与患者有关的病症。这些因素和其它因素的重要性对本领域普通技术人员而言是熟知的。一般而言，剂量将在被治疗的患者的大约0.01mg/kg与50mg/kg之间，优选在0.1mg/kg和20mg/kg之间。可以使用多次剂量。
XIV.PDE4B的操作 因为来自多种哺乳动物包括人的PDE4B的全长编码序列和氨基酸序列是已知的，所以克隆、构建重组PDE4B、重组蛋白质的生产和纯化、PDE4B向其它生物体中的引入以及PDE4B的其它分子生物学操作可以容易地进行。
操作核酸的技术，例如，如亚克隆、标记探针(例如使用Klenow聚合酶的随机-引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交以及类似技术被完整地公开在科学文献和专利文献中，例如参见Sambrook，ed.，Molecular Cloninga LaboratoryManual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization WithNucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen ed.Elservier，N.Y.(1993)。使用扩增方法，例如PCR、等温方法、滚环方法等，可以根据需要扩增核酸序列，用于进一步的应用，这是技术人员熟知的。例如参见Saiki，“Amplification of Genomic DNA”in PCR Protocols，Innis et al.，Eds.，Academic Press，San Diego，CA 1990，pp 13-20；Wharam et al.，Nucleic Acids Res.2001 Jun 1；29(11)E54-E54；Hafner et al.，Biotechniques 2001 Apr；30(4)852-6,858,860passim；Zhonget al.，Biotechniques 2001 Apr；30(4)852-6,858,860passim。
通过本领域技术人员熟知的大量一般方法中的任意方法，可以分析和定量核酸、载体、衣壳、多肽以及类似物。这些包括，例如，分析生化方法例如NMR、分光光度法、射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)及超扩散层析，多种免疫学方法，例如流体或凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(RIAs)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光测定、DNA分析、RNA分析、斑点印迹分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、核酸或靶或信号放大方法、放射性标记、闪烁计数和亲和层析。
通过从基因组样品克隆，以及如果需要的话，通过筛选和再克隆插入片段，可以获得用于在实践本发明的方法中使用的核酸并对其进行操作，所述插入片段例如从基因组克隆或cDNA克隆分离或扩增。在本发明的方法中使用的核酸的来源包括基因组或cDNA文库，其包含在例如哺乳动物人工染色体(MACs)中，例如参见美国专利5,721,118；6,025,155；人类人工染色体，例如参见Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，例如参见Woon(1998)Genomics 50306-316；P1-衍生载体(PACs)，例如参见Kern(1997)Biotechniques 23120-124；黏粒、重组病毒、噬菌体或质粒。
本发明的核酸可以被操纵性地连接到启动子。启动子可以是一个基序或者指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。启动子可以包括在转录的起始位点附近的必需的核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子情况下，TATA元件。启动子也任选包括远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距离转录的起始位点多达数千碱基对之处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下是活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下的启动子。“组织特异性”启动子在生物体的某些组织类型中是活性的，但在相同生物体的其它组织类型中不是活性的。词语“操纵性连接(operably linked)”指的是在核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
本发明的核酸也可以被提供在表达载体和克隆载体中，例如编码本发明的多肽的序列。本发明的表达载体和克隆载体可以包括病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、黏粒、F黏粒、细菌人工染色体、病毒DNA(例如牛痘、腺病毒、foul痘病毒、伪狂犬病病毒和SV40的衍生物)、P1-型人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和特异于特定的感兴趣宿主的任何其它载体(例如杆菌、曲霉属(Aspergillus)和酵母)。本发明的载体可以包括染色体DNA序列、非染色体DNA序列和合成的DNA序列。大量合适的载体是本领域技术人员已知的并且是商业可得的。
使用常规分子生物学方法，如果需要的话，本发明的核酸可以被克隆到多种载体中的任何一种中；克隆体外扩增的核酸的方法被公开在例如美国专利5,426,039中。为便于扩增序列的克隆，限制酶位点可以被“构建到”PCR引物对中。载体可以被引入到基因组或引入到胞质或细胞的核中，并且通过众多常规技术来表达，其在科学和专利文献中得以完整地描述。例如参见Roberts(1987)Nature328731；Schneider(1995)Protein Expr.Purif.643510；Sambrook，Tijssen or Ausubel。也可以从天然来源分离载体，从来源例如ATCC或GenBank文库获得载体，或者通过合成或重组方法制备载体。例如，本发明的核酸可以被表达在表达盒、载体或病毒中，所述表达盒、载体或病毒在细胞中被稳定表达或瞬时表达(例如附加型表达系统)。可以将选择标记整入到表达盒和载体中，以使转化的细胞和序列具有可选择的表型。例如，选择标记可以编码用于附加型的维持和复制(episomalmaintenance and replication)，以致于不需要整合到宿主基因组中。
本发明的核酸被体内施用，用于在原位表达本发明的肽或多肽。核酸可以作为“裸DNA”而被施用(例如参见美国专利5,580,859)，或者以表达载体的形式被施用，例如重组病毒。可以通过任何途径施用核酸，包括肿瘤外周施用(peri-tumorally)或肿瘤内施用(intra-tumorally)，如下所述。体内施用的载体可以来自病毒基因组，包括重组修饰的有包被或无包被的DNA病毒和RNA病毒，优选地选自杆状病毒科、细小病毒科、picornoviridae、疱疹病毒科、痘病毒科、腺病毒科或picornnaviridiae。也可以使用嵌合载体，其利用了每一个亲代载体性质的有利特征(例如参见Feng(1997)Nature Biotechnology 15866-870)。通过重组DNA技术，此类病毒基因组可以被修饰以包括本发明的核酸；并且可以被进一步改造为复制缺陷型、条件复制型或可复制型。在可选的方面，载体来自腺病毒(adenoviral)(例如来自人腺病毒基因组的不可复制型载体，例如参见美国专利6,096,718；6,110,458；6,113,913；5,631,236)；腺病毒相关病毒(adeno-associated viral)和反转录病毒基因组。反转录病毒载体可以包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)以及它们的组合的载体；例如参见美国专利6,117,681；6,107,478；5,658,775；5,449,614；Buchscher(1992)J.Virol.662731-2739；Johann(1992)Virol.661635-1640)。腺病毒相关病毒(AAV)型载体可以被用于用靶核酸转导细胞，例如在核酸和肽的体外生产中，以及在体内基因治疗步骤和先体外后体内基因治疗步骤中；例如参见美国专利6,110,456；5,474,935；Okada(1996)Gene Ther.3957-964。
本发明也涉及融合蛋白和编码它们的核酸。本发明的多肽可以被融合为异源肽或多肽，例如N端鉴定肽，其给予了期望的特征，例如增加的稳定性或简化的纯化。本发明的肽和多肽也可以被合成和表达为融合蛋白，其具有连接在那里的一个或多个另外的结构域，例如用于产生更加具有免疫原性的肽，以便更容易地分离重组合成肽、鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞等等。有利于检测和纯化的结构域包括例如金属鳌合肽，例如允许在固定化金属上进行纯化的聚组氨酸区和组氨酸-色氨酸模块(histidine-tryptophan modules)、允许在固定的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域以及用在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)中的结构域。在纯化结构域和含基序的肽或多肽之间引入可切割连接体序列，例如Xa因子或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)，以促进纯化。例如，表达载体可以包括表位编码核酸序列，其连接至六个组氨酸残基，之后是硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(例如参见Williams(1995)Biochemistry 341787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12404-414)。组氨酸残基有助于检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了用于将表位从融合蛋白的剩余部分纯化出来的方法。在一个方面，编码本发明的多肽的核酸以合适的位置与前导序列装配，该前导序列能够指引翻译后的多肽或其片段的分泌。有关编码融合蛋白的载体的技术和融合蛋白的应用的技术被完整公开在科学文献和专利文献中，例如参见Kroll(1993)DNA Cell.Biol.12441-53。
本发明的核酸和多肽可以与固相支持物结合，例如用在筛选和诊断方法中。固相支持物可以包括例如膜(例如硝化纤维或尼龙)、微量滴定盘(例如PVC、聚丙烯或聚苯乙烯)、试管(玻璃或塑料)、浸杆(例如玻璃、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯、乳胶以及类似物)、微量离心管，或玻璃、硅石、塑料、金属珠或聚合物珠，或其它基质例如纸。一种固相支持体使用包含金属(例如钴或镍)的柱，其特异性结合到通过工程手段与肽连接的组氨酸标签。
分子粘合到固相支持物上可以是直接的(即分子接触该固相支持物)或间接的(“连接体”与支持物结合，并且感兴趣的分子与该连接物结合)。分子可以是被共价地固定(例如，利用半胱氨酸残基的单反应性硫醇基(例如参见Colliuod(1993)Bioconjugate Chem.4528-536)或非共价但特异性地固定(例如，经由固定的抗体(例如参见Schuhmann(1991)Adv.Mater.3388-391；Lu(1995)Anal.Chem.6783-87；生物素/链霉抗生物素系统(例如参见Iwane(1997)Biophys.Biochem.Comm.23076-80)；金属螯合，例如Langmuir-Blodgett膜(例如参见Ng(1995)Languir 114048-55)；金属螯合自组装单层(例如参见Sigal(1996)Anal.Chem.68490-497)，用于聚组氨酸融合物的结合。
使用商业可得的众多连接体可以实现间接结合。反应端可以是多种官能度中的任何一种，包括而不限于氨基反应端，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯、亚氨酸酯、醛、环氧化物、磺酰卤化物、异氰酸酯、异硫氰酸盐和硝基芳基卤化物(nitroaryl halides)；和硫醇反应端，例如吡啶基二硫化物(pyridyl disulfides)、马来酰亚胺、硫代酞酰亚胺(thiophthalimides)和活性卤。异型双功能交联剂具有两个不同的反应端，例如氨基反应端和硫醇反应端，而同型双功能交联剂具有两个相似的反应端，例如双马来酰亚胺己烷(bismaleimidohexane)(BMH)，其允许含硫氢基的化合物的交联。间隔子可以具有变化的长度，并且可以是脂族或芳香族的。商业可得的同型双功能交联剂的例子包括但不限于亚氨酸酯，例如己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(dimethyl adipimidate dihydrochloride)(DMA)；庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(dimethyl pimelimidate dihydrochloride)(DMP)；和辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(dimethyl suberimidate dihydrochloride)(DMS)。异型双功能交联剂包括商业可得的活性卤-NHS活性酯偶联剂，例如N-琥珀酰亚胺基溴乙酯(N-succinimidylbromoacetate)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate)(SIAB)，以及磺基琥珀酰亚胺基(sulfosuccinimidyl)衍生物，例如磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)(Pierce)。另一组偶联剂是异型双功能和硫醇可切割剂，例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)(Pierce Chemicals，Rockford，IL)。
抗体也可以被用于将本发明的多肽和肽结合到固相支持物上。这可以直接通过将肽特异性抗体结合到柱来完成，或者可以通过产生融合蛋白嵌合体来完成，所述嵌合体包括连接到例如已知表位(例如标签(例如FLAG、myc)或者合适的免疫球蛋白的恒定区序列(“免疫黏附素(immunoadhesin)”，例如参见Capon(1989)Nature 377525-531(1989))的含基序的肽。
本发明的核酸或多肽可以被固定到阵列或应用于阵列。阵列可以被用于筛选或监测组分的文库(例如小分子、抗体、核酸等)，检测它们结合本发明的核酸或多肽或调节本发明的核酸或多肽的活性的能力。例如，在本发明的一个方面，被监测的参数是包括本发明的核酸的基因的转录体表达。通过杂交包括细胞的转录体的样品，或杂交代表细胞转录体的核酸或细胞转录体的互补核酸，或者通过与阵列或“生物芯片”上的固定化核酸杂交，可以测量细胞的一种或多种或者所有的转录体。通过使用在微芯片上的核酸的“阵列”，可以同时对细胞的一些或所有转录体进行定量。可选地，包括基因组核酸的阵列也可以被用于确定通过本发明的方法而制备的新工程菌株的基因型。多肽阵列也可以被用于同时对众多蛋白质进行定量。
如此处所用的术语“阵列(array)”或“微阵列(microarray)”或“生物芯片(biochip)”或“芯片(chip)”是众多的靶元件，每个靶元件包括固定到基底表面的确定区域的确定量的一个或多个多肽(包括抗体)或核酸。在实践本发明的方法中，可以完全或部分引入任何已知的阵列和/或制作和使用阵列的方法，以及其变化形式，例如，如在美国专利6,277,628；6,277,489；6,261,776；6,258,606；6,054,270；6,048,695；6,045,996；6,022,963；6,013,440；5,965,452；5,959,098；5,856,174；5,830,645；5,770,456；5,632,957；5,556,752；5,143,854；5,807,522；5,800,992；5,744,305；5,700,637；5,556,752；5,434,049中所公开的；例如也参见WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958；例如也参见Johnston(1998)Curr.Biol.8R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques 231087-1092；Kern(1997)Biotechniques 23120-124；Solinas-Toldo(1997)Genes，Chromosomes &Cancer 20399-407；Bowtell(1999)Nature Genetics Supp.2125-32。也参见公开的美国专利申请20010018642；20010019827；20010016322；20010014449；20010014448；20010012537；20010008765。
宿主细胞和转化细胞 本发明也提供转化细胞，其包括本发明的核酸序列，例如编码本发明的多肽的序列，或本发明的载体。宿主细胞可以是本领域技术人员所熟悉的宿主细胞中的任何一种，包括原核细胞、真核细胞，例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性细菌细胞包括大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌(Pseudomonas)属、链霉菌(Streptomyces)属和葡萄球菌(Staphylococcus)属的各个种。示例性昆虫细胞包括果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9。示例性动物细胞包括CHO、COS或Bowes黑素瘤或任何鼠或人细胞系。对合适的宿主的选择在本领域技术人员的能力范围之内。
使用众多技术中的任何一种，可以将载体引入宿主细胞中，所述技术包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-介导的基因转移。具体方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。
可以在常规营养培养基中培养工程宿主细胞，所述培养基被改良为适合活化启动子、选择转化体或扩增本发明的基因。在合适的宿主菌株被转化并且该宿主菌株生长到适宜的细胞密度之后，被选择的启动子可以通过合适的手段(例如温度变动或化学诱导)被诱导，并且细胞可以被培养另外一段时间，以使它们产生期望的多肽或其片段。
通过离心可以收获细胞，通过物理方法或化学方法破裂细胞，并且保留所产生的粗提物用于进一步纯化。用于蛋白质表达的微生物细胞可以通过任何常规方法来破裂，所述方法包括冻-融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。此类方法是本领域技术人员熟知的。通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析的方法，表达的多肽或片段可以从重组细胞培养物中被回收且纯化。根据需要，可以使用蛋白质重折叠步骤来完成多肽的构型。如果需要的话，可以使用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
各种哺乳动物细胞培养系统也可以被用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞的COS-7系和能够表达来自相容载体的蛋白质的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。
在宿主细胞中的构建物可以以常规的方式被用于生产被重组序列编码的基因产物。取决于在重组生产步骤中所使用的宿主，由含有载体的宿主细胞产生的多肽可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括或不包括初始的甲硫氨酸氨基酸残基。
也可以使用无细胞翻译系统生产本发明的多肽。无细胞翻译系统可以使用转录自DNA构建物的mRNAs，该DNA构建物包括与编码多肽或其片段的核酸操纵性连接的启动子。在一些方面中，在进行体外转录反应之前，DNA构建物可以被线性化。然后用合适的无细胞翻译提取液，例如兔网织红细胞提取液，温育转录的mRNAs，以产生期望多肽或其片段。
表达载体可以含有一个或多个选择标记基因，以提供用于转化宿主细胞的选择的表型特性，例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶抗性或新霉素抗性，或者例如在大肠杆菌中的四环素抗性或氨苄青霉素抗性。
对于在哺乳动物细胞中的瞬时表达，编码感兴趣多肽的cDNA可以被引入到哺乳动物表达载体中，例如pcDNA1，其商业供应自Invitrogen Corporation(SanDiego，Calif.，U.S.A.；目录号V490-20)。这是为真核系统中的cDNA表达以及原核生物中的cDNA分析而设计的多功能4.2kb质粒载体，整合在载体上的是CMV启动子和增强子、剪接片段和多腺苷酸化信号、SV40和多瘤病毒的复制起点、拯救用于测序和突变发生的单链DNA的M13起点、用于产生正义和反义RNA转录体的Sp6和T7 RNA启动子以及Col E1样高拷贝质粒起点。多接头适宜地位于CMV启动子的下游(和T7启动子的3′)。
cDNA插入片段首先可以从上述整合在pcDNAI多接头的合适的限制位点的噬粒释放。可以沿着衔接点进行测序，以证明在pcDNAI中的正确的插入方向。然后可以将所产生的质粒引入所选的哺乳动物细胞宿主，例如来自猴的COS-1谱系的成纤维样细胞(供应自美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.ATCC CRL1650)，用于瞬时表达。
对于编码蛋白质的DNA的瞬时表达，例如，通过DEAE介导的DNA转染，可以用大约8μg DNA/106个COS细胞转染COS-1细胞，并用氯喹处理，如Sambrook et al，Molecular CloningA Laboratory Manual，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor N.pp.16.30-16.37描述的步骤。示例性的方法如下。简言之，以5×106个细胞/盘的密度铺COS-1细胞，然后在FBS补充的DMEM/F12培养基中生长24小时。然后移去培养基，在PBS中洗涤细胞，然后在培养基中洗涤细胞。将含有DEAE葡聚糖(0.4mg/ml)、100μM氯喹、10％NuSerum和DNA(0.4mg/ml)的DMEM/F12培养基的转染溶液以10ml体积施用于细胞上。在37℃温育3小时之后，如刚刚描述地在PBS和培养基中洗涤细胞，之后用含10％DMSO的DMEM/F12培养基短时作用1分钟。使细胞在10％FBS补充的培养基中生长2-3天，并在温育结束时将培养皿(dishes)置于冰上，用冰冷的PBS洗涤，然后通过刮擦(scraping)移除。然后通过在1000rpm离心10分钟收获细胞，并且将细胞团在液氮中冷冻，用于随后的蛋白质表达使用。可以使用冷冻细胞的解冻试样小份的RNA印迹分析来证明储存的细胞中的编码受体的cDNA的表达。
以同样的方式，也可以制备稳定转染的细胞系，例如，使用两种不同的细胞类型作为宿主CHO K1和CHO Pro5。为构建这些细胞系，可以将编码相关蛋白质的cNDA整合到哺乳动物表达载体pRC/CMV(Invitrogen)中，这使稳定的表达得以发生。在该部位的插入将cNDA放置于巨细胞病毒启动子的表达调控下和聚腺苷酸化位点以及牛生长激素基因的终止子的上游，并且将cNDA置于包括作为选择标记的新霉素抗性基因(通过SV40早期启动子驱动)的载体背景(vectorbackground)中。
引入如上所述构建的质粒的示例性试验步骤如下。首先将宿主CHO细胞以5×105的密度接种在10％FBS补充的MEM培养基中。生长24小时之后，向板中加入新鲜培养基，三小时之后，使用磷酸钙-DNA共沉淀步骤转染细胞(Sambrooket al，supra)。简言之，在室温下，使3μg DNA与缓冲钙溶液混合且温育10分钟。加入等体积的缓冲磷酸盐溶液，并且在室温下将悬液温育15分钟。接下来，将温育的悬液施用于细胞4小时，去除，并且用含有15％甘油的培养基短时作用细胞。三分钟之后，用培养基洗涤细胞，并使其在正常生长条件下培养24小时。在含有G418(1mg/ml)的10％FBS补充的α-MEM培养基中选择具有新霉素抗性的细胞。大约2-3周之后，分离抗G418细胞的各个菌落，进行克隆选择，然后繁殖，用于分析测定目的。
实施例 下面描述了包括在本发明中的很多实施例。在大多数情况下，也可以使用可选的技术。所述实施例的目的是示例性的，而不是限定或限制本发明的范围。可以用本领域技术人员容易得知或可以利用的合适物质进行替换，按照下面描述的方法合成其它化合物。这些化合物连同质谱数据，在一些情况下连同生物学数据被显示在表3、4和5中。
实施例1式I化合物的合成方案1 式Ia 式I 可以如方案1所示制备式I表示的四取代噻吩化合物(Abdelhamid，et.al.，J.Chem.Res.，1999，184-185和其中的参考文献)。
步骤1式(3)的制备 可以如下制备式(3)化合物在碱(例如K2CO3)存在的情况下，在惰性溶剂(例如DMF)中，使式(2)的化合物与式(1)的腈反应，式(2)中的R1＝烷基、杂烷基、杂芳基或芳基(例如，异硫氰酸苯酯)，典型地在室温下反应12-36小时。当反应基本上结束时，可以用常规方法如蒸馏分离式(3)的产物。
步骤2式Ia的制备 可以如下常规制备式Ia的化合物在碱性介质(例如K2CO3/DMF)中，在室温下使式(3)的化合物与式(4)化合物反应数小时。当反应基本上结束时，可以用常规方法(例如反相HPLC)(Smith，et.al.，J.Comb.Chem.，1999，1，368-370和其中的参考文献)分离式Ia的产物。
式I的制备 可以用普通的胺烷化化学方法(amine alkylation chemistry)(例如Borch还原)(Borch，et al.，J.Am.Chem.Soc.，1969，91，3996-3997)制备式I化合物。
实施例2式Ib化合物的合成方案2
式Ib 可以遵照如J.Chem.Res.，1999，184-185中描述的Abdelhamid等人的步骤，如方案2所示制备式Ib所表示的四取代噻吩。
步骤1式Ib的制备 式Ib化合物可以如下常规制备在惰性溶剂(例如DMF)中，在碱(例如K2CO3)存在的情况下，使式(5)的β-氰基-羰基化合物与式(6)的异硫氰酸酯反应，式(5)中的R3＝烷基、杂烷基、杂芳基、N(H)R、OR或芳基(例如2-氰基乙酰胺)，式(6)中的R4＝烷基、芳基、杂烷基或杂芳基(例如异硫氰酸甲酯)，典型地在室温下反应数小时。当反应基本上结束时，可以向反应混合物中加入式(7)的β-卤素-羰基化合物并于室温下反应数小时。产物可以通过常规方法分离(例如，反相HPLC)。(Smith，et.al.，J.Comb.Chem.，1999，1，368-370)。
实施例3式Ib化合物的合成方案3 可以如方案3所示制备式Ib所表示的四取代噻吩(Sommen，et.al.，Tetrahedron Lett.，2002，43，257-259)。
步骤1式(9)的制备 式(9)化合物可以如下常规制备在碱(例如K2CO3)存在的情况下，在惰性溶剂(例如DMF)中，使式(5)的β-氰基-羰基化合物与式(6)的异硫氰酸酯反应，式(5)中的R3＝烷基、杂烷基、杂芳基、NR、OR或芳基(例如2-氰基乙酰胺)，式(6)中的R4＝烷基、芳基、杂烷基或杂芳基(例如异硫氰酸甲酯)，典型地在室温下反应数小时。当反应基本上结束时，向反应混合物中加入碘代甲烷(式8)并于室温下搅拌数小时。当反应基本上结束时，通过常规方法(例如，反相HPLC；Smith，et.al.，J.Comb.Chem.，1999，1，368-370)分离式(9)的产物。
步骤2式Ib的制备 式Ib化合物可以如下常规制备在碱(例如K2CO3)存在的情况下，在惰性溶剂(例如EtOH)中，使式(9)的化合物与式(10)的硫基乙醇酸酯反应，式(10)中的R5＝烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、OR或NR(例如硫基乙醇酸乙酯)，典型地在室温下反应数小时。当反应基本上结束时，通过常规方法分离式Ib的产物(例如，反相HPLC)。Smith，et.al.，J.Comb.Chem.，1999，1，368-370；和其中的参考文献。
实施例4式Ic化合物的合成方案4 可以如方案4所示制备式Ic所表示的四取代噻吩(Sommen，et.al.，Tetrahedron Lett.，2002，43，257-259)。
步骤1式(11)的制备 式(11)化合物可以如下常规制备在碱(例如K2CO3)存在的情况下，在惰性溶剂(例如DMF)中，使丙二腈与式(6)的异硫氰酸酯反应，式(6)中的R4＝烷基、芳基、杂烷基或杂芳基(例如异硫氰酸甲酯)，典型地在室温下反应数小时。当反应基本上结束时，可以向反应混合物中加入碘代甲烷(式8)并于室温下搅拌数小时。通过常规方法分离式(11)的产物(例如，反相HPLC；Smith，et.al.，J.Comb.Chem.，1999，1，368-370)。
步骤-2式Ic的制备 式Ic化合物可以如下常规制备在碱(例如K2CO3)存在的情况下，在惰性溶剂(例如EtOH)中，使式(11)的化合物与式(12)的硫基乙醇酸酯反应，式(12)中的R5＝烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、OR或NR(例如硫基乙醇酸乙酯)，典型地在室温下反应数小时。当反应基本上结束时，通过常规方法分离式Ic的产物(例如，反相HPLC；Smith，et.al.，J.Comb.Chem.，1999，1，368-370)。
实施例5式Ic化合物的合成方案5 式Ic 可以遵照如J.Chem.Res.，1999，184-185中描述的Abdelhamid等人的程序，如方案2所示制备式Ic所表示的四取代噻吩。
步骤1式Ic的制备 式Ic化合物可以如下制备在碱(例如K2CO3)存在的情况下，在惰性溶剂(例如DMF)中，使丙二腈与式(6)的异硫氰酸酯反应，式(6)中的R4＝烷基、芳基、杂烷基或杂芳基(例如异硫氰酸甲酯)，在室温下反应数小时。当反应基本上结束时，向反应混合物中加入式(7)的β-卤素-羰基化合物并于室温下反应数小时。通过结晶分离产物。
实施例6式IIa化合物的合成(其中X＝O或NR4；R1＝烷基、芳基或杂芳基；R2＝取代的胺、醚或腈；R3＝烷基、芳基或杂芳基) 式IIa方案6 式IIa步骤1式(14)的制备 可以如下制备式(14)的化合物将氯化氢气体吹入式(13)化合物在乙醇中的溶液，典型地在0℃持续1小时，并在室温下搅拌16小时。按照标准的操作工艺(work-up procedure)，典型地通过蒸发溶剂，可以得到式(14)的化合物Journal ofAmerican Chemical Society，Vol.68，2393-2395，1946和其中的参考文献)。
步骤2式(16)的制备 通过在惰性溶剂(例如THF)中混合式(14)的化合物和硫代羰基试剂(15，例如1，1’-硫代羰基二咪唑)，可以常规制备式(16)的化合物。可以搅拌混合物直至原材料用尽。可以用常规方法(例如柱层析)分离式(16)的产物。
步骤3式(17)的制备 通过在惰性溶剂(例如乙腈)中混合式(16)化合物和伯烷基或芳基胺，可以制备式(17)的化合物。如果需要，可以加热得到的混合物。按照KhimiyaGeterotsiklicheskikh Soedinenii，Vol.8，1129-1130，1987中描述的操作工艺，可以得到式(17)的化合物。
步骤4式(18)的制备 通过在盐酸水溶液中搅拌式(17)的化合物直至原材料用尽，可以制备式(18)的化合物。如果需要，可以加热此混合物。可以加入惰性溶剂(例如，乙酸乙酯)，其可以经无水盐(例如硫酸镁)干燥。所有溶剂蒸发之后，可以将残余物溶解在惰性溶剂(例如氯仿)中。可以向得到的溶液中加入三氯化磷并搅拌。在参考论文Synthetic Communications，Vol.32，No.12，1791-1795，2002；Heterocycles，Vol.31，No.4，637-641，1990及其中的参考文献中描述的操作工艺之后，可以得到式(18)的化合物。
步骤5式(19)的制备 通过混合式(18)的粗制化合物和醇或伯烷基或芳基胺，可以制备式(19)的化合物。如果需要，可以加热混合物。在参照论文Bioorganic Medicinal chemistry，Vol.9，No.4，897-907，2001和其中的参考文献中描述的操作工艺之后，可以得到式(19)的化合物。
步骤6式IIa的制备 通过在惰性溶剂(例如二氯甲烷)中使式(19)化合物和氯化铝混合，可以制备式IIa的化合物，可以向混合物中加入式(20)的化合物。在Journal of HeterocylicChemistry，Vol.34，No.2，567-572，1997和其中的参考文献中描述的操作工艺之后，可以得到式(19)的化合物。
实施例7式IIb化合物的合成(其中R1＝烷基、芳基或杂烷基；R2＝烷基、芳基、杂芳基、氨基、取代的胺或醚；R3＝烷基、芳基或杂芳基)
式IIb方案7 式IIb步骤1式(23)的制备 通过在0℃，在惰性溶剂(例如TNF)和含水碱(例如NaOH)中混合式(21)化合物和式(22)的化合物，可以制备式(23)的化合物。在Tetrahedron，Vol.57，No.1，153-156，2001和Journal of Organic Chemistry，Vol.65，No.21，7244-7247，2000中描述的操作工艺之后，可以得到式(23)的化合物。
步骤2式(25)的制备 通过在惰性溶剂(例如甲苯)中混合式(23)化合物和碱(例如三乙胺)，并且可以加入式(24)的化合物，典型地在室温下，可以制备式(25)的化合物。当反应基本上结束时，在Tetrahedron，Vol.57，No.1，153-156，2001和Journal of OrganicChemistry，Vol.65，No.21，7244-7247，2000中描述的操作工艺之后，可以得到式(25)的化合物。
步骤3式(IIb)的制备 通过在氮气氛下，在惰性溶剂(例如甲苯)中混合式(25)的化合物，可以制备式(IIb)的化合物，并且可以将其在回流温度下加热。当反应基本上结束时，在Tetrahedron，Vol.57，No.1，153-156，2001和Journal of Organic Chemistry，Vol.65，No.21，7244-7247，2000中描述的操作工艺之后，可以得到式(IIb)的化合物。
实施例8化合物2-25(表2A)的合成
化合物2-25 可以根据下面的方案8制备式II中的示范性化合物2-25，(4-氨基-2-苯氨基-噻唑-5-基)-苯基-甲酮方案8 步骤1式(29)的制备 在0℃向四氢呋喃(21mL)中的2-(4-氯苯甲基)-2-硫代假脲氢氯化物(化合物27，1.24g，5.21mmol)悬浮液中滴加氢氧化钠水溶液(1.00M，5.5mL)，随后加入异硫氰酸苯酯(化合物28，655μL，5.47mmol)。于0℃搅拌得到的溶液1小时，在室温下再搅拌1小时。随后用乙酸乙酯(40mL)和水(10mL)稀释，分出两层。用盐水洗涤有机相并经无水硫酸钠干燥和蒸发。用二氯甲烷和己烷的混合物洗涤固态残余物，得到呈白色固体的化合物29(1.28g，3.78mmol)。
步骤2式(31)的制备 在室温下，向氮气氛下的硫代氨甲酰脒(化合物29，122mg，0.363mmol)的四氢呋喃(1.5mL)溶液加入三乙胺(56μL)，随后加入2-溴苯乙酮(30，72mg，0.363mmol)。搅拌反应混合物5小时，随后用乙酸乙酯(20mL)稀释。用盐水洗涤得到的混合物并经无水硫酸钠干燥和蒸发，得到化合物31。
步骤3式(2-25)的制备 在氮气氛下，在回流温度下，加热甲苯(10mL)中的S-烷化化合物(化合物31，0.363mmol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU，54μL)的溶液2小时。将得到的化合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释(20mL)。随后用水和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，蒸发，经柱层析(乙酸乙酯/己烷＝2/3)纯化，得到呈白色固体的化合物2-25；(M+H)296。
实施例9式IIc化合物的合成(其中R1＝烷基、芳基或杂芳基；R3＝烷基、芳基或杂芳基) 式IIc方案9 式IIc步骤1式(IIc)的制备 通过在惰性溶剂中(例如CH3CN)溶解式(33)化合物和式(22)化合物并加入温热的叔丁醇中的叔丁醇钾，可以制备式(IIc)的化合物。搅拌30分钟之后，典型地在室温下，加入惰性溶剂(例如CH3CN)中的式(24)化合物。将得到的溶液在室温下搅拌或加热(典型地在80℃)3-10小时。用水淬灭反应，经过滤分离产物(Chong，W.et al.，WO9921845)。
实施例10化合物2-33(表2A)的合成 方案10 化合物(34)
步骤1化合物4-(4-氨基-5-苯甲酰基-噻唑-2-基氨基)-苯甲酸乙酯(化合物2-33，表2A)的制备 将氨腈(化合物33，0.0467g，1.1mmol)和4-乙氧基羰基苯基异硫氰酸酯(化合物35，0.211g，1.0mmol)溶解在乙腈(10.0mL)中，室温下搅拌。加入温热的叔丁醇(10.0mL)和乙腈(1mL)的混合物中的叔丁醇钾(0.130g，1.1mmol)溶液。室温下搅拌得到的溶液30分钟。室温下加入乙腈(2mL)中的2-溴苯乙酮(化合物30，0.203g，1.0mmol)，室温下搅拌得到的混合物2小时。用水(100mL)淬灭反应，过滤沉淀固体，用水和二乙醚洗涤。得到呈黄色固体的化合物2-33(298mg；M+H＝368.1)。
实施例11式III化合物的合成 如下制备式III的化合物向式(36)的胺的碱(例如吡啶)溶液中加入式(35)的磺酰氯，并在室温下搅拌，典型地持续16小时，随后通过标准程序操作，蒸发溶剂并纯化。
实施例125-(2-甲基硫烷基(methylsulfanyl)-嘧啶-4-基)-噻吩-2-磺酸喹啉-8-基酰胺(表3A中的化合物3-16)的合成。
将8-喹啉胺(化合物(38)，0.0998g，0.692mmol)和噻吩磺酰氯(0.212g，0.692mmol)溶解在吡啶(10.0mL，0.124mol)中。加入4-二甲氨基吡啶(0.010g，0.082mmol)，室温下搅拌得到的溶液过夜。去除所有溶剂，经biotage柱纯化产物，其中应用10-30％的乙酸乙酯己烷作为溶剂。得到呈黄色固体的纯化产物(M+1＝415.4)。
实施例13化合物1-29(表1A)的合成 4-氨基-5-(4-甲基-苯甲酰基)-2-苯氨基-噻吩-3-腈(化合物1-29，表1A)的制备 将丙二腈(0.661g，0.0100mol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(50mL，0.6mol)中，在氩气氛下搅拌。加入碳酸钾(1.52g，0.0110mol)并搅拌30分钟。加入异硫氰酸根合苯(1.49g，0.0110mol)，搅拌反应混合物2小时。加入2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮(2.34g，0.0110mol)，使反应混合物搅拌过夜。用150mL乙酸乙酯稀释得到的深红色溶液，用各自100mL的1/2饱和NaHCO3溶液、1N LiCl(2×)和1NNa2S2O3连续洗涤。弃去合并的水层，对有机层干燥、过滤和蒸发，收集1.46g所需产物，产物为淡黄色-橙色晶体。MS(ESI)[M+H+]+＝334.2。
实施例14化合物1-30(表1A)的合成 4-氨基-5-(苯甲酰基)-2-(2-甲氧基苯基)氨基-噻吩-3-腈(化合物1-30，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-(苯甲酰基)-2-(2-甲氧基苯基)氨基-噻吩-3-腈，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮分别替换成2-甲氧基苯基异硫氰酸酯和2-溴苯乙酮，得到化合物1-30。MS(ESI)[M+H+]+＝350.11。
实施例15化合物1-32(表1A)的合成
4-氨基-5-苯甲酰基-2-(4-甲氧基-苯氨基)-噻吩-3-腈(化合物1-32，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-苯甲酰基-2-(4-甲氧基-苯氨基)-噻吩-3-腈，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮分别替换成4-甲氧基苯基异硫氰酸酯和2-溴苯乙酮，得到化合物1-32。MS(ESI)[M+H+]+＝350.14。
实施例16化合物1-33(表1A)的合成 4-氨基-5-(3′-甲氧基苯甲酰基-2-苯氨基-噻吩-3-腈(化合物1-33，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-(3′-甲氧基苯甲酰基-2-苯氨基-噻吩-3-腈，其中将2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮替换成2-溴-1-(3-甲氧基苯基)-乙酮，得到化合物1-33。MS(ESI)[M+H+]+＝350.14。
实施例17化合物1-143(表1A)的合成 4-氨基-2-环戊基氨基-5-(3-苯基-异噁唑-5-羰基)-噻吩-3-腈(化合物1-143，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-2-环戊基氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮分别替换成环戊烷异硫氰酸酯和2-溴-1-(3-苯基-异唑-5-基)-乙酮，得到化合物1-143。MS(ESI)[M+H+]+＝378.99。
实施例18化合物1-28(表1A)的合成 4-氨基-5-环丙烷羰基-2-苯氨基-噻吩-3-腈，(化合物1-28，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-环丙烷羰基-2-苯氨基-噻吩-3-腈，其中将2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮替换成2-溴-1-环丙基-乙酮，得到化合物1-28。1H NMR(DMSO-d6)10.49(s，1H)，7.62(bs，2H)，7.45(s，4H)，7.24(m，1H)，1.79(m，1H)，0.87(m，2H)，0.82(m，2H)。
实施例19化合物1-173(表1A)的合成 4-氨基-5-((4-氯苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈，(化合物1-173，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-((4-氯苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮分别替换成环戊烷异硫氰酸酯和5-溴乙酰-3-(4-氯苯基)异唑，得到化合物1-173。MS(ESI)[M-H+]-＝411.0。
实施例20化合物1-172(表1A)的合成
4-氨基-5-((3，4-二氯苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈，(化合物1-173，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-((3，4-二氯苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮分别替换成环戊烷异硫氰酸酯和5-溴乙酰-3-(3，4-二氯苯基)异唑，得到化合物1-172。MS(ESI)[M+H+]+＝448.9。
实施例21化合物1-179(表1A)的合成 4-氨基-2-环戊基氨基-5-环丙烷羰基-噻吩-3-腈(化合物1-179，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-2-环戊基氨基-5-环丙烷羰基-噻吩-3-腈，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮分别替换成环戊烷异硫氰酸酯和2-溴-1-环丙基-乙酮，得到化合物1-179；MS(ESI)[M+H+]+276.13。
实施例22化合物1-192(表1A)的合成
4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-苯氨基-噻吩-3-腈(化合物1-192，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-苯氨基-噻吩-3-腈，其中将2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮替换成2-溴-1-(3-苯基-异唑-5-基)-乙酮，得到化合物1-192。MS(ESI)[M-H+]-＝385.05。
实施例23化合物P1的预示合成(prophetic synthesis) 3-[4-氨基-3-氰基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-2-基氨基]-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(化合物1-P1)的制备 如实施例13所述，可以制备3-[4-氨基-3-氰基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-2-基氨基]-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮分别替换成3-异硫氰酸根合-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯和2-溴-1-(3-苯基-异唑-5-基)-乙酮，得到化合物1-P1。
实施例24化合物1-P2的预示合成 4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈(化合物1-P2)的制备 4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈可以如下制备用强酸(例如三氟乙酸、硫酸、HCl和类似酸)处理3-[4-氨基-3-氰基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-2-基氨基]-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(化合物1-P1)，和使反应混合物接受含水处理(例如，用含水碱中和并用有机溶剂萃取产物)以便分离产物，化合物1-P2。
实施例25化合物1-P3的预示合成 4-氨基-2-(1-甲基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈(化合物1-P3)的制备 可以如下制备4-氨基-2-(1-甲基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈在碱性条件下，用甲基碘、硫酸二甲酯或合适的烷基化剂处理4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈(化合物1-P2)，和使反应混合物接受标准的含水操作(例如，加入水并用有机溶剂萃取产物)以便分离产物，化合物1-P3。
实施例26化合物1-P4的预示合成 4-氨基-2-(1-甲磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈(化合物1-P4)的制备 可以如下制备4-氨基-2-(1-甲磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈在碱性条件下，用甲磺酰氯处理4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈(化合物1-P2)，和使反应混合物接受标准的含水操作(例如，加入水并用有机溶剂萃取产物)以便分离产物，化合物1-P4。
实施例27化合物1-P5的预示合成
4-氨基-2-(1-乙磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈(化合物1-P5)的制备 可以如下制备4-氨基-2-(1-乙磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈在碱性条件下，用乙磺酰氯处理4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈(化合物1-P2)，和使反应混合物接受标准的含水操作(例如，加入水并用有机溶剂萃取产物)以便分离产物，化合物1-P5。
实施例28化合物1-P6的预示合成 4-氨基-2-(1-苯磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈(化合物1-P6)的制备 可以如下制备4-氨基-2-(1-苯磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-腈在碱性条件下，用苯磺酰氯处理4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈(化合物1-P2)，和使反应混合物接受标准含水操作(例如，加入水并用有机溶剂萃取产物)以便分离产物，化合物1-P6。
实施例29化合物1-251(表1A)的合成
4-氨基-5-[3-苯基异唑-5-羰基]-2-环戊基氨基噻吩-3-羧酸酰胺(化合物1-251，表1A)的制备 用浓硫酸(1mL，0.02mol)缓慢溶解4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈(化合物1-143)(40mg，0.0001mol)。室温下搅拌反应混合物45分钟。加入冰，用水(4mL)稀释混合物，随后加入饱和碳酸钾溶液以中和酸。用乙酸乙酯萃取产物，通过制备型TLC纯化，得到化合物1-251。MS(ESI)[M+H+]+＝397.2。
实施例30化合物1-236(表1A)的合成 4-氨基-5-[3-苯基异唑-5-羰基]-2-异丁氨基噻吩-3-羧酸酰胺(化合物1-236，表1A)的制备 如实施例29所述制备4-氨基-5-[3-苯基异唑-5-羰基]-2-异丁氨基噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-异丁氨基-噻吩-3-腈(化合物1-209，表1A)，得到化合物1-236。MS(ESI)[M+H+]+＝385.2。
实施例31化合物1-253(表1A)的合成
步骤14-氨基-5-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈(化合物1-220，表1A)的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-苯基氨基-噻吩-3-腈，其中将2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮替换成1-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-基]-2-溴-乙酮。
步骤24-氨基-5-[3-(4-氨基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈(化合物1-250，表1A)的制备 将4-氨基-5-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈(化合物1-220，20mg，0.05mmol)缓慢溶解在甲醇(3mL)中。加入钯(10％，在碳酸钙上)(5mg，0.02mmol)。使反应器充满氢气氛并搅拌过夜。过滤反应混合物，在减压下浓缩，得到化合物1-250，不需进一步纯化便可应用。
步骤34-氨基-5-[3-(4-氨基苯基)异唑-5-羰基]-2-环戊基氨基噻吩-3-羧酸胺(化合物1-253，表1A)的制备 应用与实施例29所述相同的方案制备4-氨基-5-[3-(4-氨基苯基)异唑-5-羰基]-2-环戊基氨基噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-(4-氨基-苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈(化合物1-250)，得到化合物1-253。MS(ESI)[M+H+]+＝412.41。
实施例32化合物1-254(表1A)的合成 步骤14-氨基-5-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-异丁氨基-噻吩-3-腈的制备 如实施例13所述制备4-氨基-5-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-异丁氨基-噻吩-3-腈，其中将异硫氰酸根合苯和2-溴-1-(4-甲基苯基)-乙酮替换成异硫氰酸异丁酯和1-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-基]-2-溴-乙酮。
步骤24-氨基-5-[3-(4-氨基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-异丁氨基-噻吩-3-腈的制备 如实施例31的步骤2所述制备4-氨基-5-[3-(4-氨基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-异丁氨基-噻吩-3-腈，其中将4-氨基-5-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-[3-(4-硝基-苯基)-异唑-5-羰基]-2-异丁氨基-噻吩-3-腈。
步骤34-氨基-5-[3-(4-氨基苯基)异唑-5-羰基]-2-异丁氨基噻吩-3-羧酸酰胺(化合物1-254，表1A)的制备 如实施例29所述制备4-氨基-5-[3-(4-氨基苯基)异唑-5-羰基]-2-异丁氨基噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-(4-氨基-苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-异丁氨基-噻吩-3-腈，得到化合物1-254。MS(ESI)[M+H+]+＝400.44。
实施例33化合物1-P7的预示合成 4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-羧酸酰胺的制备 可以如实施例29所述制备4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(苯-3-基)异唑-5-基)羰基-2-环戊基氨基-噻吩-3-腈替换为3-[4-氨基-3-氰基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-2-基氨基]-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(化合物1-P1)。
实施例34化合物1-P8的预示合成 4-氨基-2-(1-甲基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺的制备 可以如实施例25所述制备4-氨基-2-(1-甲基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-羧酸酰胺(化合物1-P7)。
实施例35化合物1-P9的预示合成 4-氨基-2-(1-甲磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺的制备 可以如实施例26所述制备4-氨基-2-(1-甲磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-羧酸酰胺(化合物1-P7)。
实施例36化合物1-P10的预示合成 4-氨基-2-(1-乙磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺的制备 用如实施例27所述的相同方案制备4-氨基-2-(1-乙磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-羧酸酰胺(化合物1-P7)。
实施例37化合物1-P11的预示合成 4-氨基-2-(1-苯磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺的制备 可以如实施例28所述制备4-氨基-2-(1-苯磺酰基-吡咯烷-3-基氨基)-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-噻吩-3-羧酸酰胺，其中将4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-腈替换为4-氨基-5-(3-苯基-异唑-5-羰基)-2-(吡咯烷-3-基氨基)-噻吩-3-羧酸酰胺(化合物1-P7)。
实施例38化合物2-30(表2A)的合成 2-(2，6-二氯苯基)氨基-4-氨基-5-苯甲酰基噻唑(化合物2-30，表2A)的制备 将氨腈(0.0701g，0.00165mol)和2，6-二氯苯基异硫氰酸酯(0.312g，0.00150mol)溶解在乙腈(15.0mL，0.287mol)中。在另一容器中，将叔丁醇钾(0.195g，0.00165mol)溶解在温的叔丁醇(15.0mL，0.157mol)中，将此容器的内容物加入第一容器中。室温下搅拌得到的溶液30分钟。加入2-溴苯乙酮(0.305g，0.00150mol)，搅拌得到的混合物2小时。加入100mL水，过滤出得到的固体。用水和二乙醚洗涤固体，得到呈黄色固体的化合物2-30。MS(ESI)[M+H+]+＝365.1。
实施例39化合物2-33(表2A)的合成
2-(4-乙氧基羰基苯基)氨基-4-氨基-5-苯甲酰基噻唑(化合物2-33，表2A)的制备 如实施例38所示制备2-(4-乙氧基羰基苯基)氨基-4-氨基-5-苯甲酰基噻唑，其中将2，6-二氯苯基异硫氰酸酯替换为4-乙氧基羰基苯基异硫氰酸酯，得到化合物2-33。MS(ESI)[M-H+]-＝366.1。
实施例40化合物2-1(表2A)的合成 5-[4-氨基-2-(2-氟-苯基)-噻唑-5-羰基]-异唑-3-羧酸乙酯(化合物2-1，表2A)的制备 如实施例38所述制备5-[4-氨基-2-(2-氟-苯氨基)-噻唑-5-羰基]-异唑-3-羧酸乙酯，其中将2，6-二氯苯基异硫氰酸酯和溴苯乙酮分别替换为2-氟苯基异硫氰酸酯和5-(2-溴-乙酰基)-异唑-3-羧酸乙酯，得到化合物2-1。MS(ESI)[M+H+]+＝377.1。
实施例41化合物2-9(表2A)的合成
(4-氨基-2-环戊基氨基-噻唑-5-基)-(3-苯基-异唑-5-基)-甲酮(化合物2-9)的制备 如实施例38所述制备(4-氨基-2-环戊基氨基-噻唑-5-基)-(3-苯基-异唑-5-基)-甲酮，其中将2，6-二氯苯基异硫氰酸酯和溴苯乙酮分别替换为异硫氰酸环戊酯和2-溴-1-(3-苯基-异唑-5-基)-乙酮，得到化合物2-9。MS(ESI)[M+H+]+＝355.1。
实施例42化合物2-16(表2A)的合成 4-氨基-2-异丁氨基-噻唑-5-基-[3-(4-氯苯基)-异唑-5-基)-甲酮(化合物2-16)的制备 如实施例38所述制备4-氨基-2-异丁氨基-噻唑-5-基-[3-(4-氯苯基)-异唑-5-基)-甲酮，其中将2，6-二氯苯基异硫氰酸酯和溴苯乙酮分别替换为异硫氰酸异丁酯和2-溴-1-(3-(4-氯苯基-异唑-5-基)-乙酮，得到化合物2-16。MS(ESI)[M+H+]+＝377.01。
实施例43化合物1-240(表1A)的合成
(3-氨基-5-环戊基氨基-4-甲基-噻吩-2-基)-(3-苯基-异唑-5-基)-甲酮(化合物1-240，表1A)的制备。
在氮气氛下，将lithium hexamethyldisilazidc(214mg，0.00124mol)溶解在5ml的四氢呋喃中。在-78摄氏度下，加入丙腈(0.0659g，0.00118mol)。30分钟之后，在-40摄氏度下加入异硫氰酸根合-环戊烷(0.164mL，0.00130mol)。1小时之后，使反应混合物温暖至室温并搅拌2小时。使反应混合物冷至-78摄氏度，加入四氢呋喃中的lithium hexamethyldisilazide(0.214g，0.00124mol)。30分钟之后，在-40摄氏度下加入2-溴-1-(3-苯基-异唑-5-基)-乙酮(0.378g，0.00142mol)。使得到的反应混合物逐渐温暖至室温，使其搅拌过夜。添加饱和NH4Cl溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥。在减压下浓缩反应混合物，经硅胶层析纯化，得到化合物1-240。MS(ESI)[M+H+]+＝368.1。
实施例44化合物1-243(表1A)的合成 [3-氨基-4-乙基-5-(4-苯氧基-苯氨基)-噻吩-2-基]-苯基-甲酮的制备 如实施例43所述制备[3-氨基-4-乙基-5-(4-苯氧基-苯氨基)-噻吩-2-基]-苯基-甲酮，其中将丙腈、异硫氰酸根合-环戊烷和2-溴-1-(3-苯基-异唑-5-基)-乙酮分别替换为丁腈、4-苯氧基苯基异硫氰酸酯和2-溴-1-苯基-乙酮，得到化合物1-243。MS(ESI)[M+H+]+＝415.0。
实施例454-(2-甲基硫烷基-喹唑啉-4-基氨基)-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺(化合物3-62，表3A)的合成
步骤14-溴-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺2的制备 向吡啶(5mL)中的4-溴苯磺酰氯(1.10g，4.32mmol)溶液中加入8-喹啉胺(1，623mg，4.32mmol)，于25℃搅拌反应混合物过夜。向反应混合物中加入乙酸乙酯，用饱和碳酸钠洗涤有机层(×3)，经硫酸镁干燥、过滤并在减压下浓缩，得到浅棕色的固体(2，1.57g，3.80mmol)。MS(ESI)[M+H+]+＝363.1；365.1(1∶1)。
步骤24-(2-甲基硫烷基-喹唑啉-4-基氨基)-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺3的制备 向1，4-二烷(2mL)中的4-溴-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺(2，111mg，0.307mmol)搅拌溶液中加入2-甲基硫烷基-喹唑啉-4-基-胺(165mg，0.863mmol)、碳酸铯(140mg，0.429mmol)、三(二亚卞基丙酮)二钯(0)(9.6mg，0.010mmol)和xanthphos(6.4mg，0.011mmol)。在高压管中加热反应混合物，温度是150℃，过夜，冷却并经Celite床过滤。向得到的过滤物中加入乙酸乙酯，用饱和碳酸钠洗涤溶液，经硫酸镁干燥，过滤，减压下浓缩。用制备型HPLC(5-95％乙腈∶水，带有1.5％甲酸)纯化粗产物，得到呈白色固体的化合物3-62(52mg，0.110mmol)。MS(ESI)[M+H+]+＝474.2。
实施例463-(2-甲基硫烷基-喹唑啉-4-基氨基)-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺(化合物3-63，表3A)的合成
应用如实施例45中所述的相同方案制备3-(2-甲基硫烷基-喹唑啉-4-基氨基)-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺4，其中将4-溴苯磺酰氯替换为3-溴苯磺酰氯；MS(ESI)[M+H+]+474.2。
实施例473-(嘧啶-4-基氨基)-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺(化合物3-61，表3A)的合成 应用如实施例45中所述的相同方案制备3-(嘧啶-4-基氨基)-N-喹啉-8-基-苯磺酰胺5，其中将4-溴苯磺酰氯替换为3-溴苯磺酰氯，并将2-甲基硫烷基-喹唑啉-4-基-酰胺替换为4-氨基嘧啶。MS(ESI)[M+H+]+＝378.0。
实施例48PDE4B磷酸二酯酶结构域的克隆 从人脑、海马QUICK-Clone cDNA文库(Clontech，#7169-1)经PCR扩增出PDE4B cDNA序列，应用下列引物PDE4B-S5’-CCGAATT CATATG AGCATCTCACGCTTTGGAGTC-3’(SEQ ID NO5)PDE4B-A5’-TGTGCT CTCGAG TTA GCTGTGTCCCTCTCCCTCC-3’(SEQ ID NO6) 随后通过位点定向诱变基因工程改造出内部NdeI位点，应用下列引物PDE4B-NDE15’-GATATGTCTAAACACATGAGCCTGCTGGC-3’(SEQ ID NO7)PDE4B-NDE2
5’-GCCAGCAGGCTCATGTGTTTAGACATATC-3’(SEQ ID NO8) 用NdeI和SalI消化得到的PCR片段并亚克隆入pET15S载体。
在此表达质粒中，PDE4B的残基152-528(NCBI序列JC1519，SEQ ID NO1)与N端组氨酸标签位于一个阅读框中，N端His-标签后是凝血酶切割位点。
具有多克隆位点的pET15S的序列，在图1中示出。
pET15S载体衍生自pET15b细菌表达载体(Novagen)，可以产生带有N端His6的蛋白质。通过将NdeI-BamHI片段替换为其它片段，产生SalI位点和终止密码子(TAG)来修饰此载体。载体长度是5814bp。可以利用NdeI-SalI位点进行插入。图2-3中提供了所应用的PDE4B磷酸二酯酶结构域的核酸序列和氨基酸序列。
实施例49PDE4B的纯化 PDE4B是从大肠杆菌(E.coli)细胞[BL21(DE3)Codon Plus(RIL)(Novagen)]纯化的，所述细胞在补充有0.2mM醋酸锌和1mM MgCl2的Terrific肉汤中生长，并用1mM IPTG于22℃诱导16-20小时。将经离心的细菌沉淀(典型地从16L中得到200-250g)悬浮在裂解液(0.1M磷酸钾缓冲液，pH 8.0，10％甘油，1mM PMSF)中。向裂解物中加入100ug/ml溶菌酶，使细胞在Cell Disruptor(MicroFluidics)中裂解。在Sorvall SA6000转子中以5000rpm离心1小时，使细胞提取物澄清，在SorvallSA600转子中以17000rpm再次对上清液离心1小时。向清澈的上清液中加入5mM咪唑(pH 8.0)，向每35ml提取物中加入2ml钴珠(50％浆体)。于4℃在Nutator上混合珠子3-4小时，以4000rpm离心3分钟回收珠子。用裂解液对沉淀的珠子洗涤数次，将珠子填充在BioRad一次性柱上。用3-4个柱体积的0.1M咪唑、随后用0.25M咪唑洗脱结合的蛋白质，所述咪唑都是在裂解液中制备的。在Centriprep-10膜(Amicon)上浓缩从钴珠洗脱的蛋白质，在Pharmacia Superdex 200柱(26/60)上分离，所述柱是在低盐缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，14mMβ-巯基乙醇)中。此时，用凝血酶室温下处理PDE蛋白16-20小时。在Pharmacia Source Q柱上(10/10)通过阴离子交换层析进一步纯化PDE蛋白，所述柱是在20mM Tris-HCl pH 8和14mMβ-巯基乙醇中，应用NaCl梯度，在AKTA-FPLC(Pharmacia)中进行。
实施例50PDE4B磷酸二酯酶结构域的结晶 应用Intelliplate(Robbins Scientific，Hampton)，通过混合1微升蛋白质和1微升沉淀剂，使PDE4B的晶体在30％PEG 400、0.2M MgCl2、0.1M Tris pH 8.5、1mM化合物(Cmpds)1-2、15.9mg/ml蛋白质中，在4℃下生长。在1.4收集数据。
此外，应用Intelliplate(Robbins Scientific，Hampton)，通过混合1微升蛋白质和1微升沉淀剂，使PDE4B的晶体在20％PEG 3000、0.2M Ca(OAc)2、0.1M TrispH 7.0、1mM化合物(Cmpds)1-2、15.9mg/ml蛋白质中，在4℃下生长。在1.7收集数据。
实施例51PDE4B的结构测定 用以前登记过的PDE4B坐标，应用分子置换法解析PDE4B的结构。表1提供了测定的PDE4B结构的原子坐标，表2、3和4中提供了共晶体结构的坐标，所述的所有的表是2004年5月6日提交的美国临时申请60/569435中的表，该申请以整体并入本文作为参考，用于所有目的。
而且，应用本文所述的结晶和晶体分析法，得到了多种化合物与PDE4B和/或PDE4D的共晶体和/或共晶体结构，如化合物(Cmpds)2-23、2-24、2-25、2-26、3-16、2-30、2-89、2-34、2-93、1-191、2-98、2-100、2-51、2-80、2-6、2-82、2-80、2-54、1-219、1-250、1-242、3-63和1-249，但不限于这些化合物；化合物的结构参见表3A、4A和5A。
实施例52PDE结合试验 可以用多种方法，包括本领域已知的许多方法进行结合试验。例如，如上所述，可以用荧光共振能量转移(FRET)方式或应用AlphaScreen进行结合试验。
可选地，能够测定配体与cAMP结合部位的结合的任何方法都可以被应用。例如，可以应用荧光配体。当与PDE4B结合时，发射的荧光被偏振。一旦被抑制剂结合替代，则偏振减少。
通过竞争性结合试验测定化合物的IC50。(注意KI是抑制剂结合的解离常数；KD是底物结合的解离常数)。对于本系统，IC50、抑制剂结合常数和底物结合常数根据下式可以发生关联 当使用放射性标记底物时KI=IC501+[L*]/KD,]]> 当存在小量的标记底物时，IC50约等于KI。
实施例53PDE活性测定 作为示例性磷酸二酯酶测定，以下面的分析方式测定PDE4B、PDE5A和其它PDEs的磷酸二酯酶活性的潜在调节剂的效应试剂测定缓冲液50mM Tris，7.58.3mM MgCl21.7mM EGTA0.01％BSA
于4度保存RNA结合YSi SPA珠子珠子是100mg/ml，在水中。用1M醋酸锌/ZnSO4溶液(3∶1)和水稀释为5mg/ml，18mM Zn。4度保存。
低对照化合物 20×DMSO贮存液的浓度PDE1B8-甲氧基甲基IBMX 20mMPDE2AEHNA 10mMPDE3B米力农(Milrinone) 2mMPDE4D洛利普南(Rolipram) 10mMPDE5A扎普司特(Zaprinast)10mMPDE7BIBMX 40mMPDE10A双嘧达莫(Dipyridamole)4mM酶浓度(2×终浓度，在测定缓冲液中稀释)PDE1B 50ng/mlPDE2A 50ng/mlPDE3B 10ng/mlPDE4D 5ng/mlPDE5A 20ng/mlPDE7B 25ng/mlPDE10A 5ng/ml)放射性配体[3H]cAMP(Amersham TRK559)。在测定缓冲液中稀释2000×。
cGMP(Amersham TRK392)。仅用于PDE5A测定。在测定缓冲液中稀释2000×。
方案用BiomekFx将1μl化合物转移到384孔板，由2mM、96孔母板制备测定平板。化合物的终浓度将是～100μM。从每一母板制备两个测定平板，因而化合物被测定两次。
向测定平板的第23列中加入1μl的合适对照化合物的20×DMSO贮存液。这些将是低对照(low control)。
Chembridge文库测定平板的1和2列以及Maybridge文库测定平板的21和22列有1μl DMSO。这些是高对照(high control)。
应用BiomekFx，将10μl放射性配体吸入每一测定孔中，随后，应用相同的吸头，将10μl酶吸入每一孔中。
用透明的覆盖物密封测定平板，以1000RPM短暂离心，随后在平板振荡器上混合10秒钟。
于30℃温育30分钟。
应用BiomekFx，向每一测定孔中加入10μl珠子混合物。在向每一测定板加入珠子之前，即刻在贮器中充分混合珠子。
用新的透明覆盖物再次密封平板。在平板振荡器上混合10秒钟，随后以1000RPM离心1分钟。
将平板置于计数架中。使之静置≥30分钟，随后用程序8在Wallac TriLux上计数。
分析数据为酶活性的抑制百分数。高对照的平均值＝0％抑制。低对照的平均值＝100％抑制。
实施例54PDE4 IC50测定 用闪烁亲近测定法(SPA)测定IC50。该测定的原理是基于PDE4底物cAMP与硅酸钇(Yittrium Silicate)SPA珠子微弱结合，而PDE4水解产物AMP与所述珠子强结合的事实。因此，可以测定[3H]cAMP样品的PDE4水解程度，原因是仅仅PDE4水解产生的[3H]AMP会结合到SPA珠子并产生闪烁信号。
用于IC50测定的PDE4酶是 PDE4B人PDE4B的催化结构域，从S152-S528，带有N端His6标签和凝血酶切割位点，在大肠杆菌中表达并经金属离子亲和层析纯化。酶在-20℃保存在50％甘油中。
PDE4D人PDE4D的催化结构域，从S316-V692，带有N端His6标签和凝血酶切割位点，在大肠杆菌中表达并经金属离子亲和层析纯化。酶在-20℃保存在50％甘油中。
PDE4B2全长人PDE4B2同工酶，带有N端His6标签和TEV切割位点，在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。该酶未从细胞裂解物中纯化，因而未测定酶浓度。将酶在-20℃保存在50％甘油中。
PDE4D5全长人PDE4D5同工酶，带有N端His6标签和TEV切割位点，在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。该酶未从细胞裂解物中纯化，因而未测定酶浓度。将酶在-20℃保存在50％甘油中。
IC50测定步骤 根据化合物的效价，将测试化合物(化合物和结果参见表3B、4B和5A)从4mM或40μM的起始浓度在DMSO中连续3倍稀释11次。将每一稀释物1μl转移到白色聚苯乙烯384孔测定平板中的双孔中(Corning #3705)。除了化合物稀释物，每一测定平板还含有对照孔，其具有1μl的DMSO(定义了0％酶抑制)或1μl的200μM罗氟司特(roflumilast)(定义了100％酶抑制)。应用Beckman FX自动仪器，将10μl的测定缓冲液(50mM Tris，pH 7.5；8.3mM MgCl；1.7mM EGTA；0.01％BSA)中的2mCi/ml的[3H]cAMP(Amersham TRK559)转移到每一测定孔中。随后，加入测定缓冲液中的PDE4酶10μl，以1000rpm振荡平板30秒钟，起始cAMP水解反应。应用的酶浓度是PDE4B，80ng/ml；PDE4D，4ng/ml；PDE4B2，2.5μl的50％甘油贮存液/ml；PDE4D5 0.083μl的50％甘油贮存液/ml。覆盖测定平板并于30℃温育30分钟。自动加入18mM ZnSO4中的10μl的5mg/ml SPA珠子(Amersham RPNQ0013)，终止反应。用透明塑料膜覆盖测定平板，以1000RPM离心1分钟以沉淀SPA珠子，用Wallac TriLux闪烁计数器进行计数。应用来自MDL的Assay Explorer软件包，通过非线性回归曲线拟合，从测定的原始数据计算出IC50。
实施例55在全血培养物中通过LPS刺激产生的TNFα 测定化合物，获得如实施例54所述的IC50数，其中应用下列测定方案(化合物和结果参见表3B和4B)。
方案1)获得所需浓度化合物的20mM DMSO等分试样(测定化合物和结果参见表3B和4B)。将2μl/孔的DMSO中的化合物置于稀释平板的顶行。加入98μl的RPMI1640培养基w/2.5％热失活的FBS。
2)制备其中含有2％DMSO的相同培养基。向孔中加入60μl/孔，进行化合物滴定。吸取顶行30μl，沿平板进行1∶3稀释。在11列加入4个孔的50μM罗氟司特和吡拉米特(piclamilast)。在12列加入2％DMSO培养基。
3)向测定平板中转移20μl/孔，制作双份。
4)得到人Buffy层。
5)用7个体积的RPMI 1640培养基稀释血液(1∶8稀释)，所述培养基带有1％P/S和2.5％热失活FBS。
6)向测定平板中加入经稀释的血液，160μl/孔。
7)于37℃、5％CO2中温育1小时。
8)稀释LPS(其已经在PBS中稀释为1mg/ml，20μl等分试样冷冻在-20℃)至10×所需终浓度，以得到1000倍的稀释(终浓度将是100ng/ml)。
9)在1小时的温育之后向平板加入LPS，20μl/孔。也制备了无LPS处理的背景。样品以900rpm放置在振荡器中1分钟。
10)在恒温箱中温育4小时。
11)温育之后，以900rpm放置在振荡器中1分钟并以100g旋转平板10分钟，Decel 5。
12)小心吸取顶部的75μl上清液进入新的平板。按需要冷冻样品。
Biosource hu-TNFαELISA应用的试剂DPBS 10×VWR 45000-428(用Millipore水稀释1∶10)吐温20(TWEEN 20)FISHER BP337-500捕获和检测抗体(CAPTURE AND DETECTION ANTIBODIES)R&D DY510ESTREP-HRPBiosource part SNN4004X显色试剂(COLOR REAGENTS)R&D DY994终止液(STOP SOLUTION)来自chemistry或R&D DY9991)按需要解冻样品至室温。
2)加入50μl温育缓冲液/孔。
3)加入50μl血液样品+50μl稀释缓冲液。
4)室温温育2小时。
5)用300μl/孔洗涤缓冲液洗涤平板4次，使用microfill。洗涤缓冲液是带有0.05％Tween pH 7.2-7.4的DPBS。
6)加入100μl生物素化抗TNFα。
7)室温温育1小时。
8)用300μl/孔洗涤缓冲液洗涤平板4次，使用microfill。洗涤缓冲液是带有0.05％Tween pH 7.2-7.4的DPBS。
9)加入100μl链霉抗生物素-HRP工作液。
10)室温温育30分钟。
11)用300μl/孔洗涤缓冲液洗涤平板4次，使用microfill。洗涤缓冲液是带有0.05％Tween pH 7.2-7.4的DPBS。
12)加入100μl显色原(Chromagen)。
13)暗处温育30分钟，直至蓝色令人满意地产生。
14)加入终止液(2N H2SO4)，100μl/孔。
15)在WallacVictor上450nm处读取平板，0.1秒/孔。
实施例56大鼠抑制研究 所有的研究都是用雄性大鼠CD(SD)IGS BR(Crl)(Charles River，France)进行的，对其按每组5个动物分组。化合物剂量在表3B和4B中指明，剂量是100mg/kg口服，如果表中没有另外指明。
在适应期末期，对未禁食大鼠称重，在尾部用永久性标记分别加以标记并经口(po)或腹膜内(ip)途径施用载体(vehicle)、参照化合物或测试化合物，体积是根据体重的10mL/kg。使动物以每组5只聚集在带有锯末覆盖底面的聚苯乙烯标记笼子中。载体、参照化合物或测试化合物施用后2小时，大鼠接受0.1mg/kg LPS静脉内(iv)注射，体积是1mL/kg体重。LPS激发后2小时(或者如表3B和4B所示)，在气体(异氟烷)麻醉下，通过球后穿刺将血液样品收集到未加抗凝剂的管中。使样品室温下凝结5至10分钟，随后放置在冰上，直至对其离心制备(6000×g，3分钟，4℃)，保存在-20℃直到应用。根据制造商的步骤(Rat TNFαkit Quantikine M(RTA00，R&D System，France))，用ELISA技术测定血清样品中的TNFα水平，测定两次。数据报告为观察到的TNFα水平相对于对给予载体动物组观察到的TNFα水平降低的百分数。
实施例57PDE4B的定点诱变 如Molecular BiologyCurrent Innovations and Future Trends.Eds.A.M.Griffin and H.G.Griffin.(1995)ISBN 1-898486-01-8，Horizon Scientific Press，PO Box1，Wymondham，Norfolk，U.K.等中所述，按照下列步骤，可以对PDE4B进行诱变。
体外定点诱变是研究蛋白质结构-功能关联、基因表达和载体修饰的非常有价值的技术。几种方法已经在文献中出现，但是这些方法中的许多需要用单链DNA作为模板。从历史上而言，其原因在于需要分离互补链以防止退火。通过应用变性步骤分离互补链并使得PCR引物有效聚合，PCR在定点诱变中的应用实现了链分离。因而，PCR定点方法使得位点特异性突变能够掺入到实质上任何双链质粒；排除了对M13型载体或单链拯救(single strand rescue)的需求。
在进行基于PCR的定点诱变时，通常期望减少PCR中的循环数，以便防止任何(不期望的)第二位点突变的克隆扩充。增加模板起始浓度，弥补了会导致产量降低的受限的循环数。应用选择，以减少进入反应的亲代分子数目。另外，为了应用单一PCR引物组，需要优化长PCR方法。进一步地，由于一些热稳定聚合酶的延伸酶(extendase)活性，常常需要在PCR所生成的产物的端-端连接之前在程序中并入末端削齐(end-polishing)步骤，其中PCR所生成的产物含有在一个或两个PCR引物中掺入的突变。
通过并入如下步骤，下列方案提供了定点诱变的容易方法并且实现了上述期望的特性(i)使模板浓度比传统的PCR条件增加约1000倍；(ii)使循环数从25-30降低到5-10；(iii)加入限制性内切核酸酶DpnI(识别目标序列5-Gm6ATC-3，其中A残基被甲基化)，以便针对亲代DNA进行选择(注意分离自几乎所有大肠杆菌普通菌株的DNA的序列5-GATC-3被Dam-甲基化)；(iv)在PCR混合物中应用Taq Extender，使PCR的可靠性增加至10kb；(v)应用Pfu DNA聚合酶使PCR产物的末端平齐，和(vi)在T4 DNA连接酶存在的情况下，实现有效的分子内连接。
将质粒模板DNA(大约0.5皮摩)加入PCR混合物中，所述混合物包含，在25μl的1×诱变缓冲液中(20mM Tris HCl，pH 7.5；8mM MgCl2；40μg/ml BSA)；每种引物12-20皮摩(其中的一种必须含有5’磷酸)；每种dNTP 250μM，2.5U TaqDNA聚合酶，2.5U的Taq Extender(Stratagene)。
PCR循环参数是，94℃4分钟、50℃2分钟和72℃2分钟，1个循环；随后是94℃1分钟、54℃2分钟和72℃1分钟，5-10个循环(步骤1)。
用DpnI(10U)和Pfu DNA聚合酶(2.5U)处理亲代模板DNA和整入新合成DNA的线性诱变引物。这引起体内甲基化亲代模板和杂合DNA的DpnI消化，以及Pfu DNA聚合酶对线性PCR产物上的Taq DNA聚合酶延伸的碱基的去除。
反应物在37℃温育30分钟，随后转移到72℃温育另外30分钟(步骤2)。
将诱变缓冲液(1×，115μl，含有0.5mM ATP)加入经DpnI消化的Pfu DNA聚合酶削齐的PCR产物中。
混合溶液，将10μl转移到新的微量离心管中，加入T4 DNA连接酶(2-4U)。
37℃温育连接反应60分钟以上(步骤3)。
将处理过的溶液转化进感受态大肠杆菌中(步骤4)。
除了上述基于PCR的定点诱变，可以利用其它方法。例子包括Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82488-492；Eckstein et al.(1985)Nucl.Acids Res.138764-8785中描述的那些；以及应用来自Promega的GeneEditorTMSite-Directed MutageneisSystem。
表1A式I的示范性化合物



























































表1B式I化合物编号和数据对于大鼠体内抑制试验，+＝＞20％，-＝＜20％，空白＝未测定如果没有另外指明，则为100mg/kg口服，2小时延迟激发(challenge delay)














表3C式I的其它化合物


表2A式II的化合物




















表2B式II活性数据r TNF是大鼠体内数据，抑制试验，+＝＞20％，-＝＜20％，空白＝未测定

对于抑制试验，+＝＞20％，-＝＜20％，空白＝未测定100mg/kg口服，如果没有另外指明，2小时延迟激发




表3A式III化合物，名称和活性数据




















表3B式III的其它磺酰胺化合物
本说明书中提及的所有专利和其它参考文献指出了本发明所属领域的技术人员的水平，并且以整体并入本文作为参考，包括所有的表和图，并入的程度如同每一参考文献单独地以整体并入本文作为参考。
本领域的技术人员应当很容易意识到本发明很适合于获得所提到的结果和优势，以及其中所固有的结果和优势。目前，此处所述的方法、变化和组合代表了优选实施方案，是示范性的，不意图于成为对本发明范围的限制。本领域的技术人员将实施其中的变化和其它应用，这处于本发明的精神下，如权利要求书的范围所限定。
对于本领域的技术人员来说，应当很容易意识到在不背离本发明范围和精神的情况下，可对此处公开的本发明做出替代和修改。例如，可以改变PDE4B蛋白的结晶或共结晶条件和/或可以应用各种磷酸二酯酶结构域序列。因此，这样的额外实施方案也在本发明和下面的权利要求书的范围之内。
本文中适当地例证性地描述的发明可以在缺少本文未具体公开的任一元素或许多元素、限定或许多限定的情况下被实施。已使用的术语和表述是作为描述性术语而不是限定性的，并且不意图于在使用这些术语和表述时排除显示和描述的特征或其部分的等同物，而是认识到在要求保护的发明范围内各种修改是可能的。因此，应该理解，尽管本发明通过优选的实施方案和可选的特征被具体地公开，但本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变化，而这些修改和变化被认为包含在本发明的范围之内，如所附权利要求所限定的。
此外，当本发明的特征和方面针对马库什组或其它选择组而描述时，本领域技术人员将会知道，本发明因而也针对该马库什组或其它组的单独成员或亚组成员而描述。
同时，如果没有另外指明，对实施方案给出各个数值时，通过采用两个不同值作为范围的端点，描述了其它实施方案。这样的范围也包含在所描述的发明的范围内。
因此，其它实施方案包含在本发明范围内和权利要求书的范围内。
序列表SEQ ID NO1GenBank多肽序列JC1519SEQ ID NO2NP_002591的S324至S700SEQ ID NO3AAB96381的S309至S685SEQ ID NO4AAA35643的S194至S570SEQ ID NO55’-CCGAATT CATATG AGCATCTCACGCTTTGGAGTC-3’SEQ ID NO65’-TGTGCT CTCGAG TTA GCTGTGTCCCTCTCCCTCC-3’SEQ ID NO75’-GATATGTCTAAACACATGAGCCTGCTGGC-3’SEQ ID NO8-GCCAGCAGGCTCATGTGTTTAGACATATC-3’SEQ ID NO9AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGATCCGGAATTCAAAGGCCTACGTCGACTAGAGCCTGCAGTCTCGACCATCATCATCATCATCATTAATAAAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGSEQ ID NO10ag catctcacgc tttggagtca acactgaaaa tgaagatcac1261 ctggccaagg agctggaaga cctgaacaaa tggggtctta acatctttaa tgtggctgga1321 tattctcaca atagacccct aacatgcatc atgtatgcta tattccagga aagagacctc1381 ctaaagacat tcagaatctc atctgacaca tttataacct acatgatgac tttagaagac1441 cattaccatt ctgacgtggc atatcacaac agcctgcacg ctgctgatgt agcccagtcg1501 acccatgttc tcctttctac accagcatta gacgctgtct tcacagattt ggaaatcctg1561 gctgccattt ttgcagctgc catccatgac gttgatcatc ctggagtctc caatcagttt1621 ctcatcaaca caaattcaga acttgctttg atgtataatg atgaatctgt gttggaaaat1681 catcaccttg ctgtgggttt caaactgctg caagaagaac actgtgacat cttcatgaat1741 ctcaccaaga agcagcgtca gacactcagg aagatggtta ttgacatggt gttagcaact1801 gatatgtcta aacacatgag cctgctggca gacctgaaga caatggtaga aacgaagaaa1861 gttacaagtt caggcgttct tctcctagac aactataccg atcgcattca ggtccttcgc
1921 aacatggtac actgtgcaga cctgagcaac cccaccaagt ccttggaatt gtatcggcaa1981 tggacagacc gcatcatgga ggaatttttc cagcagggag acaaagagcg ggagagggga2041 atggaaatta gcccaatgtg tgataaacac acagcttctg tggaaaaatc ccaggttggt2101 ttcatcgact acattgtcca tccattgtgg gagacatggg cagatttggt acagcctgat2161 gctcaggaca ttctcgatac Cttagaagat aacaggaact ggtatcagag catgatacct2221 caaagtccct caccaccact ggacgagcag aacagggact gccagggtct gatggagaag2281 tttcagtttg aactgactct cgatgaggaa gattctgaag gacctgagaa ggagggagag2341 ggacacagct aa
SEQ ID NO11MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSISRFGVNT ENEDHLAKEL EDLNKWGLNI FNVAGYSHNRPLTCIMYAIF QERDLLKTFR ISSDTFITYM MTLEDHYHSD VAYHNSLHAA DVAQSTHVLLSTPALDAVFT DLEILAAIFA AAIHDVDHPG VSNQFLINTN SELALMYNDE SVLENHHLAVGFKLLQEEHC DIFMNLTKKQ RQTLRKMVID MVLATDMSKH MSLLADLKTM VETKKVTSSGVLLLDNYTDR IQVLRNMVHC ADLSNPTKSL ELYRQWTDRI MEEFFQQGDK ERERGMEISPMCDKHTASVE KSQVGFIDYI VHPLWETWAD LVQPDAQDIL DTLEDNRNWY QSMIPQSPSPPLDEQNRDCQ GLMEKFQFEL TLDEEDSEGP EKEGEGHSSEQ ID NO12图4中的PDB4B氨基酸序列SEQ ID NO13图4中的PDB4D氨基酸序列SEQ ID NO14PDB4ASEQ ID NO15PDB4C
权利要求
1.化合物，具有下列化学结构 式I其中X选自O、S和NR7；R1、R2、R4、R5、R7、R9和R10独立地选自氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，然而，条件是R1和R2、或R4和R5、或R9和R10、或R2和R3可以结合形成任选取代的杂环；R3选自氰基、硝基、-C(Z)R8、S(O2)NR9R10、-S(O2)R11和任选取代的低碳烷基；Y和Z独立地选自O和S；R6和R8选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基和任选取代的杂环；和R11独立地选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；和它们的盐、前体药物和异构体。
2.权利要求1的化合物，其中R6是取代的单环杂环，其中R6的至少一个取代基包括选自任选取代的芳基和任选取代的杂芳基的取代基。
3.权利要求1的化合物，具有下列结构 其中R3选自氰基、硝基、-C(Z)R8、S(O2)NR9R10、-S(O2)R11和任选取代的低碳烷基；Z独立地选自O和S；R1、R2、R4、R5、R7、R9和R10独立地选自氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，然而，条件是R1和R2、或R4和R5、或R9和R10、或R2和R3可以结合形成任选取代的杂环；R8选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基和任选取代的杂环；R11独立地选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R6是 Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自-O-、-S-、-CR6a-、-CR6b-、-CR6c-和-NR6d-，其中Z1、Z2、Z3和Z4中的至少一个是杂原子；和Z1、Z2、Z3和Z4被选择以产生稳定的化合物；R6a、R6b和R6c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物；或R6a、R6b和R6c可与包括Z1、Z2、Z3和Z4的五元环结合形成任选取代的稠合杂环系统；R6d任选存在，当其存在时，其选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基；然而，条件是当R6是噻吩-2-基时，则R1和R2不选自苯基、低碳烷基和低碳烯基；当R6是呋喃-2-基时，则R1和R2不选自任选取代的苯基和任选取代的苯基烷基；和当R1或R2是呋喃-2-基-亚甲基或呋喃-2-基-亚乙基时，则R6不是任选取代的苯基。
4.权利要求3的化合物，其中R1选自任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、酰基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；和R2、R4和R5是氢。
5.权利要求1的化合物，其中X选自O、S和NR7；Y和Z独立地选自O和S；R3选自氰基、硝基、-C(Z)R8、S(O2)NR9R10、-S(O2)R11和任选取代的低碳烷基；R1、R2、R4、R5、R7、R9和R10独立地选自氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，然而，条件是R1和R2、或R4和R5、或R9和R10、或R2和R3可以结合形成任选取代的杂环；R8选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基和任选取代的杂环；R11独立地选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R6选自 R6a、R6b和R6c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物；和R6d选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基；然而，条件是当R6是噻吩-2-基时，则R6a不是氢或卤素。
6.权利要求5的化合物，其中X选自O、S和NR7；Y和Z独立地选自O和S；R3选自氰基、硝基、-C(Z)R8、S(O2)NR9R10、-S(O2)R11和任选取代的低碳烷基；R1、R2、R4、R5、R7、R9和R10独立地选自氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，然而，条件是R1和R2、或R4和R5、或R9和R10、或R2和R3可以结合形成任选取代的杂环；R8选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基和任选取代的杂环；R11独立地选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R6选自 R6a和R6b独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物，然而，条件是当R6是噻吩-2-基时，则R6a不是氢或卤素。
7.权利要求1的化合物，其中R1和R2中的至少一个选自任选取代的环烷基、任选取代的杂环和任选取代的杂环烷基。
8.权利要求1的化合物，具有下列结构 其中R1选自氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R3选自氰基、硝基、-C(Z)R8、-S(O2)NR9R10、-S(O2)R11和任选取代的低碳烷基；和R6a选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物。
9.化合物，具有下列化学结构 式II其中X选自O、S和NR15；R12选自氢、-OR16、-SR16、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R13选自-OR16、-SR16和任选取代的胺；R14选自-OR16、-SR16、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基、-C(Z)R19、-C(Z)NR20R21、-S(O2)NR20R21和-S(O2)R22；R15选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基、-C(Z)R19、-C(Z)NR20R21、-S(O2)NR20R21和-S(O2)R22；R16选自任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基和-C(Z)R19；Z选自O和S；R19选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R20和R21独立地选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，或者R20和R21结合形成5-7元碳环或杂环；和R22选自羟基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；和它们的盐、前体药物和异构体。
10.权利要求9的化合物，具有下列结构 其中Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自-O-、-S-、-CR19a-、-CR19b-、-CR19c-和-NR19d-，其中Z1、Z2、Z3和Z4中的至少一个是杂原子；和Z1、Z2、Z3和Z4被选择以产生稳定的化合物；R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基，然而条件是磺酰胺不可以取代芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基；和R19a、R19b和R19c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物；其中R19a、R19b和R19c中的至少一个是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或羧基；或R19a、R19b和R19c与包括Z1、Z2、Z3和Z4的五元环结合形成任选取代的稠合杂环系统；和R19d任选地存在，当其存在时，其选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基。
11.权利要求9的化合物，具有下列结构 其中Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自-O-、-S-、-CR19a-、-CR19b-、-CR19c-和-NR19d-，其中Z1、Z2、Z3和Z4中的至少一个是杂原子；和Z1、Z2、Z3和Z4被选择以产生稳定的化合物；R12a选自任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基，其中所述芳基不可以取代有酰基、胺和磺酰胺基；R19a、R19b和R19c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物；或R19a、R19b和R19c与包括Z1、Z2、Z3和Z4的五元环结合形成任选取代的稠合杂环系统；和R19d任选存在，当其存在时，其选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基。
12.权利要求9的化合物，具有下列结构 其中R19选自 R19a、R19b和R19c独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物；和R19d任选存在，当其存在时，其选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基。
13.权利要求12的化合物，具有下列结构 其中R19选自 R19a独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物；R19b选自氢和低碳烷基；和R19d任选存在，当其存在时，其为氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基和亚磺酰氨基。
14.权利要求9的化合物，其中R14是C(O)R19；R19是任选取代的环烷基；和R12选自任选取代的芳基胺、任选取代的杂芳基胺和任选取代的环烷基，然而，条件是当R12是苯胺时，R19不是环丙基。
15.权利要求9的化合物，其中R14是C(O)R19；R19是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任选取代的环烷基；和R12是任选取代的环烷基胺，其中当R12是环己胺时，则R19不是任选取代的苯基。
16.化合物，具有下列结构 其中R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基；和R19a选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基磺酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物。
17.权利要求16的化合物，具有下列结构 其中R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基；和R19a选自烷氧基、氨基、羧基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。
18.权利要求16的化合物，具有下列结构 其中R12a选自任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基和任选取代的芳基；和R19a选自烷氧基、氨基、羧基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。
19.权利要求16的化合物，具有下列结构 其中R12a选自低碳烷基、环烷基和任选取代的芳基；和R19a选自烷氧基、氨基、羧基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。
20.权利要求9的化合物，具有下列结构 其中R12a选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基，然而条件是磺酰胺不可以取代芳基、任选取代的杂芳基、酰基和磺酰基。
21.权利要求9的化合物，具有下列结构 其中R12a是任选取代的芳基。
22.权利要求9的化合物，具有下列结构 其中R12a是任选取代的苯基。
23.化合物，具有下列化学结构 式III其中R23选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；或者R23与R26、(R25)m或R26和(R25)m二者结合形成5-7元任选取代的碳环系统或任选取代的杂环系统；R24选自任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；然而，条件是，如果R24是取代的芳基，则所述芳基取代不是取代的异丙基；如果R24是任选取代的低碳烯基，则R24中的任何双键与R24与之结合的磺酰基S隔开至少两个键；和如果R24是任选取代的低碳炔基，则R24中的任何三键与R24与之结合的磺酰基S隔开至少两个键；R25如果存在，其为任选取代的低碳亚烷基；R26是具有3-14个环原子的任选取代的碳环结构或任选取代的杂环结构，其中当R26是芳基时，则对R26的取代，如果存在的话，不是取代的异丙基；m是0-3；和它们的盐、前体药物和异构体。
24.权利要求23的化合物，具有下列结构 其中R26a、R26b、R26c、R26d、R26e和R26f独立地选自氢、卤素、低碳烷基和烷氧基。
25.权利要求24的化合物，其中R24选自任选取代有任选取代的杂环烷基的芳基、任选取代的芳氨基、任选取代的杂芳氨基、任选取代的芳基磺酰基和-RNHC(O)R’，其中R是亚烷基，和R’是任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；或R24是任选取代的杂芳基，然而，条件是R24不是四唑或三唑并嘧啶环。
26.权利要求23的化合物，具有下列结构 其中n是0或1；和Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地选自-O-、-S-、-CR24a-、-CR24b-、-CR24c-、-CR24d-和-NR24e-，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5被选择以形成稳定的化合物；R24a、R24b、R24c和R24d独立地选自氢；卤素；羟基；烷氧基；烷硫基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；酰氧基；任选取代的芳基；氨基；酰氨基；脒基；任选取代有烷基、芳基、杂芳基或杂环基的脲；任选地N-单取代或N，N-双取代有烷基、芳基或杂芳基的氨基碳酰基；烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基磺酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基；羧基；任选取代的杂环；任选取代的杂芳基；硝基；氰基；硫醇；亚磺酰氨基；任选取代的烷基；任选取代的烯基；和任选取代的炔基；它们在任意可及部位连接产生稳定的化合物；和R24e任选地存在，当其存在时，其为氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环、任选取代的杂芳基、酰基、磺酰基、酰氨基、硫代酰氨基或亚磺酰氨基。
27.组合物，包括根据权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
28.组合物，包括根据权利要求9的化合物和药学上可接受的载体。
29.组合物，包括根据权利要求23的化合物和药学上可接受的载体。
30.治疗患有疾病或状态或处于疾病或状态的风险之中的人类患者的方法，PDE4B调节对所述疾病或状态提供了治疗益处，所述方法包括向所述患者施用有效量的PDE4B调节剂，所述调节剂具有化学结构 式I其中X选自O、S和NR7；R1、R2、R4、R5、R7、R9和R10独立地选自氢、酰基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，然而，条件是R1和R2、或R4和R5、或R9和R10、或R2和R3可以结合形成任选取代的杂环；R3选自氰基、硝基、-C(Z)R8、S(O2)NR9R10、-S(O2)R11和任选取代的低碳烷基；Y和Z独立地选自O和S；R6和R8选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基和任选取代的杂环；和R11独立地选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基。
31.权利要求30的方法，其中所述疾病或状态是PDE4B介导的疾病或状态。
32.权利要求31的方法，其中所述疾病或状态选自哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管炎、过敏性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、先天性肺纤维化、结节病、肺动脉高压、阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿舞蹈病、多发性硬化、类风湿性关节炎、Crohn氏病、脑缺血、炎性肠病、溃疡性结肠炎、骨质疏松症、骨硬化病、佩吉特病、弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、严重急性呼吸综合征和早产。
33.治疗患有疾病或状态或处于疾病或状态的风险之中的人类患者的方法，PDE4B调节对所述疾病或状态提供了治疗益处，所述方法包括向所述患者施用有效量的PDE4B调节剂，所述调节剂具有化学结构 式II其中X选自S、O和NR15；R12选自氢、-OR16、-SR16、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R13选自-OR16、-SR16和任选取代的胺；R14选自-OR16、-SR16、任选取代的胺、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基、-C(Z)R19、-C(Z)NR20R21、-S(O2)NR20R21和-S(O2)R22；R15选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基、-C(Z)R19、-C(Z)NR20R21、-S(O2)NR20R21和-S(O2)R22；R16选自任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳烷基和-C(Z)R19；Z选自O和S；R19选自羟基、烷氧基、硫代烷氧基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；R20和R21独立地选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基，或者R20和R21可以结合形成5-7元碳环或杂环；和R22选自羟基、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基。
34.权利要求33的方法，其中所述疾病或状态是PDE4B介导的疾病或状态。
35.权利要求34的方法，其中所述疾病或状态选自哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管炎、过敏性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、先天性肺纤维化、结节病、肺动脉高压、阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿舞蹈病、多发性硬化、类风湿性关节炎、Crohn氏病、脑缺血、炎性肠病、溃疡性结肠炎、骨质疏松症、骨硬化病、佩吉特病、弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、严重急性呼吸综合征和早产。
36.治疗患有疾病或状态或处于疾病或状态的风险之中的人类患者的方法，PDE4B调节对所述疾病或状态提供了治疗益处，所述方法包括向所述患者施用有效量的PDE4B调节剂，所述调节剂具有化学结构 式III其中R23选自氢、任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；或者R23可以与R26、(R25)m或R26和(R25)m二者结合形成5-7元任选取代的碳环系统或任选取代的杂环系统；R24选自任选取代的低碳烷基、任选取代的低碳烯基、任选取代的低碳炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳烷基；然而，条件是，如果R24是取代的芳基，则所述芳基取代不是取代的异丙基；如果R24是任选取代的低碳烯基，则R24中的任何双键与R24与之结合的磺酰基S隔开至少两个键；和如果R24是任选取代的低碳炔基，则R24中的任何三键与R24与之结合的磺酰基S隔开至少两个键；R25如果存在，其为任选取代的低碳亚烷基；R26是具有3-14个环原子的任选取代的碳环结构或任选取代的杂环结构，其中当R26是芳基时，则对R26的取代，如果存在的话，不是取代的异丙基；m是0-3。
37.权利要求36的方法，其中所述疾病或状态是PDE4B介导的疾病或状态。
38.权利要求37的方法，其中所述疾病或状态选自哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管炎、过敏性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、先天性肺纤维化、结节病、肺动脉高压、阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿舞蹈病、多发性硬化、类风湿性关节炎、Crohn氏病、脑缺血、炎性肠病、溃疡性结肠炎、骨质疏松症、骨硬化病、佩吉特病、弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、严重急性呼吸综合征和早产。
39.筛选对PDE4B具有活性的改进调节剂的方法，所述方法包括确定相对于对PDE4B具有活性的参照化合物，根据权利要求1的多种测试化合物中的任意种是否在一种或多种期望的药学性质方面提供了改进；和如果存在在所述期望的药学性质方面提供了改进的化合物，则选择那些化合物，从而得到改进的调节剂。
40.筛选对PDE4B具有活性的改进调节剂的方法，所述方法包括确定相对于对PDE4B具有活性的参照化合物，根据权利要求9的多种测试化合物中的任意种是否在一种或多种期望的药学性质方面提供了改进；和如果存在在所述期望的药学性质方面提供了改进的化合物，则选择那些化合物，从而得到改进的调节剂。
41.筛选对PDE4B具有活性的改进调节剂的方法，所述方法包括确定相对于对PDE4B具有活性的参照化合物，根据权利要求23的多种测试化合物中的任意种是否在一种或多种期望的药学性质方面提供了改进；和如果存在在所述期望的药学性质方面提供了改进的化合物，则选择那些化合物，从而得到改进的调节剂。
42.优化对PDE4B具有特异性的配体的方法，所述方法包括鉴定与多种磷酸二酯酶结合的化合物；和测定与所述化合物相比，所述化合物的衍生物对PDE4B是否有更高的特异性。
43.权利要求42的方法，其中所述化合物以比对任意所述多种磷酸二酯酶的结合高至少10倍的亲和力与PDE4B结合。
44.权利要求42的方法，其中所述化合物与至少一个保守PDE4B活性部位残基相互作用。
45.权利要求42的方法，其中所述化合物与所述多种磷酸二酯酶弱结合。
46.权利要求42的方法，其中所述多种磷酸二酯酶包括PDE4B和PDE4D。
47.权利要求42的方法，其中所述多种磷酸二酯酶包括PDE4B和PDE5A。
48.修饰的化合物，所述化合物包括PDE4B结合化合物，和接头部分，其在能量许可部位与所述PDE4B结合化合物连接，以便所述修饰的化合物结合到PDE4B。
49.权利要求48的方法，其中所述接头附着于固相。
50.权利要求48的方法，其中所述接头包括标签或与标签连接。
51.权利要求48的方法，其中所述接头是无痕接头。
全文摘要
提供了对磷酸二酯酶PDE4B具有活性的化合物。本文也提供了可用于治疗PDE4B介导的疾病或状态的组合物及其应用方法。
文档编号C07D333/42GK101031293SQ200580022054
公开日2007年9月5日 申请日期2005年5月6日 优先权日2004年5月6日
发明者H·卓, B·英格兰, S·吉列特, P·N·易卜拉欣, D·R·阿尔蒂, R·L·苏克曼, C·张 申请人:普莱希科公司