金黄色葡萄球菌SpA5突变体及其制备方法和应用的制作方法

金黄色葡萄球菌SpA5突变体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种金黄色葡萄球菌SpA5突变体蛋白以及包含该突变体蛋白的载体、工程菌、组合物或试剂盒，以及该突变体蛋白的应用和制备、发酵和纯化方法。本发明的SpA5蛋白能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御金黄色葡萄球菌感染，免疫原性强，安全无毒性，且安全有效、质量可控。
【专利说明】金黄色葡萄球菌SpA5突变体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种金黄色葡萄球菌SpA5突变体蛋白。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA),以下简称金葡菌,有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性炎症为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20%。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实意义。
[0003]随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)自 1961 年被首次发现至今，目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的医院内感染病原菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行，且呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，被称为“第一超级细菌”。
[0004]绝大多 数SA临床分离株都能表达SpA。SpA分子量为55kDa，定位于细胞壁上。SpA前体包含一 N端信号肽及一 C端筛选信号以使其共价结合于细胞壁上。成熟肽的N端部分包含5个56-61个氨基酸残基的Ig结合结构域，卷曲成三个α螺旋束。这些结构域能结合于哺乳动物IgG，破坏抗体的调理吞噬作用；亦能与VH3型的B细胞受体结合，使B细胞死亡，破坏获得性及天然免疫反应。因而，诱导机体产生针对SpA的抗体，阻断MRSA的免疫逃逸机制是抗MRSA疫苗的一个重要选择。但由于SpA具备抗体结合能力，以天然SpA作为抗原无法实现预期目标，需要对其进行突变去除其抗体结合活性，同时保留其免疫原性。
[0005]金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA-252菌株的SpA蛋白前体(命名为SpA(252), SEQ ID NO: 5)包括516个氨基酸，其中前36个氨基酸构成信号肽序列；第37~327位氨基酸构成EDABC五个Ig结合结构域，共包括291个氨基酸(命名为SpA5( 252))。Ig结合结构域是SpA的活性区域,也是研究的重点。Kim HK等曾对S.aureus Newman菌株的SpA的Ig结合结构域进行突变，以期获得免疫活性高的疫苗，取得了一定的效果(NontoxigenicproteinA vaccine for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections inmice.J Exp Med.2010 Aug30;207 (9):1863-70)。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种SA的SpA5突变体以及包含该突变体的组合物，作为SA新的疫苗候选物。
[0007]在本发明的一个方面，提供一种SpA5突变体重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列选自 SEQID N0.1 ~4。
[0008]在本发明的第二个方面，提供编码本发明的SpA5蛋白的核苷酸序列，以及包含所述核苷酸序列的载体和宿主。
[0009]在本发明的第三个方面，提供一种制备本发明的SpA5蛋白的方法。
[0010]在本发明的第四个方面，提供一种发酵SpA5基因工程菌的方法，用于制备SpA5蛋白。
[0011]在本发明的第五个方面，提供一种纯化本发明的SpA5蛋白的方法。
[0012]在本发明的第六个方面，提供本发明的SpA5蛋白作为抗原的应用，以及SpA5蛋白在制备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。 [0013]在本发明的第七个方面，提供由本发明的SpA5蛋白免疫产生的多克隆抗体以及所述多克隆抗体在制备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。
[0014]在本发明的第八个方面，提供包含本发明的SpA5蛋白的组合物或试剂盒，优选地，所述组合物是疫苗。
[0015]根据实验结果，以本发明的SpA5蛋白作为抗原能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御金黄色葡萄球菌感染，免疫原性强，安全无毒性，且安全有效、质量可控。
【专利附图】

【附图说明】
[0016]图UpGEX系列载体的图谱。
[0017]图2、实施例2所示目的蛋白诱导表达的10%SDS_PAGE实验结果。各泳道分别为:1:SpA(55KD) ；M:蛋白中蛋白质分子量标准(170、130、100、70、55、40、35、25、15) KD ；2:SpA5wt (33KD)；3:SpA5ref(KKAA, 33KD) ；4:SpA5 (KKAA, 33KD) ；5:SpA5 (KKVV, 33KD) ；6:SpA5(RRAA, 33KD) ；7:SpA5(RRVV, 33KD)。
[0018]图3、SpA5工程菌在四种培养基中的生长曲线。
[0019]图4、SpA5在M9和TB培养基中的表达情况；其中，1:蛋白质分子量标准；2:M9培养基中表达情况；3:TB培养基中的表达情况。
[0020]图5、不同IPTG浓度对SpA5蛋白表达的影响；1:蛋白质分子量标准；2:0.1mM ；3:
0.2mM ；4:0.5mM ；5:lmM。
[0021]图6、不同接种量在诱导以前细菌生长曲线。
[0022]图7、SpA5基因工程菌不同接种量对蛋白表达的影响；1:蛋白质分子量标准；2:5% ；3:10% ；4:15%。
[0023]图8、不同氧浓度下SpA5工程菌生长曲线。
[0024]图9、PO2不同浓度时，SpA5蛋白的表达情况；1:蛋白质分子量标准；2:25% ；3:45% ；4:65%。
[0025]图10、不同浓度的甘油对SpA5蛋白表达的影响；1:蛋白质分子量标准；2:5ml/L ；3:10ml/L ；4:15ml/L。
[0026]图11、在不同诱导温度和时间时目的蛋白表达的情况；1:蛋白质分子量标准；2:诱导Oh ；3:诱导2h ；4:诱导4h ；5:诱导6h ；6:诱导8h ；7:诱导10h。
[0027]图12、25L SpA5工程菌发酵生长曲线。
[0028]图13、25L SpA5工程菌发酵时SpA5蛋白表达情况；1:蛋白质分子量标准；2:诱导Oh ；3:诱导Ih ；4:诱导2h ；5:诱导3h ；6:诱导4h ；7:诱导5h。
[0029]图14、GST_琼脂糖凝胶4B纯化目的蛋白的结果:M:蛋白质分子量标准；1:结合于填料上的GST-SpA5融合蛋白；2:流穿；3:酶切洗脱后残存于填料上的SpA5及GST ；4:酶切洗脱后的目的蛋白SpA5。
[0030]图15、SP HP层析纯化SpA5蛋白色谱图，出现两个洗脱峰:第一峰与第二峰。
[0031]图16、SP HP层析纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；1:样品；2:流穿；3:第一峰；4:第二峰(1M NaCl洗脱)。
[0032]图17、MMC层析纯化SpA5蛋白色谱图。
[0033]图18、MMC层析纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；1:进样样品；2:流穿样品；3:30%B液洗脱样品；4:100%B液洗脱样品。
[0034]图19、Phenyl HP层析纯化SpA5蛋白色谱图。
[0035]图20、Phenyl HP层析纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；1:洗脱管Al ；
2:洗脱管A2 ；3:洗脱管A3 ；4:洗脱管A4 ；5:流穿样品。
[0036]图21、SP HP层析(样品电导4.755ms/cm)纯化SpA5蛋白色谱图。
[0037]图22、SP HP层析(样品电导4.755ms/cm)纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；1:样品 ；2:流穿；3:洗脱管I ;4:洗脱管2 ；5:洗脱管3 ；6:洗脱管4。
[0038]图23、SP HP层析(样品电导11.622ms/cm)纯化SpA5蛋白色谱图。
[0039]图24、SP HP层析(样品电导11.622ms/cm)纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；1:流穿；2:F2。
[0040]图25、硫酸铵沉淀SpA5条件的选择；1:2M (NH4)2SO4沉淀；2:2M (NH4)2SO4上清；3:1.6M(NH4)2SO4 上清；4:1.6M(NH4)2SO4 沉淀。
[0041]图26、SpA突变体精纯化结果；M:蛋白质分子量标准；1:SpA ;2:SpA5ref (KKAA)；
3:SpA5(KKAA) ；4:SpA5 (KKVV) ；5:SpA5(RRAA) ；6:SpA5(RRVV)。
[0042]图27、放大后SP HP层析(批次I )纯化SpA5蛋白色谱图。
[0043]图28、放大后Q HP层析(批次I )纯化SpA5蛋白色谱图。
[0044]图29、放大后(批次I )纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；I:纯化前样品；2:流穿样品；3:SP HP洗脱样品；4: (NH4)2SO4沉淀复溶样品；5:G25洗脱样品；6:Q HP流穿样品。
[0045]图30、放大后SP HP (批次II)纯化SpA5蛋白色谱图。
[0046]图31、放大后Q HP (批次II)纯化SpA5蛋白色谱图。
[0047]图32、放大后(批次II)纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；1:纯化前样品；2:SP HP洗脱样品；3: (NH4)2SO4沉淀复溶样品；4:G25洗脱样品；5:Q HP流穿样品。
[0048]图33、放大后SP HP (批次III)纯化SpA5蛋白色谱图。
[0049]图34、放大后Q HP (批次III)纯化SpA5蛋白色谱图。
[0050]图35、放大后(批次ΠΙ)纯化SpA5蛋白电泳图；M:蛋白质分子量标准；1:纯化前样品；2:流穿样品；3:SP HP洗脱样品；4:G25洗脱样品；5:Q HP流穿样品。
[0051]图36、SpA5 (KKAA)突变体HPLC检测结果；主峰保留时间13.282分；主峰面积比率 98.2%ο
[0052]图37、ELISA检测SpA及各SpA5蛋白与人IgG的结合能力(平均值土 stdev，n=l2 )。[0053]图38、酶切纯化后的F(ab)2片段；1:F(ab)2 ；M:蛋白分子量标准；2:抗体。
[0054]图39、ELISA检测各SpA5蛋白免疫家兔后产生的抗体F(ab)2片段对SpA与人IgG结合能力的降低情况(平均值土 stdev, n=5)。
[0055]图40、免疫SpA及各SpA5蛋白后，小鼠脾B淋巴细胞凋亡诱导情况。
[0056]图41、磷酸铝吸附SpA5前后10%SDS_PAGE结果；1:吸附磷酸铝后离心上清:SpA5ref (KKAA) ;2:吸附磷酸铝后离心上清SpA5 (KKAA) ;3:吸附磷酸铝后离心上清SpA5 (RRVV) ；4:蛋白原液(以 SpA5 (KKAA)作对照)。
【具体实施方式】
[0057]本
【发明内容】
基于现有技术，克隆并突变了金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA252菌株的SpA蛋白的Ig结合结构域，通过活性检测发现，本发明的SpA5蛋白比对比文件提供的SpA突变蛋白的活性更高。
[0058]本发明中，发明人将SpA(252)(SEQ ID NO:5)的第 43Q、44Q、96Q、97Q、162Q、163Q、220Q、221Q、278Q、279Q 同时替换成 K或 R，将第 70D、71D、131D、132D、189D、190D、247D、248D、305D、306D同时替换成A或V，并进行修饰，得到本发明的四个SpA5蛋白:SpA5 (KKAA) (SEQID N0.1)、SpA5(RRAA) (SEQ ID N0.2)、SpA5 (KKW) (SEQ IDN0.3)和 SpA5 (RRW) (SEQID N0.4)。四个蛋白中第6-296位氨基酸来自于SpA (252)，前5个氨基酸(GPLGS，SEQ IDN0.8)为来自表达载体的修饰的氨基酸,这5个氨基酸的编码序列优选为gggcccctgggatcc(SEQ ID N0.13)。
[0059]因此，在本发明中 ， 申请人:提供编码SEQ ID N0.1-4中任何一个SpA5蛋白的核苷酸序列。在已知蛋白质氨基酸序列的情况下，本领域技术人员完全可以根据需要设计合适的编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，并使其表达。
[0060]在一种优选的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID N0.9-12所示。
[0061]在另一方面，本发明提供包括编码本发明SpA5蛋白的核苷酸的载体或宿主。
[0062]所述载体可以是任何适于蛋白表达的载体。在本发明的优选实施方式中，所述载体是表达载体PGEX或pET系列载体，更优选是表达载体pGEX-6P-2。pGEX系列载体的图谱如图1所示。
[0063]本发明优选采用的pGEX-6p_2载体其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其它融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
[0064]所述宿主可以是本领域技术人员已知的任何表达细胞，优选为大肠杆菌XLl-Blue0
[0065]在另一方面，本发明提供一种制备SpA5蛋白的方法，所述方法可以是化学合成法或核苷酸表达法。本领域技术人员根据SpA5蛋白的序列和本领域常识完全可以知道如何制备本发明的SpA5蛋白。
[0066]在另一方面，本发明提供一种SpA5基因工程菌的发酵工艺，所述工艺包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的发酵培养基中，经诱导剂诱导一定时间而表达重组蛋白。优选地，所述工艺涉及培养基、种子菌接种量、培养基中的甘油量、溶氧量、诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间几方面因素；进一步优选地，所述培养基可以是动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB、植物源性M9，优选为动物源性TB ;所述种子菌的接种量是5%~15%，优选为10% ;所述甘油量为5-15ml/L培养基，优选为10ml/L培养基；所述溶氧量是25%~65%，优选为45% ;所述诱导剂可以是乳糖或IPTG，优选为IPTG ;所述诱导剂的浓度是100 μ mo I/L-1mmo I/L培养基，优选为200 μ mol/L培养基；所述诱导温度为16~37°C，优选为30°C ;所述诱导时间为I~6小时，优选为5小时。
[0067]在所述发酵工艺的一种【具体实施方式】中，基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L ;发酵开始时，加入种子菌的比例是10% ;在发酵过程中溶氧浓度始终保持在45%左右；诱导时，温度调为30°C、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。
[0068]在另一方面，本发明还提供一种在发酵宿主后纯化SpA5蛋白的方法，所述方法包括依次进行的亲和层析、阳离子交换层析、硫酸铵沉淀、脱盐和阴离子交换层析五个步骤。其中，亲和层析为GST亲和层析结合Prescission蛋白酶(PP酶)酶切，优选使用GST琼脂糖凝胶4B层析；所述阳离子交换层析使用填料为SP HP, Capto MMC,Phenyl HP，优选SP HP;所述脱盐步骤使用G25 ;所述阴离子交换层析使用Q HP。
[0069]所述阳离子交换层析使用的平衡缓冲液是10_20mM PB, pH6.5-7.5，优选地，所述平衡缓冲液是20mM PB, pH7.0 ;阳离子交换层析使用的洗脱缓冲液是10_20mMPB+0.3-1.5MNaCl, ρΗ6.5-7.5，优选地，所述洗脱缓冲液是 20mM PB+1M NaCl, ρΗ7.0。优选地，所述洗脱缓冲液的洗脱程序是以0-50%洗脱缓冲液，5个柱体积进行洗脱。
[0070]所述硫酸铵沉淀步骤包括4°C条件下，将样品与311(順4)2504按1:2~1.4:1.6(V/V)比例混合后搅拌IOmin,6000r/min,离心20min ;优选地，样品与硫酸铵的比例是
1.4:1.6。
[0071]所述阴离子交换层析`使用的平衡缓冲液是5_15mM His+0.01-0.05%泊洛沙姆188+0.9%NaCl, pH5_7 ;优选地是 IOmM His+0.01% 泊洛沙姆 188+0.9%NaCl, ρΗ6.0。
[0072]优选地，在进行亲和层析之前，需要对基因工程菌破菌，以将蛋白从菌体中释放出来。
[0073]在另一方面，本发明提供SpA5蛋白在检测、预防或治疗SA感染中的应用，或在制备用于检测、预防或治疗SA感染的制剂中的应用。优选地，所述制剂是疫苗。
[0074]在另一方面，本发明还提供SpA5蛋白免疫产生的抗体，所述抗体为多克隆抗体，能够用于与SA感染相关疾病的检测、预防和治疗，或用于制备相应的制剂。
[0075]在另一方面，本发明还提供包含本发明的SpA5蛋白的组合物或试剂盒。这样的组合物可以是试剂、药物(如疫苗)，用于预防、检测或治疗SA感染。这样的试剂盒可以是检测试剂盒或治疗试剂盒等本领域已知的任何形式试剂盒。
[0076]实施例
[0077]本部分实施例所使用的试剂、菌株等如下所示；中未明确标注生产商的化学试剂等为本领域常规化学或生物学商店均可以购买的。
[0078]1.菌株
[0079]金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA-252由美国ATCC提供；
[0080]宿主菌株XLl-blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品。
[0081]2.质粒[0082]质粒pGEX-6p_2 为美国 GE Healthcare 公司产品。
[0083]3.试剂
[0084]primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量标准、限制性内切酶BamH I和Not 1、蛋白分子量标准、DNA连接酶为大连TakaRa公司产品；
[0085]质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
[0086]琼脂粉、吐温-20等其余试剂均为国内市场购买；
[0087]MH培养基:购自北京奥博星生物技术有限责任公司(牛肉粉2.0g 可溶性淀粉1.5g酸水解酪蛋白17.5g)，加水至lL，pH值7.4±0.2 ;
[0088]MH平板:MH培养基加入琼脂糖至终浓度为1.5g/100mL ；
[0089]PBS(磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g(国产分析纯)，磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20) 2.9g(国产分析纯)，氯化钠(NaCl) 8.0g (国产分析纯)，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL, ρΗ7.4)；
[0090]20mM PB 缓冲液:磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20) 2.9g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至 1000mL, ρΗ7.0 ；
[0091]氨苄西林、卡那霉素(华北制药)；
[0092]5Χ 蛋白质上样缓冲液(250mM Tris-HCl (pH6.8) 10% (ff/V) SDS 0.5% (ff/V)溴酚蓝50% (V/V)甘油5% (W/V) β-巯基乙醇)；
[0093]谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B (美国GE Healthcare公司)；
[0094]磷酸铝佐剂:美国GENERAL CHEMICAL 公司(20mg/ml)；
[0095]疫苗蛋白稀释液(组氨酸(美国Merck公司，药用级)IOmM, NaCl 0.9% (四川科伦，注射用生理盐水)、泊洛沙姆188 (美国Merck公司，药用级)0.01%、pH6.0)，无热原。
[0096]实施例1:序列合成
[0097]以MRSA252基因组(G1:49240382)为模板获得SpA碱基序列及氨基酸序列(SpA
(252), SEQ ID N0.5)，将其中的 EDABC 五个结构域(即 SEQ ID N0.5 的 37aa_327aa，命名为SpA5 (252))的碱基依据大肠杆菌偏好性在网站http://people.mb1.ucla.edu/sumchan/caltor.html上进行稀有密码子分析并优化,对每个结构域内的4个氨基酸进行点突变,合成编码 SpA5 (KKAA)、SpA5 (RRAA)、SpA5 (KKVV)、SpA5 (RRVV)四种蛋白第 6-296 位氨基酸的核苷酸序列，以BamHI和NotI作为双酶切位点装载到表达载体pGEX_6P_2上，然后转化宿主菌XL-1Blue (由上海捷瑞生物技术有限公司直接完成)。四种SpA5蛋白对应的核苷酸序列分别见SEQ ID N0.9-12，其中核苷酸序列中第16-891位核苷酸为基于SpA5 (252)的编码序列进行密码子优化的核苷酸序列。
[0098]以同样的方法，合成SpA5(252)的核苷酸序列,装载至表达载体并转化宿主菌。
[0099]为了便于与文献报道的SpA突变体比较，也按文献报道(Nontoxigenicprotein A vaccine for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infectionsin mice.Kim HK, Cheng AG, Kim HY, Missiakas DM, Schneewind 0.J Exp Med.2010Aug30 ;207(9):1863-70)的氨基酸序列 SpA5ref 合成了编码 SpA5ref (KKAA) (SEQ IDN0.6)的第6-301位氨基酸的核苷酸序列，并用上述方法将核苷酸序列装载至表达载体PGEX-6P-2中，转化宿主菌。
[0100]在本实施例中，所有合成基因在插入BamHI位点后，转化至宿主菌，通过这些重组工程菌表达并用PP酶(美国GE公司)酶切(切后在其N端保留了载体的五个氨基酸GPLGS (SEQ ID N0.8))，将得到用于下列实验的蛋白:本发明的SpA5 (KKAA)、SpA5 (RRAA)、SpA5 (RRVV)、SpA5 (KKVV)，对比蛋白 SpA5wt (序列为 SEQ ID N0.7，即 SpA5 (252)核苷酸序列在装载至PGEX-6P-2载体、转化至XL-1Blue菌表达并经PP酶酶切后的产物，比SpA5(252)的 N 端多了 GPLGS 五个氨基酸，)和 SpA5ref (KKAA)。[0101]实施例2:各蛋白在大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
[0102]I)目的蛋白诱导表达
[0103]①取各重组工程菌培养液100 μ L,加入至IOmL的氨节西林浓度为100 μ g/mL的LB培养基中，80rpm37°C过夜培养。分别取过夜培养的菌液400 μ L加入至20mL的氨苄西林浓度为100 μ g/mL的LB培养基中，37°C培养2~3h，转速220rpm ;二次活化至0D600nm为
0.8-1.0时，加入IPTG，使其终浓度为200 μ Μ，再置于摇床30°C诱导表达3h，然后16°C过夜诱导表达。
[0104]②将诱导表达后的菌液取出，以1000Orpm离心5min,弃去上清,加入ImL PBS混匀，超声(功率300瓦)裂解IOmin (工作6秒，休息9秒)，然后4°C 14000 Xg离心15min，分离上清和沉淀。
[0105]2)处理上清
[0106]上清结合:取谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B (美国GE Healthcare公司)20 μ 1，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入至谷胱甘肽琼脂糖凝胶4Β中，室温结合lh。在4°C下以HOOOrpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。
[0107]用PP酶(Prescission蛋白酶，美国GE公司)进行酶切洗脱:PP酶的使用按厂家推荐的方法进行。由于所使用的PP酶带有GST标签，以利于去除PP酶。酶切完成后，离心收集上清。取上清16μ I,加入4μ 15X蛋白质上样缓冲液,煮沸5min, 14000rpm离心3min。
[0108]3) 10%SDS-PAGE
[0109]电泳结果如图2所示。其中泳道I的SpA (252) (1.5 μ g)蛋白购自Invitrogen公司(美国)(REC PROTEIN A10-1100)。由图可知，目的蛋白已被顺利纯化。
[0110]实施例3、工程菌的发酵
[0111]1、发酵条件的确定
[0112]I)检测培养基对工程菌生长与目的蛋白表达的影响
[0113]通过实施例2所述的培养方法在摇瓶中测试四种培养基:
[0114]植物源性改良TB (磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、大豆蛋白胨12g、硫酸镁lg，加水至1L)；
[0115]动物源性改良TB (磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、动物源胰蛋白胨12g、硫酸镁lg，加水至1L)；
[0116]植物源性M9-CAA (磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵lg、硫酸镁lg、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、大豆蛋白胨3.6g、植物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g,加水至1L)；
[0117]动物源性M9-CAA(磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵lg、硫酸镁lg、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、动物胰蛋白胨3.6g、动物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L)。
[0118]SpA5 (KKAA)工程菌，接种于 Amp+ (100 μ g/mL) LB 平板上，37°C孵育 16 ~20h，挑取单菌落接种于IOml的Amp+LB培养基中，置于摇床中，37°C、200rpm摇到OD6c?大约2左右时，按1:100分别接种于100ml四种培养基中，37°C、200rpm摇14小时，每2小时取样测0D_，其结果见图3。
[0119]由图可知:植物源性培养基均差于动物源性，工程菌都是大约8h时就生长减缓，而在动物源性培养基中就长势很好，一直处于对数期，且TB好于M9，故选用动物源培养基(动物源性改良TB和M9-CAA以下简称TB、M9)。
[0120]将新鲜SpA5工程菌菌液(0D_大约2)按1:100分别接种于100mlTB和M9培养基中，371:、200卬111摇至00_ = 0.8左右，加入11111 IPTG，25°C诱导12h。将100ml菌液离心，弃上清，称重TB:2.4g、M9:l.5g。以Ig:1Oml加PBS超声(功率300瓦)裂解IOmin ( X作6秒，休息9秒)破菌，结合GST4B (具体描述见实施例4)，进行10%SDS_PAGE，结果如图4所示:
[0121]如图4所示:考察单位目的蛋白表达量，TB培养基好于M9培养基，且单位菌湿重TB大于M9，故SpA5工程菌发酵用基础培养基选用TB培养基。
[0122]2) IPTG浓度对目的蛋白表达的影响
[0123]考察不同终浓度的IPTG对目的蛋白表达水平的影响。将IPTG的终浓度分别设为
0.lmM、0.2mM、0.5mM、ImM，对其进行比较选出最佳浓度。将新鲜SpA5工程菌菌液(OD6tltl大约2)按1:100分别接种于四个100ml TB培养基中，37°C、200rpm摇至OD6000.8左右，分别加入IPTG，使其浓度分别对应上述四个浓度(一瓶一个浓度)，25°C诱导12h。将四瓶菌液分别离心，弃上清，以lg: IOml加入PBS，超声(功率300瓦)裂解IOmin (工作6秒，休息9秒)破菌，结合GST4B，进行10%SDS-PAGE，结果如图5所示。
[0124]如图5所示:IPTG终浓度为0.2mM时蛋白表达明显好于0.1mM，与0.5mM、ImM时的蛋白表达基本相同，所以选择 0.2mM为发酵用IPTG终浓度。
[0125]3)种子菌的不同接种量对工程菌的生长和目的蛋白表达的影响
[0126]研究5%、10%、15%三种不同种子菌接种量对发酵的影响，通过细菌生长曲线、单位蛋白表达量来确定最佳接种量。当种子菌0D_在2左右时，倒入发酵罐内开始计时，每I小时取样测0D_，直到诱导前结束，绘制工程菌前期生长期曲线(图6)，可判断细菌生长速度快慢。诱导结束后取样后，按照之前方法处理，进行10%SDS-PAGE，判断单位目的蛋白表达量(图 7)。
[0127]由图6可见，5%接种量细菌生长最慢而且最高OD6c?较另两种接种量低很多，而10%与15%接种量则相差不大。
[0128]由图7可见，不同接种量单位目的蛋白表达量不同，表达最好的是5%接种量，其次是10%,但相差不大，15%最差。
[0129]综上所述:5%接种量表达最好，但生长速度慢，最终细菌得率少；15%接种量生长速度快，但表达量最差；10%接种量的表达量与5%相差不多，而且生长速度也与15%相差不多，所以选择10%接种量作为发酵接种量。
[0130]4)氧浓度对工程菌生长和目的蛋白表达的影响
[0131]此工程菌是兼性需氧菌，氧浓度的高低对细菌生长影响很大，所以在发酵过程中对溶氧的控制就显得特别重要。本实验分别考察溶氧在25%、45%、65%时细菌的生长情况(图8)和目的蛋白表达量(图9)。
[0132]从细菌生长情况可知:45%溶氧条件下，细菌是长得最好的；从单位蛋白表达量来看，45%溶氧条件下，表达也是最好的，所以溶氧浓度选择45%。[0133]5)甘油用量的确定
[0134]在不同菌量时诱导，会影响SpA5的表达量；而发酵时培养基中甘油的量会直接影响菌量的多少。当罐内甘油消耗完，细菌停止生长，在短时间内pH值和溶氧值迅速上升，此时应马上加IPTG开始诱导。所以甘油的多少直接决定诱导时机。通过研究5ml/L、10ml/L、15ml/L的甘油量对目的蛋白表达的影响和最终湿重得率来确定最佳诱导时机。
[0135]图10是三个不同甘油量对应的单位目的蛋白表达量，由图可知:5ml/L甘油浓度时，表达量最高；10ml/L其次，但相差不多；而15ml/L相差较大。但是在甘油浓度为5ml/L时，最后菌体湿重低很多；10ml/L与15ml/L相差不多，所以最终确定甘油量加10ml/L。
[0136]6)不同的诱导温度和时间对目的蛋白表达的影响
[0137]考察30°C、25°C、16°C三个不同诱导温度对蛋白表达的影响，以及达到最大表达量时所用的时间。在诱导后每2h取样，诱导10h，处理样品，进行10%SDS-PAGE，其结果如图11所示:
[0138]由电泳图可知:30°C时，单位诱导表达量是最闻的，且达到最大表达所用时间是最短的，4h-6h之间的表达差异不大。而25°C、16°C时单位表达量就不如30°C，且表达时间长。故诱导温度和时间选用30°C、5h。
[0139]根据上述研究，最终确定了本发明的SpA5工程菌的优选发酵工艺:
[0140](I)基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L ；
[0141](2)发酵开始时，种子菌的接种量的比例是10% ；
[0142](3)在发酵过程中溶氧浓度始终保持在45%左右；
[0143](4)诱导时，温度调为30°C，IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。
[0144]2、工程菌发酵工艺放大
[0145]按照上述的优化条件对发酵规模进行扩大(25L)，并得到SpA5工程菌生长曲线(图12)和单位蛋白表达电泳图(图13)。
[0146]由图12可知，工艺放大后，整个生长曲线比较标准，前期细菌生长较快，后期诱导时曲线较平稳，最终获得菌密度(OD6tltl)达48，单位菌湿重50g/L。
[0147]由图13可知，从单位目的蛋白表达看:表达量随时间的延长有明显增加，5h表达
量最闻。
[0148]综上所述:SpA5工程菌发酵工艺放大成功，完全符合预期结果。本发明的发酵工艺可适用于大范围的工业生产应用。
[0149]本实施例中使用的工程菌是SpA5 (KKAA)，其它工程菌的发酵工艺与本菌一样。
[0150]实施例4:SpA5蛋白的制备和纯化
[0151]1、破菌制备上清
[0152]将实施例1中构建的各重组工程菌发酵，离心收集菌体。将菌体200_500g与20mmol/L PB, ρΗ7.0缓冲液按重量:体积比1:10比例混匀悬浮，4°C预冷。
[0153]高压匀浆:使用蒸馏水冲洗高压匀浆机(高压匀质机APV-1000，丹麦An InvernsysGroup)管道，低温循环系统开启预冷至1_4°C备用。将预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3_5次，取破菌液涂片进行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于2个视为破菌完全(破菌率大于90%)。
[0154]高速离心:破菌后的液体装入离心桶(Beckman,美国),4°C, 10, 000-15, OOOg离心15-30min,收集上清。
[0155]2、GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化
[0156]向每升上清中加入200ml GST填料，20~25°C时结合4h以上，结合过程采用垂直旋转或搅拌的方法以促进目标蛋白与GST填料的结合。将上述结合目标蛋白的GST填料采用PBS洗涤5个体积以除去未与GST填料结合的杂蛋白。然后按每100ml GST填料加入20ml的Prescission protease酶(PP酶),在20~25°C条件下酶切6小时后抽滤并收集滤液，获得酶切除GST标签后的目的蛋白，进行10%SDS-PAGE分析，结果如图14所示。图14所示的是SpA5 (KKAA)蛋白的纯化结果图，其它SpA5蛋白的纯化结果与SpA5 (KKAA)相似。
[0157]3、阳离子交换层析纯化
[0158]重组SpA5各突变体蛋白的理论等电点大于8。因此，首先选用了 GE公司常见的阳离子交换层析填料SP HP (强阳离子交换)、MMC及Phenyl HP进行精纯化，再使用Q HP对精纯化后的SpA5去内毒素。层析精纯工艺包括:
[0159](I)层析填料的选择
[0160]比较采用SP HP、MMC及Phenyl HP对SpA5蛋白的纯化效果。使用的样品为上述获得的SpA5粗纯化样品。
[0161]仪器系统:AKTA_expolrerl00/Avant25液相色谱系统(GE)
[0162]层析填料:SPHP、MMC、Phenyl HP
[0163]柱规格:①(C>)1.6c`mX(H)2.5cm,②(C>)2.6cmX(H)20cm,③(Φ>) 1.6cmX (H) 2.5cm ；
[0164]装柱体积:①③5ml X 2、②54ml ;
[0165]SP HP 缓冲液:缓冲液 A:20mM PB, ρΗ7.5 ;缓冲液 B:20mM PB+1M NaCl, pH7.5 ；
[0166]MMC 缓冲液:缓冲液 A:20mM Tris, pH8.0 ;缓冲液 B:20mM Tris-HCl+lM NaCl,pH8.0 ；
[0167]Phenyl HP 缓冲液:缓冲液 A:20mM PB+1.5M (NH4)2SO4, pH6.0 ;缓冲液 B:20mM PB,pH6.0 ；
[0168]上样样品:SpA5各突变体粗纯化样品分别调节至与纯化填料相对应缓冲液A—致的PH备用。
[0169]SP HP:上样流速:8ml/min,洗脱流速:8ml/min ；
[0170]洗脱程序:0_30%缓冲液B, 10个柱体积(CV)；
[0171]MMC:上样流速:12ml/min,洗脱流速:12ml/min ；
[0172]洗脱程序:0_30%缓冲液B, 7个柱体积(CV)；
[0173]Phenyl HP:上样流速:8ml/min,洗脱流速:8ml/min ;
[0174]洗脱程序:0-100%缓冲液B，10个柱体积(CV)。
[0175]各洗脱程序中其余份额的缓冲液是对应的缓冲液A。
[0176]收集:将目的蛋白各步洗脱样品进行SDS-PAGE纯度分析，评价纯化效果。
[0177]图15-20是SpA5 (KKAA)的纯化结果图，其它各SpA5蛋白的纯化结果与该蛋白结果一致。
[0178]从图15-20可以看出，在不同层析填料条件下，SP HP比MMC及Phenyl HP洗脱目的蛋白的纯度更高，可以达到90%以上，具有很好的层析纯化效果。因此，综合上述考虑，确定选择使用SP HP作为第一步层析纯化的填料。
[0179](2)层析纯化工艺的优化
[0180]在确立使用SP HP作为第一步填料的基础上，对此层析填料进行条件优化，主要优化的条件是上样样品电导及洗脱程序等，评价指标为SpA5的纯度及得率。
[0181]仪器系统:AKTA_explorerlOO液相色谱系统(GE Healthcare)；
[0182]层析填料:SP HP;
[0183]柱规格:(Φ)1.6cmX (H) 2.5cm ;
[0184]装柱体积:5mlΧ2;
[0185]缓冲液A:20mM PB, ρΗ7.5 ;缓冲液 B:20mM PB+1M NaCl, ρΗ7.5 ；
[0186]上样样品:SpA5粗纯化样品调节pH至8.0备用；
[0187]上样流速:8ml/min,洗脱流速:8ml/min ；
[0188]洗脱程序:①0-100%B，10个柱体积(CV)，②0_30%B，10个柱体积(CV);洗脱液中的其它份额为缓冲液A。
[0189]由图21-22可以看出，在低样品电导条件下，流穿中没有目的蛋白，且目的蛋白很早就出峰，而在图23-24中，提高样品中的电导，流穿中有明显的目的蛋白。为了提高蛋白的回收率，选用低样品电导作为上样条件。因此，综合上述考虑，确定上样样品电导为5ms/cm左右，洗脱程序为0-50%B，5CV。
[0190]4、硫酸铵沉淀纯化
[0191]通过SP HP层析纯化之后，SpA5纯度达到了 90%以上，但依然需要进一步纯化以便去除目的蛋白下方紧挨着的一条带。采用硫酸铵沉淀进行纯化，使SpA5沉淀，而杂蛋白存在于上清中。
[0192]硫酸铵沉淀条件的确定:
[0193]分别尝试SpA5经SP HP纯化后的样品与硫酸铵按不同比例混合后搅拌，离心，收集上清与沉淀，SDS-PAGE观察纯化效果。
[0194]样品:经SP HP纯化后的SpA5样品。
[0195]硫酸铵:3M(NH4) 2S04 ;
[0196]沉淀条件:4 V条件下，样品与3M (NH4) 2S04按1:2、1.4:1.6比例(V/V)混合后搅拌IOmin, 6000r/min,离心 20min ；
[0197]结果判定:分别收集离心后的上清与沉淀进行SDS-PAGE，评价不同浓度硫酸铵沉淀去除杂蛋白的效果(图25)。
[0198]图25是SpA5 (KKAA)的硫酸铵沉淀效果图，其它SpA5蛋白的沉淀效果与该蛋白一致。从图25的蛋白纯度检测比较可以看出:4°C条件下，SP HP纯化后的SpA5 (KKAA)样品与3M(NH4)2SO4以1.4:1.6 (V/V)比例混合去除残留杂蛋白的效果最好，纯度达到95%以上。因此，本发明中优选的沉淀条件是:4 V条件下，SpA5样品与3M (NH4) 2S04按1.4:1.6混合，然后离心，收集SpA5蛋白沉淀。
[0199]5、脱盐
[0200]采用疫苗稀释液平衡脱盐G25柱，将上步纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。
[0201]具体为:将上步获得的样品，用组氨酸缓冲液(组氨酸(Merck，美国，药用级)lOmmol/L,泊洛沙姆188 (Merck,美国，药用级)，0.01%w/v, NaCl 9g/L(西南制药))溶解，平衡层析系统(AKTA Explorer 100，美国GE Healthcare)及层析柱XK50-60 (美国GEHealthcare) (600mL Sephadex G 25),用流速 20mL/min 脱盐(脱去(NH4)2S04 及 PB)。
[0202]6、去内毒素
[0203]仪器系统:AKTA-explorer100 液相色谱系统(GE Healthcare);
[0204]层析填料:Q HP ;
[0205]柱规格:(Φ)2.6cm X (H) 20cm ;
[0206]装柱体积:50ml ；
[0207]缓冲液:缓冲液A:10mM His+0.01%泊洛沙姆188+0.9%NaCl, pH6.0，无内毒素(疫苗稀释液)；缓冲液B:1M NaOH ；
[0208]上样样品:将上步脱盐后样品调节至与缓冲液A—致pH备用。
[0209]用缓冲液B (lmol/L NaOH)在位清洗消毒5个柱体积，放置半小时后，使用疫苗稀释液平衡系统至PH为6.0，然后上样。流速:8ml/min。收集穿透峰即目的蛋白峰。 [0210]穿透峰样品进行10%SDS_PAGE结果如图26。
[0211]7、工艺放大
[0212]按照以上确定的条件进行工艺放大:所采用的SP HP层析柱规模放大为(Φ) 2.6cmX 01)20011，装柱体积(^=501111，0 HP 层析柱规模放大为(Φ) 2.6cmX (H) 20cm，装柱体积CV=50ml。重复三批次实验，SDS-PAGE分析SpA5纯化后的效果及得率，评价此工艺放大后的稳定性和可重复性。
[0213]从图27至图35可以看出，SpA5蛋白经SP HP层析工艺放大后，放大层析纯化模式和小量试验层析纯化色谱图无明显变化，经纯化后的SpA5纯度达到95%以上。
[0214]8、HPLC纯度检测
[0215]HPLC 仪 Agilentl260 (美国 Agilent 公司)，分析柱 ZorBaxSB-300-C34.6xl50mm3.5micron (美国 Agilent 公司)。
[0216]流动相:A:0.1% 三氟乙酸(Tedia，美国)，水(18.2ΜΩ ) ；B:0.1% 三氟乙酸(Tedia，美国)，乙臆(Tedia,美国)。
[0217]柱温60°C,流速 0.5mL/min,上样 10 μ I。
[0218]检测方法:0-30min:90%A, 10%B ;30_35min:100%B ;35_40min:90%A, 10%B ；40-45min:90%A,10%B。
[0219]检测结果如图36和表1所示。
[0220]由图36和表1可以看出，纯化的SpA5 (KKAA)突变体几乎无杂峰，主峰保留时间13.282分，主峰面积比率98.2%。其余各突变体结果类似。
[0221]表1:HPLC检测峰值
[0222]
【权利要求】
1.一种SpA5蛋白，所述蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID N0.1~4。
2.编码如权利要求1所述的SpA5蛋白的核苷酸序列，优选地，所述核苷酸序列选自SEQID N0.9 ~12。
3.一种包括如权利要求2所述的核苷酸序列的载体或宿主；优选地，所述载体是pGEX或pET系列表达载体，进一步优选地，所述载体是表达载体PGEX-6P-2 ;优选地，所述宿主是大肠杆菌XLl-Blue。
4.一种制备权利要求1所述的SpA5蛋白的方法，所述方法为化学合成法或核苷酸表达法。
5.一种发酵如权利要求3所述的宿主以表达权利要求1的蛋白的方法，包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的发酵培养基中，经诱导剂诱导一定时间而表达重组蛋白；优选地，所述发酵培养基选自动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB或植物源性M9 ;优选地，所述种子菌的接种量是5%~15%，进一步优选为10% ;优选地，所述发酵培养基中甘油量为5-15ml/L，进一步优选为10ml/L ;优选地，所述发酵培养基中溶氧量是25%~65%，进一步优选为45% ;优选地，所述发酵诱导剂是乳糖或IPTG ;优选地，所述诱导剂的浓度是100 μ mo I/L-1mmo I/L培养基，进一步优选为200 μ mol/L培养基；优选地，所述诱导温度为16~37°C，进一优选为30°C ;优选地，诱导时间为I~6小时，进一步优选为5小时。
6.一种在发酵如权利要求3所述的宿主后纯化如权利要求1所述的SpA5蛋白的方法，包括依次进行的亲和层析、阳离子交换层析、硫酸铵沉淀、脱盐和阴离子交换层析；优选地，在进行亲和层析之前，需要对宿主破菌，以将蛋白从菌体中释放出来；优选地，所述亲和层析为GST亲和层析结合Prescission蛋白酶酶切,进一步优选地,所述GST亲和层析为GST琼脂糖凝胶4B层析；优选地，所述阳离子交换层析使用填料为SP HP或CaptoMMC ;优选地，所述阳离子交换层析使用的平衡缓冲液是10-20mM PB, pH6.5-7.5，进一步优选地，所述平衡缓冲液是20mM PB, pH7.0;优选地，所述阳离子交换层析使用的洗脱缓冲液是10-20mM PB, 0.3-1.5M NaCl，pH6.5-7.5，进一步优选地，所述洗脱缓冲液是20mM PB，IM NaCl, pH7.0 ;优选地，所述洗脱缓冲液的洗脱程序是以0-50%洗脱缓冲液，5个柱体积进行梯度洗脱；优选地，所述硫酸铵沉淀步骤包括4°C条件下，将样品与3M(NH4)2S04按1:2~1.4:1.6(V:V)比例混合后搅拌IOmin,6000r/min,离心20min取沉淀；优选地，所述脱盐步骤使用G25脱盐柱，脱盐前先用该缓冲液溶解上述沉淀样品；优选地，所述阴离子交换层析使用Q HP;优选地，所述脱盐和阴离子交换层析使用的平衡缓冲液是5-15mM His,0.01-0.05% 泊洛沙姆 188，0.9%NaCl, pH5_7 ;进一步优选地是 IOmM His, 0.01% 泊洛沙姆188,0.9%NaCl, pH6.0。
7.根据权利要求1所述的SpA5蛋白在制备检测、预防或治疗金黄色葡萄球菌感染的制剂中的应用；优选地，所述制剂是疫苗。
8.包括如权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的载体或宿主的试剂盒或组合物。
9.由权利要求1所述的SpA5蛋白免疫产生的抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体在制备检测、预防或治疗金黄色葡萄球菌感染的制剂中的应用。
【文档编号】C07K1/22GK103694322SQ201310664945
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】曾浩, 邹全明, 樊绍文, 卢陆, 冯强, 吴翼 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学