具眼镜蛇毒因子样功能的人补体c3衍生物的制作方法

专利名称：具眼镜蛇毒因子样功能的人补体c3衍生物的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及人补体C3的嵌合衍生物，其中所述人补体C3的嵌合衍生物具有部分人C3蛋白质被相应部分的眼镜蛇毒因子(CVF)蛋白质替代。优选地，用相应部分的CVF替代C3的α链部分。
背景技术：
补体的第三组分C3在补体激活的经典途径和旁路途径中都起着关键作用，而且许多生理性C3激活产物在免疫应答和宿主防御反应中具有重要功能。在旁路途径中，C3的激活形式C3b是C3转变酶的结构性亚基。这个双分子酶由C3b和Bb组成，其中所述Bb是B因子的激活形式。这个酶如下形成，即C3b结合至B因子，随后B因子被D因子切割，从而形成C3转变酶C3b，Bb，并释放激活肽Ba。C3转变酶通过将C3切割成C3b和过敏毒素C3a来激活C3。C3b分子结合至紧邻C3转变酶的细胞和颗粒。最后，所结合的C3b允许C5激活成为C5b和过敏毒素C5a。C5通过相同的C3b，Bb酶发生激活，当其中所述C3b，Bb酶结合额外的C3b分子产生包含(C3b)2，Bb的三分子复合物时，其能切割C5。这个切割C5的三分子酶称为C5转变酶。由于C3和C5的激活都发生在Bb亚基中的同一个活性位点，所以这个酶也称作C3/C5转变酶；并且只分配了一个EC编号(EC3.4.21.47)。
眼镜蛇毒包含C3的结构和功能类似物，称为眼睛蛇毒因子(CVF)。这个分子可以在人和哺乳动物血清中结合B因子形成CVF，B复合物，其中所述CVF，B复合物也被D因子切割成为双分子酶CVF，Bb和Ba。双分子复合物CVF，Bb是C3/C5转变酶，其与由C3b形成的C3/C5转变酶类似地激活C3和C5。虽然这两种C3/C5转变酶C3b，Bb和CVF，Bb有相同的分子构造、携带活性部位的Bb亚基和底物特异性，但这两种酶呈现显著的功能差异。CVF，Bb酶在物理化学上远比C3b，Bb稳定，其抵抗由调节蛋白H和I因子引起的失活，其呈现不同的动力学特性，而且其不需要额外的C3b来切割C5。
已经表明，CVF和哺乳动物C3呈现一些结构相似性，其中包括免疫交叉反应性、氨基酸组分、圆二色谱、二级结构、电子显微镜超微结构和氨基酸序列。然而，两分子之间存在显著的结构差异。其中C3是表观分子量依赖于不同物种为170-190 kDa的双链分子，而CVF是表观分子量为类似于C3c的149 kDa的三链分子，其中所述C3c是C3生理性激活的产物之一。C3和CVF之间的另一显著性结构差异存在于它们的糖基化上CVF有7.4％(重量比)的碳水化合物含量，主要由N连接的复合物类型链组成，其中在复合物类型链的非还原末端具不常见的α-半乳糖残基。相反地，人和大鼠C3在它们寡糖链的不同结构中呈现更低程度的糖基化。
虽然CVF，Bb和C3b，Bb都是C3/C5转变酶，但它们呈现重要的差别。包含CVF的酶远比包含C3的酶稳定。两种转变酶都会自发地降解为它们各自的两个亚基。然而，包含CVF的转变酶的内在半衰期(稳定性)在37℃大约是7小时，这比包含C3的酶的内在半衰期即大约1.5分钟要长几百倍。此外，包含CVF的酶以及游离的CVF不受补体调节蛋白质H和I因子的调节。包含CVF的酶长的内在半衰期与抵抗调节的联合就使得CVF能够持续地激活C3和C5(随后激活其它补体成分)，最终导致血清补体活性的衰竭。
基于在多种疾病(包括主要的流行性疾病)中涉及补体系统，所以在过去十年就已经预见，研发多种抗补体(anti-complementary)试剂来在这些疾病阶段干扰不希望的补体激活过程。所有针对补体的药物研发的尝试都基于抑制补体激活，而CVF通过消耗血清中补体发挥作用。用来治疗补体激活性疾病的目标是将C3的无或低免疫原性和CVF的补体消耗功能组合的C3类型分子。
发明简述下文列出的实施方案是本发明多个方面的非限制性说明。其它方面和变化根据整个公开显而易见。
一些实施方案包括一种或多种经修饰的人补体C3蛋白质，其中所述经修饰的人补体C3蛋白质的部分人C3蛋白质可以用与其基本相关的眼镜蛇毒因子蛋白质序列的对应部分替代。在一些实施方案中，所替代的CVF部分可以位于C3的α链内。在一些实施方案中，所替代的CVF部分可以是C3的α链C端部分。在一些实施方案中，所替代的C端部分可以包括人C3蛋白质的第1663位氨基酸。在一些实施方案中，所替代的C端部分可以是不扩展至人C3蛋白质整个C端的内部部分。在另外一些实施方案中，经修饰的蛋白质可以具有与未修饰的人C3蛋白质基本相同数量的氨基酸残基。在一些实施方案中，替代可以包括人C3蛋白质700-1663位氨基酸之内的任意位置。其它实施方案为这样的人补体C3蛋白质，其中部分人C3蛋白质可以用与其基本相关的眼镜蛇毒因子蛋白质序列的对应部分替代，并且其可以具有至少两个替代。在一些实施方案中，替代具有选定的起始位置和选定的终止位置，在一些此类实施方案中，起始位置可以是例如749、874、936、994、1264、1348、1496、1504、1550位等等；而终止位置可以是例如784、921、970、1324、1550、1617、1663位等等。在优选的实施方案中，一个或多个替代可以包括下列任意氨基酸1550-1663、1504-1663、1348-1663、1550-1617、1504-1617、1496-1663、1348-1617、1496-1617、1264-1324、749-784、874-921、994-1663、994-1550和936-970。在一些实施方案中，所替代的CVF部分可以位于C3的β链中。
在一些实施方案中，经修饰的C3蛋白质可以具有与B因子的亲和性，并且能支持形成转变酶。在一些实施方案中，所得转变酶可以切割C3但不能切割C5。在另外一些实施方案中，转变酶可以具有37℃大约1.5分钟至大约7小时之间的内在半衰期。在一些实施方案中，所得转变酶可以具有37℃至少大约7小时的半衰期。
在一些实施方案中，经修饰的C3蛋白质可以以单链蛋白质形式表达。在一些实施方案中，可以将经修饰的C3蛋白质切割为至少两条类似C3形式的链。在另外一些实施方案中，可以切割经修饰的C3蛋白质来释放其C3a部分。在一些实施方案中，经修饰的蛋白质可以在N末端具有额外的不由C3或CVF编码的1至大约19个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的蛋白质可以包括非C3的信号肽，例如果蝇(Drosophila)的Bip信号序列。在一些实施方案中，经修饰的C3蛋白质可以具有对B因子和/或D因子改进的亲和性。在一些实施方案中，经修饰的蛋白质可以显示对H因子和/或I因子部分或完全的抗性。在一些实施方案中，经修饰的C3蛋白质可以是基本无免疫原性的。
其它的实施方案可以包括通过向患者施用消耗补体有效量的经修饰C3蛋白质来消耗补体的方法。在一些实施方案中，给药可以是局部的。在另外一些实施方案中，局部给药可以是进入器官、皮下、进入体腔或者进入组织。在其它实施方案中，局部给药能够实现在目的位置浓缩经修饰的C3蛋白质的靶向功能。在另外一些实施方案中，靶向功能可以包括使用与经修饰的C3蛋白质缀合的抗体。在一些实施方案中，给药可以是全身给药，例如静脉内或腹膜内。
更多的实施方案可以是避免或改善患者再灌注损伤的方法，其通过向患者递送消耗补体的足够量经修饰的C3蛋白质；并且允许患者再灌注。在一些实施方案中，递送步骤可以包括将经修饰的C3蛋白质注射进入动脉。在其它实施方案中，递送步骤可以包括局部递送经修饰的C3蛋白质。在其它实施方案中，递送步骤可以包括全身递送经修饰的C3蛋白质。在一些实施方案中，再灌注可以包括打开封闭的动脉。在一些实施方案中，再灌注可以与器官移植联系而发生。
一些实施方案包括增加基因疗法效率和效力的方法，其中通过递送消耗补体的足够量经修饰的C3蛋白质、提供基因疗法以及观察因此增强的结果来增加基因疗法的效率和效力。
一些实施方案可以包括增加治疗剂或诊断剂递送的方法，其中通过递送足够增加血流量的经修饰的C3蛋白质以及提供治疗剂和诊断剂来增加治疗或诊断剂递送。在一些实施方案中，方法可以包括在递送步骤之前将经修饰的C3蛋白质化学地与具特定组织亲和性的抗体连接。在一些实施方案中，抗体可以通过重组DNA技术连接到经修饰的C3上。在一些实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。
一些实施方案包括治疗自身免疫疾病的方法，其中包括施用足够消耗补体的经修饰C3蛋白质。在一些实施方案中，施用可以是间插性的，并且对应至少一项升高的疾病症状的期间。在一些实施方案中，自身免疫疾病可以是任意一种下列疾病，即哮喘、系统性红斑性狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病、多发性硬化、心肌缺血、再灌注、脓毒症、超急性排斥、移植排斥、心肺分流术、心肌梗塞、血管成形术、肾炎、皮肤真菌病、类天疱疮、脊髓损伤和帕金森氏病。
一些实施方案包括通过例如用相应部分的眼睛蛇毒因子(CVF)蛋白质替代部分人补体C3蛋白质来在人蛋白质中模拟CVF性质的方法。在一些实施方案中，该部分可以位于C3的α链内。在其它实施方案中，该部分可以是C3α链的C端部分。在一些实施方案中，C端部分可以包括人C3蛋白质的第1663位氨基酸。在一些实施方案中，所替代的C端部分可以是不扩展至人C3蛋白质整个C端的内部部分。
其它实施方案包括通过表征经修饰的C3蛋白质至少一种性质来形成经修饰蛋白质的功能谱、并将功能谱与待治疗的疾病或病症匹配来选择经修饰的C3蛋白质的方法。在一些实施方案中，至少一种性质可选自转变酶活性、转变酶形成、转变酶稳定性、H因子敏感性、I因子敏感性、切割C3的能力以及切割C5的能力。在一些实施方案中，所选C3蛋白质参与形成适合治疗慢性病症的转变酶。在一些实施方案中，改造可以包括下列任意一种性质例如长的血浆半衰期、高稳定性、H因子抗性、I因子抗性等。在一些实施方案中，可以改造转变酶来治疗再灌注损伤。在其它实施方案中，改造可以是下列任意一种性质例如高转变酶活性、H因子抗性、I因子抗性等。
一些实施方案包括编码经修饰的C3蛋白质的核酸序列、和/或包含核酸的载体和/或包含载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是下列任意一种细胞果蝇(Drosophila)S2细胞、Sf9细胞、CHO细胞、COS-7细胞、HiFive细胞、酵母细胞、BHK细胞、HEK293细胞和大肠杆菌(E.coli)细胞。
一些实施方案包括可以包含经修饰的人补体C3蛋白质和可药用载体和/或核酸的组合物。
一些实施方案包括表达经修饰的C3蛋白质的表达系统。在一些实施方案中，表达系统包括选自下列的细胞果蝇(Drosophila)S2细胞、Sf9细胞、CHO细胞、COS-7细胞、HiFive细胞、酵母细胞、BHK细胞、HEK293细胞和大肠杆菌(E.coli)细胞。
附图简述

图1描述了C3和CVF的链结构，其中阴影部分存在于成熟蛋白质中。
图2显示最初的CVF/眼睛蛇C3杂交蛋白质的图谱，显示了五个杂交蛋白质中每个蛋白质用眼睛蛇C3序列替代的CVF区域。
图3A-3G显示CVF1(SEQ ID NO3和4)的cDNA和衍生的氨基酸序列。标明了α-链、γ-链和β-链的NH2端和C端、功能重要区域以及已知的配体结合位点。氢基酸残基编号起始于前CVF1分子的NH2端。
图4显示三种经修饰的人C3蛋白质(HC3-1348、HC3-1504和HC3-1550)与CVF相比在人血清中进行补体消耗测试的结果。
图5显示测定经修饰的人C3蛋白质(HC3-1348、HC3-1504和HC3-1550)与CVF和C3b相比其激活B因子和形成C3/C5转变酶的能力的测试结果。
图6显示测定三种经修饰的人C3蛋白质(HC3-1348、HC3-1504和HC3-1550)与CVF相比，激活C3的C3/C5转变酶活性的结果。
图7显示测定经修饰的人C3蛋白质HC3-1348与CVF相比其切割C3(使用图6的实验中所用转变酶数量的20％)的测试结果。
图8概括了三种经修饰的人C3蛋白质HC3-1348、HC3-1504和HC3-1550与CVF和人C3b相比的活性测定结果。
图9是显示了天然的CVF和多种人C3蛋白质的补体消耗结果的图。
图10是显示了C3b、重组的CVF和多种经修饰的人C3蛋白质切割B因子的结果图。
图11是显示天然的CVF和多种经修饰的人C3蛋白质切割C3的结果图。插图显示用20％的主图转变酶进行相同反应的结果。
图12是显示H因子和I因子切割所选杂合蛋白质的结果。
图13是显示人C3/CVF杂合蛋白质的C5转变结果的凝胶图片。
优选实施方案详述用代表着为CVF特定功能的关键结构所需的CVF序列替代人补体C3序列允许产生具CVF样功能的C3衍生物。本发明的优选实施方案提供了呈现CVF特定功能即通过形成稳定的转变酶来消耗补体的人C3衍生物，用在补体激活是部分病因的临床病症中作为新型治疗剂来消耗补体。由于最小化了人C3中由CVF特定序列造成的结构变化，所以经修饰的C3分子呈现显著降低的免疫原性或者甚至没有免疫原性。
公开了许多经修饰的人补体C3蛋白质(C3)，其将部分人C3蛋白质用眼睛蛇毒因子蛋白质(CVF)的相应部分进行替代，从而使产生的人C3蛋白质具有CVF功能，但免疫原性显著降低。C3蛋白质可以是蛋白质前体(单链蛋白质)或者是移去四个精氨酸残基的经切割蛋白质。额外的两条链形式可以通过移去C3a部分形成。有利地，可以将C3蛋白质操作成包括至少一种下列CVF功能增加的形成C3转变酶的能力、增加的C3转变酶稳定性、增加的对H因子和/或I因子作用的抗性、增加的切割C3和C5的活性以及增加的血浆半衰期。在一实施方案中，用CVF蛋白质的相应部分替代C3α链的C端部分。本文公开了大范围的多个特定区域和特定嵌合体。此外，公开了鉴定和/或选择经修饰的C3蛋白质的方法，其中涉及表征经修饰的C3蛋白质性质来形成经修饰蛋白质的功能谱，并将功能谱与待治疗疾病或病症匹配。功能谱包括下列一种或多种功能形成转变酶的能力、对H和/或I的敏感性、切割C3的能力、切割C5的能力、转变酶的相对活性、转变酶的稳定性和血浆半衰期。经修饰的C3蛋白质也称为嵌合的C3蛋白质、C3/CVK嵌合体或C3/CVK杂合蛋白质，其可以用来治疗多种起因于局部或全身补体激活的疾病或病症。这些疾病包括但不局限于再灌注损伤、自身免疫疾病如类风湿性关节炎和狼疮、以及重症肌无力和其它起因于抗体的疾病，其中所述抗体对人体蛋白质或结构进行识别并指导免疫反应。
补体系统和疾病补体系统是通过在宿主防御和免疫反应中起作用而参与维持健康的脊椎动物免疫系统的组分。但是，补体激活也参与多种疾病的病因。这些疾病的实例包括自身免疫溶血性贫血、类风湿性关节炎和其它免疫复合疾病、以及在血流暂时停滞之后发生组织损害的再灌注损伤。再灌注损伤的实例是再次打开封闭血管之后发生的组织损害(例如心脏病、中风)以及在器官移植之后用受体血液进行的再灌注。基于多种疾病涉及补体系统，其中包括主要的流行性疾病，所以在过去十年就已经预见研发多种抗补体试剂来在这些疾病阶段干扰不希望的补体激活过程。所有这些药物研发尝试都基于抑制补体激活。
补体蛋白质C3、眼睛蛇毒因子CVF、相似性和差异性补体的第三个组分C3在补体激活经典途径和旁路途径中都起着关键作用，而且许多生理性C3激活产物在免疫应答和宿主防御反应中具有重要功能(综述见Muller-Eberhard，H.J.(1988)″Molecular Organizationand Function of the Complement System，″Ann.Rev.Biochem.，57321-347，此处以其整体引入作为参考)。人C3是分子量为大约185,000的双链糖蛋白。其以单链的前C3前体形式合成，然后进行加工移去β链和α链之间的四个精氨酸残基。人C3的一级序列通过分子克隆而已知。其它哺乳动物物种和非哺乳动物物种C3的全长或部分序列信息也是可获得的，其中包括小鼠、大鼠、豚鼠、小鸡、眼睛蛇、xenopus和七鳃鳗。人C3基因长42 kb，并且包括41个大小介于52-213bp范围的外显子。
C3的主要激活产物是C3b。C3b在形成旁路途径C3/C5转变酶中起核心作用。这个酶的形成需要C3b与B因子的起始结合。随后，D因子在Mg2+存在下切割弱复合体C3b，B，产生酶学活性的C3/C5转变酶C3b，Bb，并释放激活肽Ba。C3b，Bb酶非常不稳定，能于37℃内在半衰期为1.5分钟自发衰变-解离为两个亚基C3b和Bb。C3b，Bb酶能用备解素稳定。C3/C5转变酶通过水解两个底物α链中的单肽键来切割C3和C5。为了让酶切割C5，C5必须结合至另一与转变酶结合的C3b分子。除了快速的自发衰变-解离外，C3b，Bb酶受到严格调控。H因子使酶分解，而H因子和I因子联合作用使C3b失活。存在H因子时，I因子在两个切割位点切割C3b的α，链。所得C3b衍生物称为iC3b，其不再与B因子形成转变酶。I因子可以在第三个位点切割α’链，这导致产生两个C3片段C3c和C3dg。对于I因子的第三个切割，C3b受体CRI起辅因子作用。
C3不同寻常的结构性质是在α链中存在分子内硫酯。C3激活为C3b之后，硫酯变得高度活跃，并负责使C3b共价接合于细胞或其它特定靶点。伴随硫酯切割的结构变化允许了随后的B因子结合及其激活。
C3中的硫酯进行缓慢的自发水解，导致形成称为iC3或C3(H2O)形式的C3。iC3具有C3b样功能，并且能在血清中与B因子和D因子形成液相转变酶。所得转变酶iC3，Bb和C3b，Bb转变酶类似，都不稳定，并且受H因子和I因子调控。但是，认为硫酯的自发水解和由iC3，Bb转变酶引起的C3低水平激活是C3b在靶细胞或颗粒上最初沉积、并导致在所谓的激活因子表面激活旁路途径的原因。
C3是高度不同寻常的多功能蛋白质。该蛋白质包括其多个与大约20种不同血浆蛋白质或细胞表面受体特异相互作用的激活产物。这种多功能性在分子详细结构/功能分析中引起了强烈兴趣。对一些C3配体，其中包括H因子、备解素、B因子和补体受体CR1、CR2、CR3，已经提出或指出C3a受体的结合位点在C3多肽或多或少限定的区域。
眼睛蛇毒包含C3的结构和功能类似物，称为眼睛蛇毒因子(CVF)。功能上，CVF和C3b类似，其能在人血清以及所有脊椎动物血清中结合B因子来形成弱复合物CVF，B，随后其中所述弱复合体CVF，B在Mg2+存在下被D因子切割成为双分子酶CVF，Bb和Ba。双分子复合物CVF，Bb是激活C3和C5的C3/C5转变酶，这类似于与C3b形成的C3/C5转变酶。
CVF是分子量为大约150,00道尔顿的三链糖蛋白。已经表明，CVF和哺乳动物C3呈现一些结构相似性，其中包括免疫交叉反应性、氨基酸成分、圆二色谱和二级结构、以及电子显微镜超微结构。最初的N末端氨基酸比对证实了其与C3的序列同源性，并进一步暗示，CVF在结构上与C3c类似。分子克隆CVF证实了CVF和C3之间的结构同源性以及链相关性，显示其在蛋白质水平与哺乳动物C3s相比整体相似性在大约70％，而与眼睛蛇C3相比超过90％。
尽管CVF和C3之间有这些功能和结构相似性，但这两个分子和所得转变酶呈现重要的功能差异1.两种酶都呈现自发衰变-解离成为各自的亚基，这废止酶活性。尽管C3b，Bb酶仅短暂存在，内在半衰期为37℃1.5分钟，但CVF，Bb酶数量级地更加稳定，衰变的内在半衰期为大约七小时。
2.C3b，Bb酶受H因子和I因子调节。相反地，CVF，Bb和CVF完全抵抗这两种蛋白质的调节作用。
3.补体激活过程中产生的C3b，Bb酶是表面结合的。相反地，CVF，Bb酶是液相酶(类似于iC3，Bb)。
4.C3b，Bb和CVF，Bb的另一功能差异在C5转变酶活性上。为了C5转变酶能够切割C5，C5需要与C3b或CVF结合。而为了用C3b，Bb酶切割C5得以进行，C5必须与非C3b，Bb酶部分的不同C3b分子结合。相反地，C5与携带Bb催化亚基的相同CVF分子结合。CVF，Bb酶结合C5的这个性质可能是其呈现液相C5转变酶活性能力的原因，而C3b，Bb酶的C5转变酶活性限制在颗粒表面。
5.两种酶都表现出在它们的C3水解反应动力学上或多或少不同。基于kcat/Km，C3b，Bb的催化效率比CVF，Bb高大约8倍。
根据功能性结果，CVF，Bb和C3b，Bb之间最显著的两个差异是CVF，Bb酶的内在稳定性及其对调节蛋白质H因子和I因子的抵抗性。一旦CVF，Bb酶形成，其将持续地激活C3和C5，从而导致补体消耗。自从30多年前证实CVF能够安全地施用至实验动物来消耗它们血浆中的补体以来，CVF就已经成为通过比较正常(补体充足)动物和经CVF处理(补体耗竭)动物研究补体在免疫反应、宿主防御和疾病致病机理中多种生物学功能的重要调查研究工具。
C3/CVF衍生物CVF是通过彻底激活随后导致耗竭这一机理起作用的补体抑制剂。事实上，CVF经常用作评测其它药物抗补体活性的标准品。虽然CVF呈现该强大的抗补体活性，但由于其免疫原性，所以其并不适合在人类中应用。由于这个原因，所以期望通过利用CVF和C3之间广泛的结构相似性来制备基本无免疫原性的CVF，以及期望通过重组方法将CVF分子的功能性重要区域替代入人C3来产生具预期的CVF补体消耗活性的人C3衍生物。这可以按照本文所述完成。
已经产生和/或设计了许多的人C3衍生物，其中部分C3序列用同源的CVF序列(主要为CVFβ链中的序列)进行了替代。CVF和C3已经通过重组方法在真核表达系统中得到成功表达。基于先前工作，选择C3的α链区域，并优选该链的C端部分，在所述先前工作中，在CVF和眼睛蛇C3(由于其和CVF之间比人C3更高的相似性)之间构建了5个合起来跨越整个CVF序列的杂化蛋白(Mol.Immunol.40199(2003)，此处以其整体引入作为参考)。其它平行工作涉及CVF蛋白质有限的蛋白水解作用(Mol.Immunol.30，Suppl.1，113(1993)美国专利号5,174,344，此处以其整体引入作为参考)。利用先前工作结果，通过用CVF的同源序列分别替代氨基酸残基1550-1663、1504-1663和1348-1663产生了三种人C3优选衍生物。所述C3衍生物通过第一个氨基酸残基命名，并且如果未指明最后一位氨基酸残基，那么其就理解为1663。如果CVF插入的端点在蛋白质C端之前，那么其用定位命名(例如HC3-1550/1617)。以前将通过替代氨基酸残基1348-1663产生的C3衍生物称为1325-1663，但随后替代作图表明替代是在1348而非1325。三种人C3衍生物分别称为HC3-1550、HC3-1504和HC3-1348。三种人C3衍生物都显示为呈现预期的CVF活性所有三种蛋白质都能够形成具活性的C3/C5转变酶。这点由三种蛋白质支持B因子激活的能力和三种所得转变酶切割C3的能力证实。所有三种蛋白质都形成稳定的转变酶，尽管内在稳定性和至少其中一种(HC3-1550)呈现低于CVF的内在稳定性。意想不到的是，发现三种蛋白质中先测试的两种(HC3-1550和HC3-1348)事实上能对豚鼠血清去补体，尽管这种活性明显小于CVF，而五种蛋白质中有四种能在人血清中消耗补体，其中HC3-1348和HC3-1496几乎能够如同CVF地对人血清去补体。HC3-1550/1617不能消耗人血清中的补体。这种至少部分消耗补体的能力表明，C3衍生物不仅形成稳定的转变酶，而且至少部分抵抗调节蛋白质H因子和/或I因子，从而呈现CVF样活性。人C3衍生物HC3-1550与人C3在氨基酸残基上有低于4％的不同，这与CVF相比显著降低或消除了其预期的免疫原性。可以优选多种C3杂合物，这基于它们的多种特性，以及取决于待治疗的疾病。例如，对于治疗慢性疾病，目的是提供具有非常低或没有免疫原性和高转变酶稳定性、以便促进其保持在患有慢性疾病患者体内的C3杂合物。在该情况下，其它特性例如转变酶活性相对不重要一些。相反，对于避免补体关联的再灌注损伤的治疗，高转变酶活性比转变酶稳定性更加重要。因此，多种不同杂合物并且每种具有特定组合的性质，使得可以选择优选的杂合物来治疗可通过补体激活和/或补体消耗来治疗的特定病症。
在一实施方案中，本发明涉及呈现至少一种下列CVF或CVF，Bb特性的经修饰的补体C3蛋白质衰变的内在半衰期长于1.5分钟、增加的对H因子和/或I因子调节作用的抗性、液相C3转变酶和液相C5转变酶活性。除了这些因素，在一些实施方案中，由于C3b，Bb的催化效率大约是CVF，Bb的8倍，所以相对于C3b，Bb催化效率被降低。在其它实施方案中，与C3b，Bb相比，催化效率未降低或提高了。虽然许多优选的C3杂合物具有很少或者没有免疫原性，但其它仍然适合许多应用的实施方案在一些情况下也显示出可检测的至中度的免疫原性。
在一些实施方案中，与经修饰的C3蛋白质形成的转变酶的内在半衰期大于1.5分钟，优选大于10分钟。在进一步的实施方案中，内在半衰期通常介于包含CVF的转变酶的半衰期(7小时或更长)和C3的半衰期(1.5分钟)之间，其中包括但不局限于约2分钟、10分钟、 20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时和7小时，或者更长。具短转变酶内在半衰期和/或短血浆半衰期的经修饰的C3蛋白质在一些应用中有用，而具长转变酶内在半衰期和/或长血浆半衰期的C3蛋白质在不同应用中有用。
在进一步的实施方案中，C3杂合物对H因子和/或I因子的抗性强于未经修饰的C3，而在一些实施方案中同CVF的抗性一样强。然而，在一些实施方案中，分子其它部分中的进一步修饰对于实现对H因子和/或I因子的抗性是必需的。
本文描述的许多实施方案涉及用CVF的相应区域特异地替代C3的一个或多个分离区域，而其它实施方案则包括使用与CVF序列基本相关但不一致的序列进行的替代。即在CVF区域中存在可以选择来用于替代的位置，在其中进行一个或多个氨基酸改变可以不丧失所选CVF区域任何预期的性质或功能，甚至在一些情况下这类改变能够赋予增强的性质或功能。所有此类改变都认为是本发明的实施方案。
在进一步的实施方案中，包含经修饰的C3蛋白质的转变酶的催化活性在一些实施方案中至少是包含CVF的转变酶的50％，并且可以高于包含未经修饰的C3的转变酶。在更多实施方案中，催化活性是CVF转变酶的60％、70％、80％、90％或100％。两种酶都已经显示在它们C3水解作用的动力学上多少不相同。因此，在许多实施方案中，包含经修饰的C3的转变酶可以具有介于两者之间的催化活性，或者具有超过包含未经修饰的C3的转变酶活性的催化活性。因此，在一些实施方案中，该包含经修饰的C3的转变酶的活性可以是包含CVF的转变酶的活性的10％-1000％、或者更多，其中包括但不局限于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和110％、135％、150％、200％、300％、400％、500％、750％、1000％和更多。
基于kcat/Km，在切割C3时，C3b，Bb的催化效率大约比CVF，Bb大八倍。因此，在一些实施方案中，包含经修饰的C3蛋白质的转变酶的催化效率在一些实施方案中至少是包含CVF的转变酶催化效率的50％，并且可以大于包含未经修饰的C3b的转变酶的催化效率。两种酶都已经显示在它们C3水解作用的动力学上多少不相同。因此，在许多实施方案中，包含经修饰的C3的转变酶可以具有介于两者之间的催化效率，或者具有超过包含未经修饰的C3的转变酶效率的催化效率。因此，在一些实施方案中，该包含经修饰的C3的转变酶的效率可以是包含CVF的转变酶效率的10％-1000％、或者更多，其中包括但不局限于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和110％、135％、150％、200％、300％、400％、500％、750％、1000％和更多。
在进一步的实施方案中，经修饰的C3蛋白质的C5切割活性得到增加。C5切割活性可以从CVF或C3活性的大约10％至400％，其中包括括但不局限于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、150％、200％、250％、300％、350％和375％。
在进一步的实施方案中，经修饰的C3蛋白质与B因子的结合和/或其随后的被D因子切割可能会减少。但是，只要保持至少功能量的催化活性和补体消耗活性，那么经修饰的C3蛋白质就是有用的。
在进一步的实施方案中，具有经修饰的C3蛋白质的转变酶呈现与那些包含天然CVF的转变酶基本相同的补体激活活性。术语“呈现与天然CVF基本相同的补体激活活性”是指根据Cochran等人的方法((1970)J.Immunol.105(1))，55-69，此处以其整体引入作为参考)进行测定，本发明的C3衍生物具有天然CVF 0.1-97％、优选50-97％、优选80-97％水平的补体激活活性。
在一些实施方案中，经修饰的补体C3蛋白质是其中一些或全部C端区域用CVF相应区域进行了替代的C3分子。在一些实施方案中，只有C3α链的C端部分用CVF的相应区域进行了替代。在一些实施方案中，替代了氨基酸700-1663中的一些或全部，其中包括但不局限于从20至大约1000个氨基酸的区域，包括但不局限于30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、175、180、190、200、250、275、300、350、375、400、450、475、500、550、575、600、650、675、700、750、775、800、850、875、900、950、975、1000。在一些实施方案中，C3的β链是完整的，即与天然C3相同。然而，在一些实施方案中，除了C3α链中的替代之外，可以进行其它替代来提供诸如增加的稳定性(例如可以突变或替代掉与H因子结合和I因子切割相关位点)的功能。特定替代包括但不局限于氨基酸1550-1663、1504-1663、1348-1663、1550-1617、1504-1617、1470-1663、1348-1617、1470-1617、1264-1324、1348-1386、749-784、874-921、1496-1663、1496-1617和936-970。在一些实施方案中，在这些区域中仍然有更小的替代可以对应更小的区域来产生具预期CVF功能或性质的C3。
优选实施方案的免疫原性与C3相比维持在低水平或者没有。在一些实施方案中，经修饰的C3蛋白质是基本上非免疫原的。基本上非免疫原的表示当注入人类患者时蛋白质仍然能够呈现补体激活功能。此外，经修饰的C3蛋白质可以如C3那样是非免疫原的，或者可以是从大约75％的非免疫原的至大约100％的非免疫原的，其中包括但不局限于80％、85％、90％、95％和99％。
全身或局部治疗的方法通过本文公开的方法制备的经修饰的人补体C3蛋白质可以如下地用来局部或全身地消耗补体通过许多产生补体消耗或补体激活结果的方式可以实现局部治疗效果，其中所述补体消耗或补体激活取决于想得到的效果。在一个实施方案中，当经修饰的C3蛋白质局部施用至器官、组织、腔、或皮下施用时，就达到局部消耗效果。这导致在区域内暂时或完全消耗补体。也可以用胰岛素类型的泵来实现局部消耗或激活效果，其中所述胰岛素类型的泵产生通向选定位点的间断或持久的经修饰的C3蛋白质流。备选地，补体的局部激活可以采用特异的单克隆抗体，当其中所述单克隆抗体化学连接至经修饰的C3时，其能将经修饰的C3定位至特定组织、疾病或受感染细胞，从而导致在那个区域补体持续激活。在其它实施方案中，抗体可以通过重组DNA技术连接至经修饰的C3蛋白质。
当全身施用经修饰的C3蛋白质，例如由静脉内或向腹膜内施用时，就可以产生全身消耗效果。这导致补体全身地暂时和完全消耗。这个方法可以用于再灌注损伤、冠状心脏手术(coronary heart surgery)、移植和或全身疾病，尤其是突发期间或者阵发性质的疾病。这在本文提供的实施例中进一步进行了讨论。
经修饰的人C3蛋白质用于每个这些情况以及特定疾病阶段时可以酌情变化许多最有利的性质。例如，在那些希望立即但仅暂时移去补体的情况下，最适合的是具有较短的血浆半衰期和/或稳定性、但补体激活活性高(高C3/C5转变酶活性)的经修饰蛋白质。在正治疗的疾病是慢性疾病的情况下，长血浆半衰期和/或稳定性以及低或缓慢活性将最适合。
转变酶活性/功能当生产和分析本文经修饰的C3蛋白质的最佳用途时，许多功能和活性可以用于此类分析，其中包括但不局限于对B因子的亲和性-可以检测和利用经修饰的C3蛋白质支持B因子激活(切割成为Ba和Bb)的效率差异。除了对B因子的亲和性以外还有多种属于支持B因子激活的因子，但是一旦形成了转变酶，那么随后通常最重要的关键性质就是稳定性、受H和I调节以及切割C3和C5的活性了。
稳定性-C3b，Bb和CVF，Bb酶都呈现出自发衰变-解离成为各自废除酶活性的亚基。虽然C3b，Bb酶非常短期存在，并以37℃1.5分钟的内在半衰期衰变，而CVF，Bb酶要数量级地更加稳定，以大约七小时的内在半衰期进行衰变。
H因子和/或I因子的调节-C3b，Bb酶受到H因子和I因子的调节。相反地，CVF，Bb和CVF完全抵抗这两种蛋白质的调节。
切割C3的活性-两种酶都表现得在它们的C3水解反应动力学上或多或少不同。基于kcat/Km，C3b，Bb的催化效率比CVF，Bb高大约8倍。
免疫原性-因为由CVF特异序列导致的人C3中的结构变化是最小的，所以与CVF相比经修饰的C3可以呈现显著降低或者甚至没有免疫原性。此外，眼镜蛇中产生将α键合(bonded)的半乳糖转移至CVF寡聚糖链末端的转移酶，这在远离人的物种中是典型的。由于人不产生这个转移酶，所以将α键合的半乳糖残基看作是非自身的并且是高度致免疫的。因此，就会产生识别CVF上产生的特定CHO部分的抗α-半乳糖的抗体。人C3和CVF在它们52％的位置上缺乏同一性，而糖类差异甚至更加显著。因此，由于优选的经修饰的C3蛋白质有低于10％而在一些实施方案中大约4％的C3氨基酸被CVF的那些氨基酸替代，而且也没有眼镜蛇衍生的糖类结构(尤其是聚糖上α键合的半乳糖)，所以本发明C3杂合物的免疫原性显著更低。在一些实施方案中，优选的实施方案的C3杂合物的免疫原性显著低于CVF。在其它实施方案中，优选的实施方案的C3杂合物的免疫原性至少比CVF低50％。在一些实施方案中，重组蛋白质在昆虫或哺乳动物细胞系中产生，从而产生简单的或者与在人中发现的糖部分非常类似的糖部分。
实施例生产了五种CVF/眼镜蛇C3缺失功能的杂合蛋白质，其中大部分CVF序列都用眼镜蛇C3的同源部分进行了替换。这些杂合蛋白质的初步特征表明，在CVFα链(C3的β链)中用眼镜蛇C3序列进行替换不改变其消耗血清补体活性的功能性质，而替换β链和γ链部分则具有较大效应。杂合蛋白质H4和H5除了受损的消耗血清补体的能力以外，还呈现显著降低的旁观者溶解(C5切割的量度)活性，其中所述H4和H5的CVF残基978-1642用眼镜蛇C3序列进行了替换。这表明，C3的α链(对应CVF的β链和γ链)可能是导致CVF和C3之间活性差异的主要位点。另一平行实验证据强烈地表明，CVF β链的C端部分对于CVF功能是重要的，这得自于用胰凝乳蛋白酶限制性水解CVF的实验(Grunwald等人(1993)Mol.Immunol.30，Supp.1，30，此处以其整体引入作为参考)。因此，已经产生和鉴定了大量用眼镜蛇毒因子蛋白质(CVF)相应部分替换了部分人C3蛋白质的经修饰的人补体C3蛋白质(C3)。这些替换致使人C3蛋白质具有CVF类型的功能和实质上低于CVF的免疫原性。这些蛋白质的产生和测试如下文实施例1-3所示。实施例4-10中提供了这些蛋白质的多种用途和测定法。
实施例1生产人补体C3/CVF杂合蛋白质用代表CVF特定功能的重要结构特征的CVF序列替换人C3序列使得产生具CVF样功能的C3衍生物。因此，本发明的实施方案涉及产生人C3衍生物，其通过形成稳定的转变酶来呈现消耗补体的CVF特异功能，用作在补体激活是部分病因的临床疾病中作为消耗补体的新型治疗剂。由于由CVF特定序列引起的人C3的结构改变是小的，显然经修饰的C3分子可以显示显著降低的或甚至没有免疫原性。
表1中的人C3分子设计为包含特定的CVF序列，以便产生具CVF功能的人C3衍生物。本发明的一些实施方案提供了这些区域内较小的替换来定义导致能形成相对稳定的转变酶和呈现很小或没有免疫原性的经修饰的C3蛋白质的小区域。
表1示例性人C3/CVF克隆
某些经修饰的C3蛋白质(也称为杂合蛋白质或嵌合体)通过下文所述的定点诱变产生。简而言之，即用Ho等人的方法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.(1989)″Site-DirectedMutagenesis by Overlap Extension Using the Polymerase Chain Reaction″Gene，7751-59，此处以其整体引入作为参考)用CVF替换人C3序列的小部分来进行定点诱变。在这个方法中，进行两次PCR反应，一个使用预期突变位点上游某处的正向引物。第二个引物即反向引物包含突变。这轮第二次PCR的正向引物包含预期突变，而反向引物在突变位点下游。在这个步骤的每个PCR产物中优选存在至少一个唯一的限制性位点，以便能够将经修饰的DNA重新转移入最初克隆。用大量模板DNA和低数量的循环进行扩增，以便最小化由PCR过程引入的突变。更加具体而言，第一轮PCR是用于5’产物的反应，其使用人C3质粒作为模板，而另一PCR使用CVF质粒。在这种情况下，中间的“诱变”引物部分由C3序列组成，部分由CVF序列组成，在两个序列之间提供了“桥”。
扩增之后，通过凝胶电泳纯化这两个产物，并用Qiagen的Qiaquick凝胶提取试剂盒将其从凝胶中分离。然后组合片段，并用这两个片段作为模板，并用外部引物作为扩增引物进行另一次PCR。再次，用高浓度的模板DNA进行PCR，并只循环很少循环来最小化PCR造成的突变。所得PCR产物用两个独特的限制性酶切割，按大小在琼脂糖凝胶上纯化，并用Qiaquick柱分离目的片段。然后用适当的酶切割片段，并克隆进入已经用相同酶切割的pBS-HuC3或pHC3-1550(-sig)。
第一个杂合质粒pHC3-1550包含从蛋白质位置1550至C端替换同源的C3序列的CVF序列。第二个杂合质粒pHC3-1504编码的杂合蛋白质包含从蛋白质位置1504至C端替换人C3序列的CVF序列。第三个杂合质粒pHC3-1348包含从蛋白质位置1348至C端替换同源的C3序列的CVF序列。为了制备第一个质粒，进行两个最初的PCR反应。两个杂合物都具有大约19个氨基酸的载体编码的序列， 其中含有下述RSPWPGVPTSPVWWNSADA(SEQID NO5)中的一些或全部。由于克隆C3基因的方法，所以这些由克隆载体编码的氨基酸在人C3 N端的N端。因为这些额外的氨基酸不影响蛋白质的活性，所以移去它们不会有不利作用。制备第一个质粒时以pBS-HC3-2作为模板，并使用下列寡核苷酸作为引物HC3H5-1(GGATGCCACTATGTCTATATTGGACATATCC-SEQID NO6)和HC3H5-2(TCTTCTATTCGAACCAGTCGGGTCTTGTAC-SEQ ID NO7)。第二次PCR用pCVF-FL3Δ作为模板，下列寡核苷酸作为引物HuC3H5-3(GTACAAGACCCGACTGGTTCGAATAGAAGAACAAG-SEQ ID NO8)和HuC3H5-4(TATCATGTAAGCGGCCGCGTATAAACAATTTAAGGG-SEQ ID NO9)。两个反应都在Eppendorf热循环仪中使用下列程序进行95℃5分钟，随后95℃30秒、58℃30秒(从50到65℃的梯度)5个循环，再72℃1分钟，随后95℃30秒、57.5℃30秒(从55到60℃的梯度)进行20个循环，72℃1分钟，最后72℃10分钟。两个片段用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，并参与第二次PCR反应，其中使用HC3H5-1和HC3H5-2作为引物、两个最初PCR产物作为模板。这个反应所用循环条件为95℃5分钟，随后95℃30秒、51℃30秒(从46-56℃的梯度)5个循环，并且72℃1.5分钟然后95℃30秒、57℃30秒(从52-62℃的梯度)20个循环，并且72℃1.5分钟。然后72℃孵育10分钟。PCR片段如上所述进行纯化、用BsrG I和Not I切割、凝胶纯化、并用Qiagen凝胶分离试剂盒分离。将这个片段克隆入已经用相同酶切割的pBS-HuC3-2，所得克隆通过用EcoR I消化来筛选正确片段的插入。所有具正确的EcoR I消化图谱的克隆都进行测序，从而确定没有插入PCR诱导的突变。大规模制备一个具所期望序列的克隆(pHC3-1550)，并通过用HindIII(并用T4 DNA聚合酶修复末端)和Not I消化切割出插入片段。片段通过凝胶电泳纯化，如上所述地从凝胶中分离，并克隆入已经用EcoRV和Not I切割的果蝇(Drosophila)表达载体pMT/V5-HisA。尝试从这个构建体获得杂合蛋白质的表达，结果产生非常低产量的蛋白质。因为这个原因，所以制备了从pHC3-1550移去人C3信号序列、同时插入新的、独特的Afe I位点的构建体。为了实现这个目的，pHC3-1550用下列两个引物进行扩增HC3SigRemFAGATCTCCATGGAAGCTTAGCGCTGGGAGTCCCATGTACTCTATCATC(SEQ ID NO10)和HC3SigRemRGCGTCCCGCCTTCAACAGCC(SEQID NO11)。扩增之后，片段如上所述纯化、用HindIII和Spe I切割。凝胶分离150bp的带，并将其克隆入已经用相同酶切割的pHC3-1550。通过用Afe I切割筛选来自转化体的DNA，并通过DNA测序证实所有阳性克隆。这个质粒称作pHC3-1550(-sig)。
通过用Afe I、Dra I(片段化质粒)和NotI消化从质粒切割出插入片段。消化物进行凝胶电泳，如上所述分离5kb的片段。然后将其连接入经EcoRV和NotI消化的pMT-Bip/V5-HisA。所得质粒称作pMB/HC3-1550。
产生第二个杂合蛋白质HC3-1504的质粒以类似方式制备。进行两次PCR反应来获得人C3和CVF的部分编码序列。在第一次PCR反应中，pBS-HuC3-2用作模板，下列寡核苷酸用作引物HC3H5-3-F1(TCTGTGTGGCAGACCCCTTCGAGG-SEQ ID NO12)和HC3H5-3-R1(CGTTACCAATACATATCTTGTTCAGCTTTCCATCC-SEQID NO13)。第二次PCR用pCVF-FL3Δ作为模板，下列寡核苷酸作为引物HuCC3H5-3-F2(GGATGGAAAGCTGAACAAGATATGTATTGGTAACG-SEQ ID NO14)和HuC3H5-3-R2(CATCCATGACATAGATATCATTACCATCTTG-SEQ ID NO15)。将所得的两个PCR产物加入到用HuC3H5-3-F1和HuC3H5-3-R2作为引物、这两个PCR片段作为模板的PCR反应中。在第二次PCR反应之后，产物用QiagenPCR纯化试剂盒纯化，然后用Nsp V切割，并将其克隆入已经用相同酶切割、并经小牛肠碱性磷酸酶处理的pHC3-1550(-sig)。所得克隆用EcoR I切割来确定插入片段的方向，并进行测序来确定没有发生PCR诱导的改变。所得质粒称作pHC3-1504。然后如上所述地从这个质粒分离插入片段，并将其如上所述地克隆入pMT-Bip/V5-HisA。这个质粒称作pMB/HC3-1504。
产生第三个构建体HC3-1348的质粒以类似HC3-1504所用的方式构建。仅有的差别是两个突变引物为HuC3H5-5-1R(GCAACTGTGCGTTATACATTGTCACCACCGAC-SEQ ID NO16)和HuC3H5-5-2F(GTCGGTGGTGACAATGTATAACGCACAGTTGC-SEQID NO17)。对于最初的PCR反应，所用引物为HuC3H5-3-1F和HuC3H5-5-1R、模板是pBS-HuC3-2；而对于第二个最初的PCR反应，所用引物为HuC3H5-5-2F和HuC3H5-3-2R、以pCVF-FL3Δ作为模板。最初的PCR之后，如构建pHC3-1504所述地纯化这两个片段、并将其用作第二次PCR反应的模板。如上所述地纯化第二次PCR反应的产物、用NspV切割、并将其克隆入pHC3-1550、确认序列并将插入片段克隆入pMT-Bip/V5-HisA)。
产生第四个杂合蛋白质HC3-1496的质粒以如下的类似方式制备。进行两次PCR反应，获得人C3和CVF的部分编码序列。在第一次PCR中，pBS-HuC3-2用作模板，下列寡核苷酸用作引物HC3H5-3-F1(TCTGTGTGGCAGACCCCTTCGAGG-SEQ ID NO12)和HC3H5-4-R1 GAGAAGGCCTGTTCCTTTATCCGGATGGTAGAACCGGGTAC(SEQ ID NO18)。第二次PCR使用pCVF-FL3Δ作为模板，并且下列寡核苷酸作为引物HuCC3H5-4-F2 CCGGTTCTACCATCCGGATAAAGGAACAGGCCTTC(SEQ ID NO19)和HuC3H5-3-R2(CATCCATGACATAGATATCATTACCATCTTG-SEQID NO20)。将所得的两次PCR产物加入用HuC3H5-3-F1和HuC3H5-3-R2作为引物、这两次PCR片段作为模板的PCR反应中。第二次PCR反应之后，用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化产物。然后用NspV切割所述产物，并将其克隆入已经用相同酶切割、并经小牛肠碱性磷酸酶处理的pHC3-1550(-sig)。所得质粒称作pHC3-1496。然后如上所述地从这个质粒分离插入片段，并将其如上所述地克隆入pMT-Bip/V5-HisA。这个质粒称作pMB/HC3-1496。
下文描述了用于产生第五个杂合蛋白质HC3-1550/1617的质粒，在其中所述杂合蛋白质中用人C3序列替换了HC3-1550 C端的46个氨基酸残基。同样地，进行两次PCR反应来获得CVF和人C3的部分编码序列。在第一次PCR中，用下列两个引物扩增pHC3-1550HuC3H5-F1GGATGCCACTATGTCTATATTGGACATATCC(SEQ ID NO21)和HuC3H5-2R1 CCCGATGATGTAGCTGAGTTTATCTTTCGTGGG(SEQ ID NO22)。第二次PCR用pCVF-FL3Δ作为模板、HuC3H5-2F2(CCCACGAAAGATAAACTCAGCTACATCATCGGG-SEQ ID NO23)和HuC3H5-2-R2(AATTGGAGCTCCACCGCGGTGG-SEQID NO24)作为引物进行。第一次PCR之后，将片段加入到用HuC3H5-F1和HuC3H5-2-R2作为引物、两个PCR片段作为模板的第二次PCR反应中。紧接着该PCR后，所扩增的片段用Qiagen PCR纯化柱纯化、用BsrGI和NotI切割、并克隆入已经用相同酶切割的pHC3-1550(-sig)。测序所得质粒来确保序列正确。其称为pHC3-1550/1617。如上所述地分离插入片段，并如上所述地将其克隆入pMT-Bip/V5-HisA。这个质粒称作pMB/HC3-1550/1617。
在一些情况下，人C3部分在多于一个位点与CVF序列进行额外交换来产生对一个或多个本文所述目的有用的经修饰的C3。因此，产生了在多于一个区域中插入了CVF特异性序列、或者通过多种方法诱变了已知区域的经修饰的C3蛋白质。例如，除了与B因子形成物理性稳定的转变酶所需的位点以外，还可以期望改变人C3中的I因子切割位点。抵抗I因子的人C3突变体已经在以前由Fecke等人，1998(Fecke，W.，Farries，T.C.，D′Cruz，L.G.，Napper，C.M.和Harrison，R.A.(1998)Xenotransplantation 529-34，此处以其整体引入作为参考)进行了成功描述。例如，替换特定CVF功能所需要的选定序列使得人们可以设计新的C3衍生物，在所述新C3衍生物中分别存在或消除了特定子集的CVF功能(例如形成稳定的C3转变酶但不切割C5的C3衍生物或CVF衍生物)。由于不激活C5的经修饰的C3分子避免产生促炎C5a过敏毒素，所以其可能对治疗有特别的好处。
实施例2表达经修饰的人C3蛋白质蛋白质在果蝇S2细胞系统中生产，其中使用果蝇Bip信号序列来分泌蛋白质。简而言之，用Chen和Okayama的磷酸钙法(Chen，C.，和Okayama，H.(1987)Mol.Cell.Biol.7(8)，此处以其整体引入作为参考)将质粒pMB/HC3-1550、pMB/HC3-1504、pMB/HC3-1496、pMB/HC3-1550/1617和pMB/HC3-1348转染入果蝇S2细胞。用表达质粒和pCoBlast 19∶1(w∶w)比率的混合物转染S2细胞。转染之后，用杀稻瘟素(25μg/ml)筛选包含这两个质粒的细胞。为了表达，在无杀稻瘟素的无血清培养基中(Hi-Five加L-谷氨酰胺)培养1升转染细胞的培养物。当细胞密度达到5×106个细胞/毫升时，加入CuSO4至终浓度为25μM来诱导产生重组蛋白质。让培养物表达重组蛋白质4-5天。然后通过组合ANX、Sephacryl H-300和CM-FF层析来从培养基中纯化杂合蛋白质。
因为克隆C3基因的方法，所以存在一些由克隆载体编码的氨基酸(大约19个)，其在人C3 N端的N端。由于这些额外的氨基酸不影响蛋白质的活性，所以可以移去它们而没有不利影响。在一些情况下，可以优选存在至少两个氨基酸，其中所述氨基酸为将最终构建体克隆入表达载体所需要的限制性位点的人造产物。在多个实施方案中，可以使用多个信号序列，其中包括人C3的天然信号序列以及其它有效指导新生多肽进入内质网的任一其它信号序列。
可以使用其它表达载体，其中包括但不局限于杆状病毒感染的Sf9或HiFive细胞(其它昆虫表达载体)、CHO细胞、COS-7细胞(哺乳动物表达系统)、大肠杆菌(E.coli)、BHK、HEK293细胞以及多种酵母表达系统，其中包括Hanselula酵母表达系统。
实施施例3经修饰的人补体C3蛋白质的活性测试结果对已纯化的经修饰的人C3蛋白质杂合物进行下列多种功能分析。
补体消耗这个测试检测蛋白质在人(或其它)血清中消耗补体的能力。这个测试进行两个步骤。在第一步中，通常通过连续稀释(一般从低于一纳克/微升至大约320纳克/微升或者本测试所用的10微升中3.2μg)将目的蛋白质在缓冲液中稀释至预期浓度。然后将10微升份的经稀释蛋白质与未稀释血清混合。混合物在37℃孵育3小时，这使得蛋白质通过形成C3转变酶来激活补体。随后形成的转变酶能在血清中激活C3。然后用抗体致敏的绵羊红细胞稀释血清并与血清混合来测定剩余的补体活性量，其中所述抗体致敏的绵羊红细胞当其存在于血清中时会被补体轻易地裂解。允许这个反应进行30分钟，然后通过在冷缓冲液中稀释混合物来终止反应。离心细胞，并通过测定释放的血红蛋白来定量遭裂解的细胞。结果如图4和图9所示。
与预期相同，非常少量的CVF能够完全消耗人血清中的补体。800纳克的蛋白质HC3-1348和HC3-1496能够完全消耗10微升人血清。其它杂合蛋白质活性低一些，需要大约3-4微克蛋白质来部分消耗10微升人血清的补体。一种杂合蛋白质HC3-1550/1617明显不能在所测试浓度消耗补体。
意外的是，发现两种蛋白质(HC3-1550和HC3-1348)确实能够消耗豚鼠血清中的补体，尽管这个活性显著低于CVF。值得注意地，优选的实施方案HC3-1550、HC3-1504、HC3-1496和HC3-1348全部能消耗在人血清中的补体。
B因子活性测试这是测定杂合蛋白质激活B因子以及形成C3/C5转变酶能力的测试。转变酶的形成以将B因子切割成为Bb和Ba的功能来测定。在这个测试中，经纯化的杂合蛋白质与三倍过量的B因子和D因子(都经高度纯化)在存在镁的条件下于37℃孵育。在不同时间点，取出等份反应物，然后通过加入EDTA螯合镁来终止反应。反应产物进行非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色来显示蛋白质。通过将凝胶扫描入专门的计算机程序、并测定B因子和Bb带中的蛋白质数量来定量被转变的B因子数量。
图5和图10中的结果表明存在人C3时B因子被非常快地激活，这有两个原因。人C3能够非常迅速地结合B因子，这使其能够被D因子切割。然而，所得转变酶非常不稳定，并迅速分开，使得C3b能够结合更多的B因子。存在CVF的反应慢很多，这是CVF与B因子较低的亲和性和包含CVF的转变酶更高的稳定性的结果。B因子的转变在存在HC3-1504或HC3-1496时与存在CVF时非常相似。HC3-1550和HC3 1550/1617能够比CVF更快地转变B因子，但比C3b慢。这可能是转变酶比包含CVF的酶更加不稳定、但比包含C3b的转变酶更加稳定的结果。此外，有可能HC3-1550与B因子的起始结合远比CVF更快。最后，HC3-1348对B因子切割的支持不如其它所讨论的蛋白质。这可能是所得转变酶比包含C3b的酶更加稳定和起始结合B因子更慢这两者组合的结果。
C3转变酶活性测试这个测试测定包含杂合蛋白质的C3/C5转变酶通过切割掉C3a肽激活人C3的活性。为了进行这个测试，如上所述形成转变酶，并通过加入EDTA终止反应。然后转变酶与人C3混合，并将反应物置37℃孵育。在指示的时间移出等份，并通过与包含SDS和β-巯基乙醇的凝胶加样缓冲液混合来终止反应。SDS使蛋白质变性，而β-巯基乙醇还原蛋白质中半胱氨酸之间的二硫键。在还原条件下电泳之后，用考马斯蓝染料对凝胶染色，并如上所述定量C3α链和C3α’链的相对数量。小心地在每个反应中使用相同数量的转变酶。
图6和图11显示，在这个测试中CVF和HC3-1550都能够以大约相等的速率转变人C3。HC3-1504显著地比CVF更慢，但仍然能够在一小时内完全转变存在的C3量。HC3-1348和HC3-1496显示出以比CVF更快的速率转变C3，而HC3-1550/1617显示出先以高速率、大约10分钟后以变得较慢的速率转变C3。为了进一步研究这种现象，使用除了HC3-1504以外的所有蛋白质重复C3转变测试。在降低反应速率的尝试中，将存在的转变酶数量降低了1/5。这些结果如图7和图11中的插图所示。在这个测试中显而易见的是，HC3-1348和HC3-1496形成比CVF显著有效的转变酶。HC3-1550/1617形成最初有活性、但大约10分钟后显然变的大部分无活性的转变酶。
C5转变测试对C5转变活性的测试基本按照Petrella等人，(1987)J.Immunol.Methods 104(1-2)，159-172所述进行，其中所述文献在此处以整体引入作为参考。在这个测试中，用总共3微克蛋白质如上所述地形成C5转变酶。形成转变酶之后，通过加入终浓度5mM的EDTA来终止反应。然后，将5微升该反应物加入到25微升包含7微克溶于PBS的C5的反应物中。反应物在37℃孵育24小时，然后加入7微升Laemmli凝胶上样缓冲液、随后煮沸5分钟来终止反应。反应产物通过还原性SDS-PAGE分离，并用考马斯蓝染料对凝胶染色，并如上所述定量C5α链和C5α’链的相对数量。目前的蛋白质都不能形成有活性的C5转变酶。
对由H因子和I因子导致的蛋白质降解的测试基本根据Oran和Isenman((1999)J.Biol.Chem.274(8)，5120-5130的方法进行，其中所述文献在此处以整体引入作为参考。在这个方法中，在60微升总体积中将12微克每种蛋白质与4.3微克H因子和0.3微克I因子于37℃孵育。在指示时间，取出10微升等分，并通过加入5微升5×Laemli凝胶上样缓冲液来终止反应。反应产物通过在还原条件下在4-20％的梯度凝胶上进行SDS-PAGE分离。这些数据表明，存在H因子时所有蛋白质都能部分抵抗I因子的消化。在相似测试中，C3b几乎在0时间点完成消化。
实施例4局部或全身消耗补体的方法通过本文所公开方法产生的经修饰的人补体C3蛋白质如下地用来局部或全身消耗补体当经修饰的C3蛋白质局部施用至器官、组织、腔或者皮内施用时就可以实现局部消耗。这导致在区域中暂时和完全消耗补体。备选地，局部消耗可以使用特异性单克隆抗体，当其中所述单克隆抗体化学连接至经修饰的C3时，其能将经修饰的C3定位在特定组织、疾病位点或受感染细胞，从而导致在那个区域持续地消耗补体。
当全身施用经修饰的C3蛋白质例如静脉内或腹膜内施用时，就可以实现全身消耗。这导致全身暂时和完全消耗补体。这个方法可以用于再灌注损伤、冠状心脏手术(coronary heart surgery)、移植和/或全身性疾病，尤其是症状突发期间或者阵发性质期间。
经修饰的人C3蛋白质用于每个这些情形以及特定疾病阶段时可以相当地变化一些最有利的性质。例如，在那些希望立即但仅暂时消耗补体的情形下，优选具有更短的血浆半衰期和/或更低稳定性、但补体激活活性高的经修饰蛋白质。在治疗慢性疾病时，优选长血浆半衰期和/或高稳定性，即使伴随着其低或缓慢活性。进一步地，由于不激活C5的经修饰的C3分子避免产生促炎C5a过敏毒素，所以其对某些治疗特别有利。
实施例5治疗再灌注损伤的方法再灌注损伤的实例是在对阻滞的血管进行再开术(例如心脏病发作或缺血性发作之后)和用受体血液再灌注移植器官之后的组织损伤。对于阻塞的冠状动脉或者对于器官移植之后的再灌注，在许多情况下都希望在移植体再灌注之前或者打开阻滞的血管之前消耗补体。避免补体激活的能力可以避免其导致的组织损伤，从而使缺氧成为唯一剩余的组织损伤的主要来源。一般而言，再灌注期间补体激活造成的组织损伤比缺氧造成的组织损伤大两倍-即大约2/3的组织损伤归因于补体激活，而1/3归因于缺氧。因此，在再灌注之前通过消耗补体可以极大地减少再灌注损伤，这用本发明的实施方案是可能的。在这种情况下，优选使用最高活性的转变酶和使用高剂量。转变酶的稳定性不及其对慢性疾病那么重要。
总而言之，本发明这些实施方案的方法涉及全身施用有效量的经修饰的C3蛋白质，从而使得有足够的时间来消耗补体，以及随后进行手术。
实施例6增加基因疗法效力和/或效率的方法这个方法依赖于消耗补体来协助延长有用病毒在人体中存活。因为已经发现补体协助从人体中移去基因疗法中使用的病毒载体，所以希望在施用基因疗法载体之前减少循环补体的数量。这可以局部或全身进行，取决于所用基因疗法的类型。
方法涉及全身地施用或者向进行基因治疗的局部区域施用有效量的经修饰的C3蛋白质，从而使得有时间进行补体消耗，以及随后进行基因治疗。
实施例7增加递送治疗剂(例如化疗剂)或诊断剂的方法。
为了增加流向施用治疗剂区域的血流量，将经修饰的C3蛋白质以化学方法与对所选组织具亲和性的单克隆抗体相连。在这个实例中，经修饰的C3是形成高度活性的C3/C5转变酶的成员之一。经修饰的C3/抗体靶向组织，从而在该区域产生局部补体激活，从而导致归因于补体激活的血管渗透性。因为到达靶点的血液持续提供新的、未激活的补体，所以只要活性的转变酶/抗体复合体结合于靶点，血管通透性就会持续。
对于这个方法在治疗肺癌期间的用途，向肺癌患者施用经修饰的C3蛋白质-单克隆抗体杂合物，其中使用的单克隆抗体识别肺特异性抗原。抗体与肺组织结合，并局部激活补体。这增加了肺中的血管通透性，从而允许化学治疗剂更加有效率和更加有效地作用肺癌。如上所述，这个方法使得可以持续地局部激活补体，进而使血管通透性可以持续地局部提高。
实施例8治疗类风湿性关节炎、狼疮和其它自身免疫或免疫复合体疾病的方法这个方法以几个疼痛和炎症起因于局部区域补体激活的病症之一的类风湿性关节炎作为例子。为了治疗，全身或局部地施用经修饰的C3蛋白质，通过消耗补体来减少补体反应/激活。这可以降低疾病症状和疾病进程。其也利于将间插性消耗与较长期降低补体系统活性组合，尤其是疾病症状阵发恶化时更有利。进一步地，这个方法可以用于其它具循环免疫复合体的疾病，例如狼疮和其它自身免疫疾病。
例如，当产生补体激活性自身抗体、并且其针对身体的自身蛋白质时，疾病的影响主要是因为抗体与靶点结合、进而导致补体激活和组织损伤以及其它对正常功能的干扰。重症肌无力是这种类型疾病的实例。自身抗体与神经进入其中与肌肉接触的神经肌肉终板结合。激活补体并封闭神经递质，从而产生麻痹。持续地或在疾病恶化期间使用本发明这个实施方案的方法，全身消耗补体，可以显著地降低其症状及其进程。
实施例9选择经修饰的C3蛋白质的方法多种经修饰的C3蛋白质对于不同疾病和治疗方法有用。因此，分析本发明实施方案经修饰的C3蛋白质的功能性质并因此使用它们是有用的。采用下列方法来分析实施例2中产生的经纯化和修饰的C3蛋白质的功能。可以使用本文所述方法以及其它本领域技术人员已知的方法。
测定转变酶活性的测试。除了下文提到的特定测试以外，筛选还可采用两种针对血清补体活性消耗和旁观者裂解诱导作用的溶血性测试。
补体消耗测试。为了测定经修饰的C3蛋白质的抗补体(补体消耗)活性，将小体积的人血清与CVF或杂合蛋白质在37℃和5微克每毫升的蛋白质浓度下孵育三小时或更短时间，使蛋白质消耗补体。随后使用本领域技术人员已知的方法用致敏的绵羊红细胞测定剩余的补体溶血活性，其中所述方法包括Cochrane等人，1970(Cochrane等人，1970，J.Immunol117630-4，此处以其整体引入作为参考)的方法。
旁观者裂解测试。旁观者裂解测试如下进行，即用20微升正常豚鼠血清在37℃和20微升5微克每毫升浓度的CVF或杂合蛋白质以及20微升豚鼠红细胞(5×108每毫升)孵育。CVF或杂合蛋白质参与C5的液相激活，从而导致红细胞裂解。因此，上清中存在血红蛋白就表明C5活化。反应在37℃孵育30分钟，然后通过加入1毫升冷缓冲液来终止。离心之后，用分光光度计(Vogel，C.W.，和M üller-Eberhard，H.J.(1984)J.Immunol.Methods 73(1)，203-220，此处以其整体引入作为参考)测定释放的血红蛋白。
C3转变酶形成/B因子激活。为了检测B因子切割成为Ba和Bb，杂合蛋白质(1μM)与三倍摩尔过量的B因子和0.5μMD因子在存在MgC12的37℃下孵育高达24小时。反应混合物如下进行分析，即通过在非还原性条件下在7.5％(质量/体积)的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳来监测B因子的消失和切割产物Ba和Bb的出现。如果需要的话，随后可以进行western印迹来检测Ba和Bb切割片段。对照可包括天然的CVF、CVF前体、眼镜蛇C3、眼镜蛇iC3、人C3、人iC3、C3b和EDTA(Vogel和Müller-Eberhard，1982，J.Biol.Chem.2578292-9，此处以其整体引入作为参考)。
C3切割活性。为了检测C3切割活性，用杂合蛋白质和人B因子和D因子如本文所述地预先形成C3转变酶(参考“C3转变酶形成/B因子激活”)。通过加入EDTA终止转变酶形成，并加入纯化的人C3。反应混合物在37℃下孵育1小时或者其它任意合适的时间。取出等份，并立即转移进入冰水浴来终止进一步的C3激活。通过在还原条件下在7.5％(质量/体积)的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳反应产物，通过C3α链的消失和C3α，链的出现来监测C3切割。如果需要的话，随后用抗C3的抗血清进行western印迹。对照包括天然的CVF、CVF前体、和人以及眼镜蛇iC3或C3b(Vogel和Müller-Eberhard，1982，J.Biol.Chem.2578292-9，此处以其整体引入作为参考)。
C5切割测试。C5切割测试用经纯化的人C5作为底物按照上述对C3切割的测试进行(Petrella等人，1987，J.Immunol.1644742-4751，此处以其整体引入作为参考)。例如见图12。
转变酶稳定性的测试。如上所述使用杂合蛋白质和纯化的人B因子和D因子预先形成双分子转变酶。加入EDTA以后，混合物在37℃孵育，并在24小时或者更短时间(如果合适的话)期间移出等份，立即将每个等份放置在冰水浴中。然后通过上述C3切割测试来测定C3转变酶活性。随着时间过去，C3切割活性下降，计算多种转变酶自发衰变-解离的半衰期。如果这个测试没有足够数量的杂合蛋白质，那么就用荧光三肽叔丁氧羰基亮氨酰-甘氨酰-精氨酰-氨甲基香豆素测定酶活性(Caporale，L.H.，Gabaer，S.S.，Kell，W.和Gotze，O.1981 J.Immunol.126(5)，1963-1965，此处以其整体引入作为参考)。
H因子结合的测试。使用ELISA测试来测定H因子与杂合蛋白质的结合。将杂合蛋白质吸附至微量滴定板上。在用卵清蛋白和BSA封闭之后，加入10微克每毫升经纯化的人H因子，并在室温孵育30分钟。洗涤之后，先用抗H因子的抗体、随后用适当的磷酸酶连接的二级抗体检测所结合的H因子。如果H因子能够结合至蛋白质，那么就可以观察到适当的颜色变化。对照包括天然的CVF、CVF前体、眼镜蛇和人C3以及眼镜蛇和人iC3(Alsenz等人，1992，Dev.Comp.Immunol.1663-76，此处以其整体引入作为参考)。
I因子切割测试。杂合蛋白质与纯化的人H因子和I因子在37℃孵育数小时。随后通过在还原条件下进行4-20％(质量/体积)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析反应物。I因子活性通过105 kDaα’链条带强度的下降和分子量为37和40kDa条带的出现测定。如果需要的话，随后用抗CVF和/或抗C3的抗体进行western印迹。备选地，杂合蛋白质用iodogen法(Fraker和Speck，1978)标记125I。进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以后通过放射自显影(Lambris等人，1996，J.Immunol.1564821-32，此处以其整体引入作为参考)检测切割产物。参见例如图12。
免疫原性测试。多种方法可以用来分析免疫原性，其中包括但不局限于皮肤试验、在已经遗传地设计为具有人免疫系统的转基因动物中测试经修饰的C3蛋白质、体外方法，其中包括用在此类转基因动物中产生的血清进行RIA测试、放射免疫沉淀分析、ELISA测定、电化学发光和表面胞质共振。此外，用小鼠、大鼠或豚鼠的C3和CVF序列构建了小鼠、大鼠或豚鼠的一些蛋白质类似物。将这些注入适当动物，收集血清，并对产生的抗杂合蛋白质的抗体进行分析。
实施例10测定血浆半衰期的方法影响经修饰的C3蛋白质的血浆半衰期的因素有很多，其中包括但不局限于免疫系统产生的特定抗体、在血浆中循环的蛋白酶、非特异性免疫反应和特异调节因子例如H因子和I因子。为了使经修饰的C3蛋白质能够激活和随后消耗补体，优选的C3蛋白质需在人血浆中持留至少最小量的时间。因此，鉴定经修饰的C3蛋白质的血浆半衰期，从而确定它们对于治疗某些疾病多么有用是令人感兴趣的。
这个方法以三种方式测定了经修饰的C3蛋白质在血浆中的稳定性。然而，需要理解的是，可以使用这些方法中的一种或者全部以及本领域技术人员已知的任意其它方法。
第一种方法在体外测定血清中的稳定性。从患者全血分离人血清。向血清中加入经修饰的C3蛋白质不同浓度的等份，并进行孵育。在多个时间间隔移出血清等份，并在ELISA测试中用特异针对C3的单克隆抗体测定持留的经修饰的C3数量。
第二种方法允许鉴定在人源化动物血清中的稳定性。向动物施用经修饰的C3蛋白质，并在一段时间后取血样。在ELISA测试中用针对蛋白质的特异抗体测定经修饰的C3蛋白质数量。
第三种方法允许鉴定在人类患者中的稳定性。向患者施用经修饰的C3蛋白质，并随时间移出血样。用ELISA测试鉴定经修饰的C3蛋白质数量。这将清楚地表明经修饰的C3蛋白质在患者血浆中循环多久。
在一些实施方案中，所用抗体不需要特异针对经修饰的C3。例如，可以测试识别正常C3的抗体，并用其来在ELISA方法中鉴定经修饰的C3。
实施例11用表面胞质共振测定的经修饰的人补体C3蛋白质的C3转变酶形成表2显示补体蛋白质与C3、CVF和重组人C3/CVF蛋白质的相对结合情况。在所有情况下，数字越高表明蛋白质相互作用越紧密。将蛋白质(C3b等)结合在BIACORE CHIPTM上，然后与补体因子接触。通过表面胞质共振测定结合至芯片(进而与经修饰的C3蛋白质结合)的每一补体因子数量。结果表明1)重组蛋白质都不能与C5结合，这与不能形成能够切割C5的转变酶一致。2)虽然CVF不结合H因子，但两种蛋白质都结合H因子。H因子是一种能够解离C3b，Bb转变酶复合体、并指导第二种补体蛋白质I因子通过切割灭活C3b的调节蛋白质。3)存在D因子和镁离子时，蛋白质与B因子的亲和性和蛋白质能够形成C3转变酶的速率(通过它们介导B因子切割的能力进行测定，见图10)近似成比例。HC3-1550和HC3-1348都被切割，但比C3b更慢。由于天然的CVF没有H或I位点，所以H因子或I因子完全不切割CVF。有趣的是，虽然双链分子的重组CVF具有2个或3个I位点，但其仍然不被I因子切割。
表2补体蛋白质与C3、CVF和重组的人C3/CVF蛋白质的相对结合情况。
结合的蛋白质量(RU)-MW校正的第二栏
表3显示由经修饰的人补体C3蛋白质形成的C3转变酶在25℃下、在BIACORE机器上用表面胞质共振测定的稳定性。结果表明，两种蛋白质都能够形成基本比包含C3b的转变酶更加稳定的C3转变酶。表也表明，包含HC3-1348的转变酶确实比包含CVF的酶更加稳定。这些结果与其它在更高温度下半衰期的测定结果一致，在其中所述其它测定结果中显示CVF的半衰期为37℃7小时，而C3b半衰期为37℃1.5分钟。
表3C3转变酶的形成
实施例12经修饰的人补体C3蛋白质的B因子切割图10中的B因子切割图显示在存在镁离子和D因子的情况下经修饰的人补体C3b蛋白质介导B因子切割能力的时间过程。这可以用来测定蛋白质形成C3/C5转变酶的能力。这个测试中需要注意的是，C3b非常有效地形成转变酶，这即因为其在存在D因子和镁(见实施例11中的数据)时非常有效地与B因子结合，又因为所得复合体非常不稳定。CVF、HC3-1496和HC3-1504都以大约相同的速率形成转变酶，而HC3-1550和HC3-1550/1617在它们形成转变酶的能力上介于C3b和CVF之间。HC3-1348非常慢地结合B因子。最可能的解释是组合下列两个原因，即一旦形成则转变酶半衰期更长和杂合蛋白质与B因子更低的亲和性。
实施例13经修饰的人补体C3蛋白质的C3切割图11显示转变酶切割C3的能力，并且显示切割反应的时间过程。插图是用主图中所用的20％转变酶进行的时间过程。结果表明，CVF和HC3-1550形成的转变酶在C3切割上效率大致相同，而HC3-1348和HC3-1496形成的转变酶在C3切割上都比CVF大约5倍地更加有效。有趣的是，包含HC3-1550/1617的转变酶表现得非常不稳定，并在约10分钟后不支持C3切割。
实施例14经修饰的人补体C3蛋白质的补体消耗图9中补体消耗图中的数据表明，除了HC3-1550/1617外所有蛋白质都能消耗补体，虽然效率不同。HC3-1550和HC3-1504在消耗补体上都非常无效，而HC3-1496和HC3-1348则能非常有效地消耗补体，虽然还不如天然或重组的CVF有效。在以前的申请中，HC3-1348称为HC3-1325，但随后的替换绘图表明替换发生在1348位而非1325位。
总而言之，虽然HC3-1496仅比HC3-1504多插入了8个氨基酸，但由于其在补体消耗和C3切割上更像HC3-1348、而在B因子切割上更像HC3-1504，所以HC3-1496是有趣的蛋白质。其和HC3-1504或CVF一样形成转变酶，但所得转变酶在切割C3上更加有效。
HC31550/1617通过用CVF区域替换从C3的1550至末端的区域、然后移出最后46个氨基酸并用C3替换它们来制备。这个嵌合分子不表现出补体消耗作用、和HC3-1550一样形成C3转变酶、并且形成的C3转变酶几乎和HC3-550一样活跃、但具有明显更短的半衰期。
实施例15在经修饰的C3蛋白质中产生变体的方法产生具有利特性的经修饰的C3蛋白质的变体。有利的意思是指变体增强了蛋白质的一个或多个性质，其中包括但不局限于C3转变酶活性、血清去补体作用、B因子结合、C3切割、Bb的结合和C3的结合。变体可以在每个区域包括一个或多个突变，而且可以包括一个或多个氨基酸。下文列出一些特定变体由于C端涉及C3转变酶的稳定性，所以在任意经修饰的C3蛋白质的C端(氨基酸1617之后)产生突变。突变可以是插入、缺失和替换。但是，突变优选替换。突变稳定了C3转变酶。C端突变的实例包括但不局限于在位点1633、1654和1658处的突变。除了影响构象的氨基酸改变以外，实施方案中还包括非保守的和保守的突变。然而，优选产生非保守性氨基酸改变的突变。
CVF和人C3之间在显示为负责转变酶活性产生大变化的1496-1504(8个氨基酸残基)跨距内有三个变化。因此，任何经修饰的C3蛋白质在位置1496和1504之间的突变都包括导致转变酶的切割C3和/或在去补体化血清中的活性增加。突变可以是所述区域内的一个或多个氨基酸变化。优选地，突变是替换那个区域内的一个或多个氨基酸，尤其是产生非保守性氨基酸变化的突变。
在任何经修饰的C3蛋白质的1348和1496位置之间产生突变来修饰蛋白质结合B因子的能力(具体而言是结合C3b和B因子的能力)，其中优选产生B因子结合能力增加的修饰。CVF的全部区域都转换成C3，反之亦然。更多的突变包含产生氨基酸替换。更加具体而言，对CVF和C3进行1367-1379的区域转换，并且替换这个区域内的特定氨基酸。
在CVF的1550和C3的1570-1584周围区域中的序列变化可能负责C3转变酶从结合Bb或结合靶向的C3分子切割C3。使用CVF/眼镜蛇C3替换，鉴定出一连串4个氨基酸残基(Q1550G、E1554R、P1556A和R1557Q-位置根据CVF序列编号计数)，其产生具更低C3切割活性的蛋白质。因此，在1570-1584位置的氨基酸产生的变体导致经修饰的C3蛋白质在切割C3上的C3转变酶活性增加。变体优选地是替换那个区域内的一个或多个氨基酸。
上述多种方法和技术提供了许多实施本发明的方法。当然，需要理解的是，根据本文描述的任意特定实施方案不需要实现所有目的和优点。因此，例如本领域技术人员可以意识到，方法可以以实现或最优化一个或一类本文所教导的优点的方式进行，而不需要实现本文所教导或建议的其它目的或优点。
此外，技术人员将意识到多种性质可以从不同实施方案相互交换。类似地，本领域常规技术人员在执行方法时，可以根据本文所述原理组合和/或交换上文讨论的多种性质和步骤以及每个此类性质或步骤其它已知的等同物。本文引用的每个专利、杂志参考文献等都在此处以其整体引入作为参考。
虽然已经在某些实施方案和实施例中公开了本发明，但需要本领域技术人员理解的是，本发明超出特定公开的实施方案延伸至其它备选实施方案和/或其用途、明显改变及其等同物。因此，本发明不受限于本文优选实施方案的特定公开内容。
序列表<110>夏威夷大学<120>具眼镜蛇毒因子样功能的人补体C3衍生物<130>UOH.002VPC<150>US 60/567,069<151>2004-04-30<150>US 60/653,247<151>2005-02-14<150>US 60/667,352<151>2005-03-30<160>24<170>用于Windows的FastSEQ版本4.0<210>1<211>5067<212>DNA<213>
<220>人(homo sapiens)<221>CDS<222>(61)...(5052)<400>1ctcctcccca tcctctccct ctgtccctct gtccctctga ccctgcactg tcccagcacc 60atg gga ccc acc tca ggt ccc agc ctg ctg ctc ctg cta cta acc cac108Met Gly Pro Thr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr His1 5 10 15ctc ccc ctg gct ctg ggg agt ccc atg tac tct atc atc acc ccc aac156Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn20 25 30atc ttg cgg ctg gag agc gag gag acc atg gtg ctg gag gcc cac gac204Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp35 40 45gcg caa ggg gat gtt cca gtc act gtt act gtc cac gac ttc cca ggc252Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly50 55 60aaa aaa cta gtg ctg tcc agt gag aag act gtg ctg acc cct gcc acc300Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr65 70 75 80aac cac atg ggc aac gtc acc ttc acg atc cca gcc aac agg gag ttc348Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe85 90 95
aag tca gaa aag ggg cgc aac aag ttc gtg acc gtg cag gcc acc ttc396Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe100 105110ggg acc caa gtg gtg gag aag gtg gtg ctg gtc agc ctg cag agc ggg444Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly115 120 125tac ctc ttc atc cag aca gac aag acc atc tac acc cct ggc tcc aca492Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr130 135 140gtt ctc tat cgg atc ttc acc gtc aac cac aag ctg cta ccc gtg ggc540Val Leu Tyr Arg Ile Phe Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly145 150 155 160cgg acg gtc atg gtc aac att gag aac ccg gaa ggc atc ccg gtc aag588Arg Thr Val Met Val Asn Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys165 170 175cag gac tcc ttg tct tct cag aac cag ctt ggc gtc ttg ccc ttg tct636Gln Asp Ser Leu Ser Ser Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser180 185 190tgg gac att ccg gaa ctc gtc aac atg ggc cag tgg aag atc cga gcc684Trp Asp Ile Pro Glu Leu Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala195 200 205tac tat gaa aac tca cca cag cag gtc ttc tcc act gag ttt gag gtg732Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val210 215 220aag gag tac gtg ctg ccc agt ttc gag gtc ata gtg gag cct aca gag780Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu225 230 235 240aaa ttc tac tac atc tat aac gag aag ggc ctg gag gtc acc atc acc828Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr245 250 255gcc agg ttc ctc tac ggg aag aaa gtg gag gga act gcc ttt gtc atc876Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile260 265 270ttc ggg atc cag gat ggc gaa cag agg att tcc ctg cct gaa tcc ctc924Phe Gly Ile Gln Asp Gly Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu275 280 285aag cgc att ccg att gag gat ggc tcg ggg gag gtt gtg ctg agc cgg972Lys Arg Ile Pro Ile Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg290 295 300aag gta ctg ctg gac ggg gtg cag aac ctc cga gca gaa gac ctg gtg 1020Lys Val Leu Leu Asp Gly Val Gln Asn Leu Arg Ala Glu Asp Leu Val305 310 315 320ggg aag tct ttg tac gtg tct gcc acc gtc atc ttg cac tca ggc agt 1068Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser325 330 335gac atg gtg cag gca gag cgc agc ggg atc ccc atc gtg acc tct ccc 1116
Asp Met Val Gln Ala Glu Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro340 345 350tac cag atc cac ttc acc aag aca ccc aag tacttc aaa cca gga atg 1164Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met355 360 365ccc ttt gac ctc atg gtg ttc gtg acg aac cct gat ggc tct cca gcc1212Pro Phe Asp Leu Met Val Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala370 375 380tac cga gtc ccc gtg gca gtc cag ggc gag gac act gtg cag tct cta1260Tyr Arg Val Pro Val Ala Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu385 390 395 400acc cag gga gat ggc gtg gcc aaa ctc agc atc aac aca cac ccc agc1308Thr Gln Gly Asp Gly Val Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser405 410 415cag aag ccc ttg agc atc acg gtg cgc acg aag aag cag gag ctc tcg1356Gln Lys Pro Leu Ser Ile Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser420 425 430gag gca gag cag gct acc agg acc atg cag gct ctg ccc tac agc acc1404Glu Ala Glu Gln Ala Thr Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Set Thr435 440 445gtg ggc aac tcc aac aat tac ctg cat ctc tca gtg cta cgt aca gag1452Val Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu450 455 460ctc aga ccc ggg gag acc ctc aac gtc aac ttc ctc ctg cga atg gac1500Leu Arg Pro Gly Glu Thr Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp465 470 475 480cgc gcc cac gag gcc aag atc cgc tac tac acc tac ctg atc atg aac1548Arg Ala His Glu Ala Lys Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn485 490 495aag ggc agg ctg ttg aag gcg gga cgc cag gtg cga gag ccc ggc cag1596Lys Gly Arg Leu Leu Lys Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln500 505 510gac ctg gtg gtg ctg ccc ctg tcc atc acc acc gac ttc atc cct tcc1644Asp Leu Val Val Leu Pro Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser515 520 525ttc cgc ctg gtg gcg tac tac acg ctg atc ggt gcc agc ggc cag agg1692Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg530 535 540gag gtg gtg gcc gac tcc gtg tgg gtg gac gtc aag gac tcc tgc gtg1740Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val545 550 555 560ggc tcg ctg gtg gta aaa agc ggc cag tca gaa gac cgg cag cct gta1788Gly Set Leu Val Val Lys Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val565 570 575cct ggg cag cag atg acc ctg aag ara gag ggt gac cac ggg gcc cgg1836Pro Gly Gln Gln Met Thr Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg
580 585 590gtg gta ctg gtg gcc gtg gac aag ggc gtg ttc gtg ctg aat aag aag1884Val Val Leu Val Ala Val Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys595 600 605aac aaa ctg acg cag agt aag atc tgg gac gtg gtg gag aag gca gac1932Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp610 615 620atc ggc tgc acc ccg ggc agt ggg aag gat tac gcc ggt gtc ttc tcc1980Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser625 630 635 640gac gca ggg ctg acc ttc acg agc agc agt ggc cag cag acc gcc cag2028Asp Ala Gly Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln645 650 655agg gca gaa ctt cag tgc ccg cag cca gcc gcc cgc cga cgc cgt tcc2076Arg Ala Glu Leu Gln Cys Pro Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser660 665 670gtg cag ctc acg gag aag cga atg gac aaa gtc ggc aag tac ccc aag2124Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys675 680 685gag ctg cgc aag tgc tgc gag gac ggc atg cgg gag aac ccc atg agg2172Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg690 695 700ttc tcg tgc cag cgc cgg acc cgt ttc atc tcc ctg ggc gag gcg tgc2220Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys705 710 715 720aag aag gtc ttc ctg gac tgc tgc aac tac atc aca gag ctg cgg cgg2268Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg725 730 735cag cac gcg cgg gcc agc cac ctg ggc ctg gcc agg agt aac ctg gat2316Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp740 745 750gag gac atc att gca gaa gag aac atc gtt tcc cga agt gag ttc cca2364Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro755 760 765gag agc tgg ctg tgg aac gtt gag gac ttg aaa gag cca ccg aaa aat2412Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn770 775 780gga atc tct acg aag ctc atg aat ata ttt ttg aaa gac tcc atc acc2460Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr785 790 795 800acg tgg gag att ctg gct gtc agc atg tcg gac aag aaa ggg atc tgt2508Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys805 810 815gtg gca gac ccc ttc gag gtc aca gta atg cag gac ttc ttc atc gac2556Val Ala Asp Pro Phe Glu Val Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp820 825 830
ctg cgg cta ccc tac tct gtt gtt cga aac gag cag gtg gaa atc cga2604Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg835 840 845gcc gtt ctc tac aat tac cgg cag aac caa gag ctc aag gtg agg gtg2652Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val850 855 860gaa cta ctc cac aat cca gcc ttc tgc agc ctg gcc acc acc aag agg2700Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg865 870 875 880cgt cac cag cag acc gta acc atc ccc ccc aag tcc tcg ttg tcc gtt2748Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val885 890 895cca tat gtc atc gtg ccg cta aag acc ggc ctg cag gaa gtg gaa gtc2796Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val900 905 910aag gct gcc gtc tac cat cat ttc atc agt gac ggt gtc agg aag tcc2844Lys Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser915 920 925ctg aag gtc gtg ccg gaa gga atc aga atg aac aaa act gtg gct gtt2892Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val930 935 940cgc acc ctg gat cca gaa cgc ctg ggc cgt gaa gga gtg cag aaa gag2940Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu945 950 955 960gac atc cca cct gca gac ctc agt gac caa gtc ccg gac acc gag tct2988Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser965 970 975gag acc aga att ctc ctg caa ggg acc cca gtg gcc cag atg aca gag3036Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu980 985 990gat gcc gtc gac gcg gaa cgg ctg aag cac ctc att gtg acc ccc tcg3084Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser995 10001005ggc tgc ggg gaa cag aac atg atc ggc atg acg ccc acg gtc atc gct3132Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala101010151020gtg cat tac ctg gat gaa acg gag cag tgg gag aag ttc ggc cta gag3180Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu1025103010351040aag cgg cag ggg gcc ttg gag ctc atc aag aag ggg tac acc cag cag3228Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln104510501055ctg gcc ttc aga caa ccc agc tct gcc ttt gcg gcc ttc gtg aaa cgg3276Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg106010651070
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Gly Tyr Thr Cys Glu Lys Arg Ala Lys Tyr Ile Gln Glu Gly Asp Ala690 695 700tgt aag gct gcc ttc ctt gaa tgc tgt cgc tac atc aag ggg gtc cga2160Cys Lys Ala Ala Phe Leu Glu Cys Cys Arg Tyr Ile Lys Gly Val Arg705 710 715gat gaa aac caa cgg gag agc gag ttg ttt ctg gca aga gat gat aat2208Asp Glu Asn Gln Arg Glu Ser Glu Leu Phe Leu Ala Arg Asp Asp Asn720 725 730 735gaa gat ggt ttc ata gca gat agt gat atc atc tca agg tct gat ttc2256Glu Asp Gly Phe Ile Ala Asp Ser Asp Ile Ile Ser Arg Ser Asp Phe740 745 750ccc aag agt tgg ttg tgg cta aca aag gac ttg acc gag gag cct aac2304Pro Lys Ser Trp Leu Trp Leu Thr Lys Asp Leu Thr Glu Glu Pro Asn755 760 765agt caa ggg att tca agc aag aca atg tct ttt tat ctg agg gat tcc2352Ser Gln Gly Ile Ser Ser Lys Thr Met Ser Phe Tyr Leu Arg Asp Ser770 775 780atc aca acc tgg gtg gtg ctg gct gta agc ttt aca ccc acc aaa ggg2400Ile Thr Thr Trp Val Val Leu Ala Val Ser Phe Thr Pro Thr Lys Gly785 790 795atc tgt gtg gct gaa cct tat gaa ata aga gtc atg aaa gtc ttc ttc2448Ile Cys Val Ala Glu Pro Tyr Glu Ile Arg Val Met Lys Val Phe Phe800 805 810 815att gat ctt caa atg cca tat tca gta gtg aag aat gag cag gtg gag2496Ile Asp Leu Gln Met Pro Tyr Ser Val Val Lys Asn Glu Gln Val Glu820 825 830att cga gct att ctg cac aac tac gtt aac gag gat att tat gtg cga2544Ile Arg Ala Ile Leu His Asn Tyr Val Asn Glu Asp Ile Tyr Val Arg835 840 845gtg gaa ctg tta tac aac cca gcc ttc tgc agt gct tcc aca aaa gga2592Val Glu Leu Leu Tyr Asn Pro Ala Phe Cys Ser Ala Ser Thr Lys Gly850 855 860caa aga tac cga cag cag ttc cca att aaa gcc ctg tcc tcc aga gca2640Gln Arg Tyr Arg Gln Gln Phe Pro Ile Lys Ala Leu Ser Ser Arg Ala865 870 875gta ccg ttt gtg ata gtc cca tta gag caa gga ttg cat gat gtt gag2688Val Pro Phe Val Ile Val Pro Leu Glu Gln Gly Leu His Asp Val Glu880 885 890 895att aaa gca agt gtc cag gaa gcg ttg tgg tca gac ggt gtg agg aag2736Ile Lys Ala Ser Val Gln Glu Ala Leu Trp Ser Asp Gly Val Arg Lys900 905 910aaa ctg aaa gtt gta cct gaa ggg gta cag aaa tcc att gtg act att2784Lys Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Val Gln Lys Ser Ile Val Thr Ile915 920 925gtt aaa ctg gac cca agg gca aaa gga gtt ggt gga aca cag cta gaa2832Val Lys Leu Asp Pro Arg Ala Lys Gly Val Gly Gly Thr Gln Leu Glu
930 935 940gtg atc aaa gcc cgc aaa tta gat gac aga gtg cct gac aca gaa att2880Val Ile Lys Ala Arg Lys Leu Asp Asp Arg Val Pro Asp Thr Glu Ile945 950 955gaa acc aag att atc atc caa ggt gac cct gtg gct cag att att gaa2928Glu Thr Lys Ile Ile Ile Gln Gly Asp Pro Val Ala Gln Ile Ile Glu960 965 970 975aac tca att gat gga agt aaa ctc aac cat ctc att atc act cct tct2976Asn Ser Ile Asp Gly Ser Lys Leu Asn His Leu Ile Ile Thr Pro Ser980 985 990ggc tgt ggg gag caa aat atg atc cgc atg gcc gca cca gtt att gcc3024Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Arg Met Ala Ala Pro Val Ile Ala995 10001005acc tac tac ctg gac acc aca gag cag tgg gag act ctc ggc ata aat3072Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Thr Glu Gln Trp Glu Thr Leu Gly Ile Asn101010151020cgc agg act gaa gct gtc aat cag atc gtg act ggt tat gcc cag cag3120Arg Arg Thr Glu Ala Val Asn Gln Ile Val Thr Gly Tyr Ala Gln Gln102510301035atg gtg tac aag aaa gca gat cat tcc tat gca gca ttt aca aac cgt3168Met Val Tyr Lys Lys Ala Asp His Set Tyr Ala Ala Phe Thr Asn Arg1040104510501055gca tct agt tct tgg cta aca gca tat gtc gta aaa gtc ttt gcc atg3216Ala Ser Ser Ser Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ala Met106010651070gct gcc aaa atg gta gca ggc att agt cat gaa atc att tgt gga ggt3264Ala Ala Lys Met Val Ala Gly Ile Ser His Glu Ile Ile Cys Gly Gly107510801085gtg agg tgg ctg att ctg aac agg caa caa cca gat gga gcg ttc aaa3312Val Arg Trp Leu Ile Leu Asn Arg Gln Gln Pro Asp Gly Ala Phe Lys109010951100gaa aat gcc cct gta ctt tct gga aca atg cag gga gga att caa ggt3360Glu Asn Ala Pro Val Leu Ser Gly Thr Met Gln Gly Gly Ile Gln Gly110511101115gct gaa gaa gaa gta tat tta aca gct ttc att ctg gtt gcg ttg ttg3408Ala Glu Glu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Phe Ile Leu Val Ala Leu Leu1120112511301135gaa tcc aaa aca atc tgc aat gac tat gtc aat agt cta gac agc agc3456Glu Ser Lys Thr Ile Cys Asn Asp Tyr Val Asn Ser Leu Asp Ser Ser114011451150atc aag aag gcc aca aat tat tta ctc aaa aag tat gag aaa ctg caa3504Ile Lys Lys Ala Thr Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Tyr Glu Lys Leu Gln115511601165agg cct tac act aca gcc ctc aca gcc tat gct ttg gct gct gca gac3552Arg Pro Tyr Thr Thr Ala Leu Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Ala Ala Asp117011751180
caa ctc aat gat gac agg gta ctc atg gca gca tca aca gga agg gat3600Gln Leu Asn Asp Asp Arg Val Leu Met Ala Ala Ser Thr Gly Arg Asp118511901195cat tgg gaa gaa tac aat gct cac acc cac aac att gaa ggc act tcc3648His Trp Glu Glu Tyr Asn Ala His Thr His Asn Ile Glu Gly Thr Ser1200120512101215tat gcc ttg ttg gcc ctg ctg aaa atg aag aaa ttt gat caa act ggt3696Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Lys Met Lys Lys Phe Asp Gln Thr Gly122012251230ccc ata gtc aga tgg ctg aca gat cag aat ttt tat ggg gaa aca tat3744Pro Ile Val Arg Trp Leu Thr Asp Gln Asn Phe Tyr Gly Glu Thr Tyr123512401245gga caa acc caa gca aca gtt atg gca ttt caa gct ctt gct gaa tat3792Gly Gln Thr Gln Ala Thr Val Met Ala Phe Gln Ala Leu Ala Glu Tyr125012551260gag att cag atg cct acc cat aag gac tta aac tta gat att act att3840Glu Ile Gln Met Pro Thr His Lys Asp Leu Asn Leu Asp Ile Thr Ile126512701275gaa ctg cca gat cga gaa gta cct ata agg tac aga att aat tat gaa3888Glu Leu Pro Asp Arg Glu Val Pro Ile Arg Tyr Arg Ile Asn Tyr Glu1280128512901295aat gct ctc ctg gct cgg aca gta gag acc aaa ctc aac caa gac atc3936Asn Ala Leu Leu Ala Arg Thr Val Glu Thr Lys Leu Asn Gln Asp Ile130013051310act gtg aca gca tca ggt gat gga aaa gca aca atg acc att ttg aca3984Thr Val Thr Ala Ser Gly Asp Gly Lys Ala Thr Met Thr Ile Leu Thr131513201325ttc tat aac gca cag ttg cag gag aag gca aat gtt tgc aat aaa ttt4032Phe Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Glu Lys Ala Asn Val Cys Asn Lys Phe133013351340cat ctt aat gtt tct gtt gaa aac atc cac ttg aat gca atg gga gcc4080His Leu Asn Val Ser Val Glu Asn Ile His Leu Asn Ala Met Gly Ala134513501355aag gga gcc ctc atg ctc aag atc tgc aca agg tat ctg gga gaa gtt4128Lys Gly Ala Leu Met Leu Lys Ile Cys Thr Arg Tyr Leu Gly Glu Val1360136513701375gat tct aca atg aca ata att gat att tct atg ctg act ggt ttt ctc4176Asp Ser Thr Met Thr Ile Ile Asp Ile Ser Met Leu Thr Gly Phe Leu138013851390cct gat gct gaa gac ctt aca agg ctt tct aaa gga gtg gac aga tac4224Pro Asp Ala Glu Asp Leu Thr Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Arg Tyr139514001405atc tcc aga tat gaa gtt gac aat aat atg gct cag aaa gta gct gtt4272Ile Ser Arg Tyr Glu Val Asp Asn Asn Met Ala Gln Lys Val Ala Val141014151420
atc att tac tta aac aag gtc tcc cac tct gaa gat gaa tgc ctg cac4320Ile Ile Tyr Leu Asn Lys Val Ser His Ser Glu Asp Glu Cys Leu His142514301435ttt aag att ctc aag cat ttt gaa gtt ggc ttc att cag cca gga tca4368Phe Lys Ile Leu Lys His Phe Glu Val Gly Phe Ile Gln Pro Gly Ser1440144514501455gtc aag gtg tac agc tac tac aat cta gat gaa aaa tgt acc aag ttc4416Val Lys Val Tyr Ser Tyr Tyr Asn Leu Asp Glu Lys Cys Thr Lys Phe146014651470tac cat cca gat aaa gga aca ggc ctt ctc aat aag ata tgt att ggt4464Tyr His Pro Asp Lys Gly Thr Gly Leu Leu Asn Lys Ile Cys Ile Gly147514801485aac gtt tgc cga tgt gca gga gaa acc tgt tcc tcg ctc aac cat cag4512Asn Val Cys Arg Cys Ala Gly Glu Thr Cys Ser Ser Leu Asn His Gln149014951500gaa agg att gat gtt cca tta caa att gaa aaa gcc tgc gag acg aat4560Glu Arg Ile Asp Val Pro Leu Gln Ile Glu Lys Ala Cys Glu Thr Asn150515101515gtg gat tat gtc tac aaa acc aag ctg ctt cga ata gaa gaa caa gat4608Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Lys Leu Leu Arg Ile Glu Glu Gln Asp1520152515301535ggt aat gat atc tat gtc atg gat gtt tta gaa gtt att aaa caa ggt4656Gly Asn Asp Ile Tyr Val Met Asp Val Leu Glu Val Ile Lys Gln Gly154015451550act gac gaa aat cca cga gca aag acc cac cag tac ata agt caa agg4704Thr Asp Glu ASn Pro Arg Ala Lys Thr His Gln Tyr Ile Ser Gln Arg155515601565aaa tgc cag gag gct ctg aat ctg aag gtg aat gat gat tat ctg atc4752Lys Cys Gln Glu Ala Leu Asn Leu Lys Val Asn Asp Asp Tyr Leu Ile157015751580tgg ggt tcc agg agt gac ctg ttg ccc acg aaa gat aaa att tcc tac4800Trp Gly Ser Arg Ser Asp Leu Leu Pro Thr Lys Asp Lys Ile Ser Tyr158515901595atc att aca aag aac aca tgg att gag aga tgg cca cat gaa gac gaa4848Ile Ile Thr Lys Asn Thr Trp Ile Glu Arg Trp Pro His Glu Asp Glu1600160516101615tgt cag gaa gaa gaa ttc caa aag ttg tgt gat gac ttt gct cag ttt4896Cys Gln Glu Glu Glu Phe Gln Lys Leu Cys Asp Asp Phe Ala Gln Phe162016251630agc tac aca ttg act gag ttt ggc tgc cct act taa aagttcagaa 4942Ser Tyr Thr Leu Thr Glu Phe Gly Cys Pro Thr ★16351640gaatcaatga taggaaggaa attctcagaa gacagatttt tgagccaatg catatatgtt 5002actttgcctc ttgatctttt agttttatgt caatttgctc tgttattttc ccttaaattg 5062tttatacata aaataaataa tcgatttctt actttgatat gttcttgatt tttaataaac 5122aatggtgatt catgattatt tttttcttct tctgatccgt ccaatatttg aagtgctctg 5182aacagagcac ttatggagta atgttttagt gatggatgaa taagttggtg agtcaatatt 5242
atcaggccct atatactctt atggaagatc gatttgtacc caaagaaaca tagattgaaa 5302tgtgttactt tgaaaacaga ggtttcagtt gtatatgttt acacttggat acaatcttaa 5362ctcttaataa acactgatct cagaacattt aacagctgct atttaataat gacaaaatat 5422tctttgactg cacccacaga aaacattgca ttacattaga atgggtttta tcagatgact 5482aagtctgcta gacttgccat ctgtcaaaat gtgcctcttc cccagctcca actttaagga 5542tagtaactaa tagatgttct ctcattggct cctgacagag gtgtggtagc cactgagttt 5602ccctggatga cactagaagc tggcagcaca ctgcagcctg gtggaggggg cctcttttgc 5662tatcccatga gcttctattc atcctcttat ctgttgggat ggggatggga cgtctctgat 5722tttccaggta tacaggtgat ctcatttact aacatcacca ctaacttcaa ggattggttg 5782aggggttatg ccaatgtgat tgaagggttt cacccatgtg aatctattct ccaatcccaa 5842tgctgtatct atgctgctca tttctgcttg taaaaatggt ataaaaagaa taaacactgc 5902ccaggcagtc agacatcttt ggacactg5930<210>4<211>1642<212>PRT<213>眼镜蛇<400>4Met Glu Arg Met Ala Leu Tyr Leu Val Ala Ala Leu Leu Ile Gly Phe1 5 10 15Pro Gly Ser Ser His Gly Ala Leu Tyr Thr Leu Ile Thr Pro Ala Val20 25 30Leu Arg Thr Asp Thr Glu Glu Gln Ile Leu Val Glu Ala His Gly Asp35 40 45Ser Thr Pro Lys Gln Leu Asp Ile Phe Val His Asp Phe Pro Arg Lys50 55 60Gln Lys Thr Leu Phe Gln Thr Arg Val Asp Met Asn Pro Ala Gly Gly65 70 75 80Met Leu Val Thr Pro Thr Ile Glu Ile Pro Ala Lys Glu Val Ser Thr85 90 95Asp Ser Arg Gln Asn Gln Tyr Val Val Val Gln Val Thr Gly Pro Gln100 105 110Val Arg Leu Glu Lys Val Val Leu Leu Ser Tyr Gln Ser Ser Phe Leu115 120 125Phe Ile Gln Thr Asp Lys Gly Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Pro Val Leu130 135 140Tyr Arg Val Phe Ser Met Asp His Asn Thr Ser Lys Met Asn Lys Thr145 150 155 160Val Ile Val Glu Phe Gln Thr Pro Glu Gly Ile Leu Val Ser Ser Asn165 170 175Ser Val Asp Leu Asn Phe Phe Trp Pro Tyr Asn Leu Pro Asp Leu Val180 185 190Ser Leu Gly Thr Trp Arg Ile Val Ala Lys Tyr Glu His Ser Pro Glu195 200 205Asn Tyr Thr Ala Tyr Phe Asp Val Arg Lys Tyr Val Leu Pro Ser Phe210 215 220Glu Val Arg Leu Gln Pro Ser Glu Lys Phe Phe Tyr Ile Asp Gly Asn225 230 235 240Glu Asn Phe His Val Ser Ile Thr Ala Arg Tyr Leu Tyr Gly Glu Glu245 250 255Val Glu Gly Val Ala Phe Val Leu Phe Gly Val Lys Ile Asp Asp Ala260 265 270Lys Lys Ser Ile Pro Asp Ser Leu Thr Arg Ile Pro Ile Ile Asp Gly275 280 285Asp Gly Lys Ala Thr Leu Lys Arg Asp Thr Phe Arg Ser Arg Phe Pro290 295 300Asn Leu Asn Glu Leu Val Gly His Thr Leu Tyr Ala Ser Val Thr Val305 310 315 320Met Thr Glu Ser Gly Ser Asp Met Val Val Thr Glu Gln Ser Gly Ile325 330 335
His Ile Val Ala Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys340 345 350Tyr Phe Lys Pro Gly Met Pro Tyr Glu Leu Thr Val Tyr Val Thr Asn355 360 365Pro Asp Gly Ser Pro Ala Ala His Val Pro Val Val Ser Glu Ala Phe370 375 380His Ser Met Gly Thr Thr Leu Ser Asp Gly Thr Ala Lys Leu Ile Leu385 390 395 400Asn Ile Pro Leu Asn Ala Gln Ser Leu Pro Ile Thr Val Arg Thr Asn405 410 415His Gly Asp Leu Pro Arg Glu Arg Gln Ala Thr Lys Ser Met Thr Ala420 425 430Ile Ala Tyr Gln Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Tyr Leu His Val Ala435 440 445Ile Thr Ser Thr Glu Ile Lys Pro Gly Asp Asn Leu Pro Val Asn Phe450 455 460Asn Val Lys Gly Asn Ala Asn Ser Leu Lys Gln Ile Lys Tyr Phe Thr465 470 475 480Tyr Leu Ile Leu Asn Lys Gly Lys Ile Phe Lys Val Gly Arg Gln Pro485 490 495Arg Arg Asp Gly Gln Asn Leu Val Thr Met Asn Leu His Ile Thr Pro500 505 510Asp Leu Ile Pro Ser Phe Arg Phe Val Ala Tyr Tyr Gln Val Gly Asn515 520 525Asn Glu Ile Val Ala Asp Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Thr Cys530 535 540Met Gly Thr Leu Val Val Lys Gly Asp Asn Leu Ile Gln Met Pro Gly545 550 555 560Ala Ala Met Lys Ile Lys Leu Glu Gly Asp Pro Gly Ala Arg Val Gly565 570 575Leu Val Ala Val Asp Lys Ala Val Tyr Val Leu Asn Asp Lys Tyr Lys580 585 590Ile Ser Gln Ala Lys Ile Trp Asp Thr Ile Glu Lys Ser Asp Phe Gly595 600 605Cys Thr Ala Gly Ser Gly Gln Asn Asn Leu Gly Val Phe Glu Asp Ala610 615 620Gly Leu Ala Leu Thr Thr Ser Thr Asn Leu Asn Thr Lys Gln Arg Ser625 630 635 640Ala Ala Lys Cys Pro Gln Pro Ala Asn Arg Arg Arg Arg Ser Ser Val645 650 655Leu Leu Leu Asp Ser Asn Ala Ser Lys Ala Ala Glu Phe Gln Asp Gln660 665 670Asp Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Val Met His Glu Asn Pro Met Gly675 680 685Tyr Thr Cys Glu Lys Arg Ala Lys Tyr Ile Gln Glu Gly Asp Ala Cys690 695 700Lys Ala Ala Phe Leu Glu Cys Cys Arg Tyr Ile Lys Gly Val Arg Asp705 710 715 720Glu Asn Gln Arg Glu Ser Glu Leu Phe Leu Ala Arg Asp Asp Asn Glu725 730 735Asp Gly Phe Ile Ala Asp Ser Asp Ile Ile Ser Arg Ser Asp Phe Pro740 745 750Lys Ser Trp Leu Trp Leu Thr Lys Asp Leu Thr Glu Glu Pro Asn Ser755 760 765Gln Gly Ile Ser Ser Lys Thr Met Ser Phe Tyr Leu Arg Asp Ser Ile770 775 780Thr Thr Trp Val Val Leu Ala Val Ser Phe Thr Pro Thr Lys Gly Ile785 790 795 800Cys Val Ala Glu Pro Tyr Glu Ile Arg Val Met Lys Val Phe Phe Ile805 810 815Asp Leu Gln Met Pro Tyr Ser Val Val Lys Asn Glu Gln Val Glu Ile
820 825 830Arg Ala Ile Leu His Asn Tyr Val Asn Glu Asp Ile Tyr Val Arg Val835 840 845Glu Leu Leu Tyr Asn Pro Ala Phe Cys Ser Ala Ser Thr Lys Gly Gln850 855 860Arg Tyr Arg Gln Gln Phe ProIle Lys Ala Leu Ser Ser Arg Ala Val865 870875 880Pro Phe Val Ile Val Pro Leu Glu Gln Gly Leu His Asp Val Glu Ile885 890 895Lys Ala Ser Val Gln Glu Ala Leu Trp Ser Asp Gly Val Arg Lys Lys900 905 910Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Val Gln Lys Ser Ile Val Thr Ile Val915 920 925Lys Leu Asp Pro Arg Ala Lys Gly Val Gly Gly Thr Gln Leu Glu Val930 935 940Ile Lys Ala Arg Lys Leu Asp Asp Arg Val Pro Asp Thr Glu Ile Glu945 950 955 960Thr Lys Ile Ile Ile Gln Gly Asp Pro Val Ala Gln Ile Ile Glu Asn965 970 975Ser Ile Asp Gly Ser Lys Leu Asn His Leu Ile Ile Thr Pro Ser Gly980 985 990Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Arg Met Ala Ala Pro Val Ile Ala Thr995 10001005Tyr Tyr Leu Asp Thr Thr Glu Gln Trp Glu Thr Leu Gly Ile Asn Arg101010151020Arg Thr Glu Ala Val Asn Gln Ile Val Thr Gly Tyr Ala Gln Gln Met1025103010351040Val Tyr Lys Lys Ala Asp His Ser Tyr Ala Ala Phe Thr Asn Arg Ala104510501055Ser Ser Ser Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ala Met Ala106010651070Ala Lys Met Val Ala Gly Ile Ser His Glu Ile Ile Cys Gly Gly Val107510801085Arg Trp Leu Ile Leu Asn Arg Gln Gln Pro Asp Gly Ala Phe Lys Glu109010951100Asn Ala Pro Val Leu Ser Gly Thr Met Gln Gly Gly Ile Gln Gly Ala1105111011151120Glu Glu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Phe Ile Leu Val Ala Leu Leu Glu112511301135Ser Lys Thr Ile Cys Asn Asp Tyr Val Asn Ser Leu Asp Ser Ser Ile114011451150Lys Lys Ala Thr Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Tyr Glu Lys Leu Gln Arg115511601165Pro Tyr Thr Thr Ala Leu Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Ala Ala Asp Gln117011751180Leu Asn Asp Asp Arg Val Leu Met Ala Ala Ser Thr Gly Arg Asp His1185119011951200Trp Glu Glu Tyr Asn Ala His Thr His Asn Ile Glu Gly Thr Ser Tyr120512101215Ala Leu Leu Ala Leu Leu Lys Met Lys Lys Phe Asp Gln Thr Gly Pro122012251230Ile Val Arg Trp Leu Thr Asp Gln Asn Phe Tyr Gly Glu Thr Tyr Gly123512401245Gln Thr Gln Ala Thr Val Met Ala Phe Gln Ala Leu Ala Glu Tyr Glu125012551260Ile Gln Met Pro Thr His Lys Asp Leu Asn Leu Asp Ile Thr Ile Glu1265127012751280Leu Pro Asp Arg Glu Val Pro Ile Arg Tyr Arg Ile Asn Tyr Glu Asn128512901295Ala Leu Leu Ala Arg Thr Val Glu Thr Lys Leu Asn Gln Asp Ile Thr130013051310
Val Thr Ala Ser Gly Asp Gly Lys Ala ThrMet Thr Ile Leu Thr Phe13151320 1325Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Glu Lys Ala Asn Val Cys Asn Lys Phe His133013351340Leu Asn Val Ser Val Glu Asn Ile His Leu Asn Ala Met Gly Ala Lys1345135013551360Gly Ala Leu Met Leu Lys Ile Cys Thr Arg Tyr Leu Gly Glu Val Asp136513701375Ser Thr Met Thr Ile Ile Asp Ile Ser Met Leu Thr Gly Phe Leu Pro138013851390Asp Ala Glu Asp Leu Thr Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Arg Tyr Ile139514001405Ser Arg Tyr Glu Val Asp Asn Asn Met Ala Gln Lys Val Ala Val Ile141014151420Ile Tyr Leu Asn Lys Val Ser His Ser Glu Asp Glu Cys Leu His Phe1425143014351440Lys Ile Leu Lys His Phe Glu Val Gly Phe Ile Gln Pro Gly Ser Val144514501455Lys Val Tyr Ser Tyr Tyr Asn Leu Asp Glu Lys Cys Thr Lys Phe Tyr146014651470His Pro Asp Lys Gly Thr Gly Leu Leu Asn Lys Ile Cys Ile Gly Asn147514801485Val Cys Arg Cys Ala Gly Glu Thr Cys Ser Ser Leu Asn His Gln Glu149014951500Arg Ile Asp Val Pro Leu Gln Ile Glu Lys Ala Cys Glu Thr Asn Val1505151015151520Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Lys Leu Leu Arg Ile Glu Glu Gln Asp Gly152515301535Asn Asp Ile Tyr Val Met Asp Val Leu Glu Val Ile Lys Gln Gly Thr154015451550Asp Glu Asn Pro Arg Ala Lys Thr His Gln Tyr Ile Ser Gln Arg Lys155515601565Cys Gln Glu Ala Leu Asn Leu Lys Val Asn Asp Asp Tyr Leu Ile Trp157015751580Gly Ser Arg Ser Asp Leu Leu Pro Thr Lys Asp Lys Ile Ser Tyr Ile1585159015951600Ile Thr Lys Asn Thr Trp Ile Glu Arg Trp Pro His Glu Asp Glu Cys160516101615Gln Glu Glu Glu Phe Gln Lys Leu Cys Asp Asp Phe Ala Gln Phe Ser162016251630Tyr Thr Leu Thr Glu Phe Gly Cys Pro Thr16351640<210>5<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>载体编码的序列<400>5Arg Ser Pro Trp Pro Gly Val Pro Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser1 5 10 15Ala Asp Ala<210>6<211>31
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HC3H5-1.
<400>6ggatgccact atgtctatat tggacatatc c 31<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HC3H5-2.
<400>7tcttctattc gaaccagtcg ggtcttgtac 30<210>8<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HuC3H5-3.
<400>8gtacaagacc cgactggttc gaatagaaga acaag 35<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HuC3H5-4.
<400>9tatcatgtaa gcggccgcgt ataaacaatt taaggg36<210>10<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HC3sigRemF.
<400>10agatctccat ggaagcttag cgctgggagt cccatgtact ctatcatc 48<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HC3sigRemR.
<400>11gcgtcccgcc ttcaacagcc 20<210>12<211>24<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>primer HC3H5-3-F1.
<400>12tctgtgtggc agaccccttc gagg 24<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HC3H5-5-R1.
<400>13cgttaccaat acatatcttg ttcagctttc catcc 35<210>14<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HuCC3H5-3-F2.
<400>14ggatggaaag ctgaacaaga tatgtattgg taacg 35<210>15<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物HuC3H5-3-R2.
<400>15catccatgac atagatatca ttaccatctt g 31<210>16<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuC3H5-5-1R.
<400>16gcaactgtgc gttatacatt gtcaccaccg ac 32<210>17<211>32<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>HuC3H5-5-2F.
<400>17gtcggtggtg acaatgtata acgcacagttgc 32<210>18<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HC3H5-4-R1.
<400>18gagaaggcct gttcctttat ccggatggta gaaccgggta c41<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HCC3H5-4-F2.
<400>19ccggttctac catccggata aaggaacagg ccttc 35<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HC3H5-3-R2.
<400>20catccatgac atagatatcattaccatctt g31<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuC3H5-F1.
<400>21ggatgccact atgtctatat tggacatatc c 31<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuC3H5-2R1.
<400>22
cccgatgatg tagctgagtt tatctttcgt ggg33<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuC3H5-2F2.
<400>23cccacgaaag ataaactcag ctacatcatc ggg33<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuC3H5-2-R2.
<400>24aattggagct ccaccgcggt gg2权利要求
1.经修饰的人补体C3蛋白质，其包含将部分人C3蛋白质用与其基本相关的眼镜蛇毒因子蛋白质序列的相应部分替换。
2.权利要求1的经修饰的C3蛋白质，其中所述CVF替换部分在C3的α链内。
3.权利要求2的经修饰的C3蛋白质，其中所述CVF替换部分是C3α链的C端部分。
4.权利要求3的经修饰的C3蛋白质，其中所述替换的C端部分包括人C3蛋白质的氨基酸1663位。
5.权利要求3的经修饰的C3蛋白质，其中所述替换的C端部分是不跨越人C3蛋白质整个C端的内部部分。
6.权利要求1的经修饰的C3蛋白质，其中所述经修饰的蛋白质具有未经修饰的人C3蛋白质基本相同数量的氨基酸残基。
7.权利要求1的经修饰的C3蛋白质，其中所述替换包含人C3蛋白质氨基酸位置700-1663位之内的任意位置。
8.权利要求1的经修饰的C3蛋白质，其中所述替换包含第一个位置和最后一个位置，其中所述第一个位置选自749、874、936、′、1264、1348、1496、1504和1550，而其中所述最后一个位置选自784、921、970、1324、1550、1617和1663。
9.权利要求8的经修饰的C3蛋白质，其中所述替换选自氨基酸1550-1663、1504-1663、1348-1663、1550-1617、1504-1617、1496-1663、1348-1617、1496-1617、1264-1324、749-784、874-921、994-1663、994-1550和936-970。
10.权利要求1的经修饰的C3蛋白质，其中所述经修饰的C3蛋白质具有对B因子的亲和性，并且支持形成有活性的转变酶。
11.权利要求10的经修饰的C3蛋白质，其中所述转变酶具有37℃至少大约15分钟的内在半衰期。
12.权利要求1的经修饰的C3蛋白质，其中所述经修饰的蛋白质在N端具有1-19个不由C3或CVF编码的额外氨基酸。
13.权利要求1的经修饰的C3蛋白质，其中所述经修饰的蛋白质是基本非免疫原的。
14.用于消耗补体的方法，其包括向患者施用消耗补体有效量的权利要求1的经修饰的C3蛋白质。
15.用于增加基因疗法效率和/或效力的方法，其包括递送消耗补体足够量的权利要求1的经修饰的C3蛋白质；提供基因治疗；以及观察由其增强的结果。
16.增加递送治疗剂或诊断剂的方法，其包括递送增加血流的足够量权利要求1的经修饰的C3蛋白质；以及提供治疗剂或诊断剂。
17.权利要求14-16中任意一项的方法，其进一步包括在递送步骤之前将经修饰的C3蛋白质化学连接至具特定组织亲和性的抗体。
18.治疗与不希望的补体激活相关的病症或疾病的方法，其包括施用消耗补体的足够量经修饰的C3蛋白质。
19.权利要求18的方法，其中所述病症或疾病选自哮喘、系统性红斑性狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病、多发性硬化、心肌缺血、再灌注、脓毒症、超急性排斥、移植排斥、心肺分流术、心肌梗塞、血管成形术、肾炎、皮肤真菌病、类天疱疮、脊髓损伤和帕金森氏病。
20.选择经修饰的C3蛋白质的方法，其包括表征经修饰的C3蛋白质的至少一种性质来形成经修饰的蛋白质的功能谱；并将功能谱与待治疗的疾病或病症匹配。
21.编码权利要求1的经修饰的C3蛋白质的核酸序列。
22.组合物，其包含权利要求1的经修饰的人补体C3蛋白质和可药用载体。
23.表达权利要求1的经修饰的C3蛋白质的表达系统。
全文摘要
公开了经修饰的人补体C3蛋白质(C3)，其包含将部分人C3蛋白质替换为眼镜蛇毒因子蛋白质(CVF)的相应部分，从而导致具CVF功能、但免疫原性基本下降的人C3蛋白质。有利地，能够将C3蛋白质操作成包含至少一种下列CVF功能增加的C3转变酶稳定性和增加的对H因子和/或I因子作用的抵抗性。给出了许多在C3α链的C端部分包含替换的杂合性C3蛋白质，并且对其中所述蛋白质进行了上述功能的测试。给出了治疗疾病例如再灌注损伤、自身免疫疾病以及其它补体活性增强的疾病的方法，也给出了增加基因疗法和其它疗法有效性的方法。
文档编号C07K19/00GK101014362SQ200580022128
公开日2007年8月8日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月30日
发明者C－W·沃格尔, D·C·弗里齐格尔 申请人:夏威夷大学