专利名称：可诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽的制作方法
相关申请的交叉引用本申请要求2004年9月17日提交的美国临时申请No.60/610,814的优先权，并通过引用并入本发明。
背景技术：
本申请中引用的参考文献并非默认为请求保护的发明的现有技术。
金黄色葡萄球菌是一种可以引起广泛疾病和病症的病原体。由金黄色葡萄球菌引起的疾病的例子包括菌血症、感染性心内膜炎、毛囊炎、疔、痈、脓疱病、大疱性脓疱病、蜂窝织炎、葡萄状菌病、中毒性休克综合征、烫伤样皮肤综合征、中枢神经系统感染、感染性和发炎性眼病、osteomyletitis和其它关节及骨骼感染，及呼吸道感染(TheStaphylococci in Human Disease，Crossley and Archer(eds.)，ChurchillLivingstone Inc.1997.)基于免疫学的策略可用于控制金黄色葡萄球菌感染及金黄色葡萄球菌的散播。基于免疫学的策略包括被动和主动免疫。被动免疫是输入针对金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白。主动免疫是诱导针对金黄色葡萄球菌的免疫应答。
潜在的金黄色葡萄球菌疫苗可作用于金黄色葡萄球菌多糖和多肽。可用合适的金黄色葡萄球菌多糖或多肽为疫苗组分来实现这种作用。潜在的多糖疫苗组分的例子包括金黄色葡萄球菌5型和8型夹膜多糖(Shinefield et al，N.Eng.J.Med.346491-4-96，2002.)。可能作为疫苗组分的多肽的例子包括胶原蛋白黏附素、纤维蛋白原结合蛋白和聚集因子、(Mamo等，FEMS Immunology and Medical Microbiology1041-54，1994，Nilsson et al，J.Clin.Invest.1012640-2649，1998，Josefsson et al，The Journal of Infectious Diseases 1841572-1580，2001.)。
已通过金黄色葡萄球菌基因组测序获得了关于金黄色葡萄球菌多肽序列的信息(Kuroda et al，Lancet 3571225-1240，2001，Baba et al，Lancet 3591819-1827，2000，Kunsch等，于1997年7月30日公开的EP0 786 519)。生物信息学已在某种程度上用于辅助鉴定从基因组测序中获得的多肽序列(Kunsch等，于1997年7月30日公开的EP 0 786519)。
这些涉及展示技术和来源于感染患者血清等的技术方法，作为工作的一部分，可用于鉴定编码潜在抗原的基因(Foster等，WO01/98499，于2001年12月27日公开。Meinke等，WO02/059148，于2002年8月1日公开。Etz等，PNAS 996513-6578，2002.)发明概述本发明的特征在于包含与SEQ ID NO1在结构上相关的氨基酸序列的多肽以及这种多肽的用途。SEQ ID NO1是金黄色葡萄球菌一个全长多肽的截短衍生物。在本申请中该全长多肽指的是全长青霉素结合蛋白4(“PBP4”)。
发现SEQ ID NO1的一个组氨酸标签衍生物可产生针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答。
所述的“保护性”免疫或免疫应答表示的是针对金黄色葡萄球菌感染的可检测水平的保护作用。保护作用的水平可用诸如本申请中所描述的动物模型模型进行评估。
因此，本发明的第一方面描述了含与SEQ ID NO1至少85％同一的氨基酸序列的多肽免疫原，其中多肽不包含由SEQ ID NO3中398-431氨基酸所提供的羧基末端，且该多肽具有针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。SEQ ID NO3为全长PBP4多肽，其中398-431氨基酸为羧基末端区域。
所述的“免疫原”是指可提供保护性免疫的能力。
所述的含至少与SEQ ID NO1同一性为85％的氨基酸序列，其中所述多肽不包含由SEQ ID NO3中398-431氨基酸所提供的羧基末端，是指存在SEQ ID NO1的相关区域，而且也可以存在额外的多肽区域。如果存在额外的多肽区域，那么该多肽不包含由SEQ ID NO1中398-431氨基酸所提供的羧基末端。
与参考序列的百分比同一性(也指同一性百分比)是通过将多肽序列与参考序列进行比对，并测定相应区域相同氨基酸的数目而确定的。该数值除以参考序列(例如SEQ ID NO1)的氨基酸总数，然后乘以100，并取整为最近的整数。
本发明的另一方面描述了一种免疫原，它含有可提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的氨基酸序列，以及一个或多个与该多肽羧基末端或氨基末端共价连接的额外的区域或基团，其中每个区域或基团独立地选自具有至少一个以下特征的区域或基团增强免疫应答，利于纯化或利于多肽稳定性。
所述的“额外的区域或基团”是指不同于PBP4区域的区域或基团。例如，额外的区域或基团可以是额外的多肽区域或非肽区域。
本发明的另一方面描述了可在患者中诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的组合物。该组合物包括药学上可接受的载体和可提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的免疫有效剂量的免疫原。
免疫有效剂量是足以提供针对金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫的剂量。该剂量应足以显著性抑制金黄色葡萄球菌感染的可能性或严重程度。
本发明的另一方面描述了包含编码可提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的多肽的重组基因的核酸。重组基因包括编码多肽的重组核酸及与正确转录和加工相关的调控元件(可包括翻译和翻译后元件)。该重组基因可独立于宿主基因组或作为宿主基因组一部分而存在。
重组核酸是一种其序列和/或形式在自然界不存在的核酸。重组核酸的例子包括纯化的核酸、两个或多个结合在一起的核酸区域形成了与自然界所发现的有所不同的核酸，以及在天然状态互相连接的核酸区域(例如上游或下游区域)中缺失一个或多个。
本发明的另一方面描述了一种重组细胞。该细胞包括编码可提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的多肽的重组基因。
本发明的另一方面描述了制备可提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的多肽的方法。该方法包括培养含编码多肽的重组核酸的重组细胞以及纯化多肽。
本发明的另一方面描述了通过下述方法制备的可提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的多肽，该方法包括培养在宿主体内的含编码多肽的重组核酸的重组细胞以及纯化多肽的步骤。可使用不同的宿主细胞。
本发明的另一方面描述了在患者中诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的方法。该方法包括对所述患者给药免疫有效剂量的、可提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的免疫原的步骤。
除非特定术语是互相排斥的，所述的“或”是指一种或者两种可能性。有时诸如“和/或”这样的短语是用于强调两种可能性或者其中之一。
所述的诸如“包含”这样的未明确限定的术语可以有其它元件或步骤。有时诸如“一个或多个”这样的短语，同或者未同未明确限定的术语一起使用，用来强调另外元件或步骤的可能性。
除非明确指出，否则所提及诸如“a”或“an”这样的术语并不限定是指一个。例如“一个细胞”并不排除“多个细胞”。有时诸如一个或多个这样的短语是用于强调复数存在的可能性。
通过包括不同的实施例在内的本申请中其它描述可以使本发明的其它特点和优势显而易见。所提供的实施例表明的是实现本发明所用的不同组分和方法。实施例不限定请求保护的发明。基于本发明，熟练人员可确定并使用其它组分和方法来实现本发明。
附图的简要描述
图1所示的是SEQ ID NO2的氨基酸序列。粗体部分所示的是SEQ ID NO1.下划线部分添加到SEQ ID NO1中，从而得到SEQ IDNO2。
图2A和2B所示的是SEQ ED INO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的序列比较。序列之间的氨基酸差异用粗体表示。
图3所示的是编码SEQ ID NO2的核酸序列(SEQ ID NO9)。编码SEQ ID NO1的区域用粗体表示。编码其它序列的区域用下划线表示。
图4所示的是羟基磷酸铝佐剂(aluminum hydroxyphosphateadjuvant AHP)中SEQ ID NO2多肽的存活率数据。
发明的详细描述以SEQ ID NO2为例说明与SEQ ID NO1相关的多肽提供保护性免疫的能力。SEQ ID NO2是SEQ ID NO1的衍生物，含有在氨基末端增加的甲硫氨酸-丙氨酸-丝氨酸及羧基端的His-Tag。氨基末端的增加部分源于对编码序列进行的修饰以提供限制性位点。His-Tag利于对多肽进行纯化和鉴定。
SEQ ID NO1是PBP4的衍生物。全长PBP4多肽序列如SEQ IDNO3所示。SEQ ID NO1与SEQ ID NO3的不同在于缺失氨基末端的甲硫氨酸和398-431氨基酸。推测398-431氨基酸是参与膜结合的羧基疏水区。
与SEQ ID NO1在结构上相关的多肽包括含不同金黄色葡萄球菌菌株中的相应区域以及天然区域衍生物的多肽。SEQ ID NO1的氨基酸序列在图1中以粗体部分显示。图1也显示了SEQ ID NO2所示的氨基末端添加甲硫氨酸-丙氨酸-丝氨酸及羧基端添加His-Tag。
PBP4序列PBP4是青霉素结合蛋白(Henze et al，Antimicrobial Agents andChemotherapy 392415-2422，1995；Domanski等，Gene 167111-113，1995；Henze等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 402121-2125，1996；Henze et al，Microbial Drug Resistance 2193-199，1996；Domanskiet al，Journal of Bacteriology 7792651-2657，1997.)通过与已知PBP4序列相比较，根据是否具有高度序列相似性或连续的氨基酸可鉴定其它天然存在的PBP4序列。连续的氨基酸可作为特征标签。在不同的实施例中，天然存在的PBP4序列是在葡萄球菌，优选地是在金黄色葡萄球菌中发现的序列，具有SEQ ED NO1中至少20、至少30或至少50个连续的氨基酸；和/或与SEQ ID NO1序列相似性或同一性至少为85％。
序列相似性可通过本领域中已知的不同算法或技术进行测定。通常，通过比对两个序列以获得最大的氨基酸同一性、允许在其中一个序列中有间隔、增加或替代的技术来确定序列相似性。
例如，序列相似性可通过局部比对工具利用lalign程序(由Huangand Miller为《sim》程序开发，Adv.Appl Math.72337-357，1991)来测定。选项和环境变量为-f#对间隔中第一个残基的罚分(缺省为-14)；-g#对间隔中每个额外残基的罚分(缺省为-4)；-s str(SMATRIX)选择性记分矩阵文件的文件名。对蛋白序列而言，使用PAM250，序列比对的输出行长度为缺省-w#(LINLEN)(60)。
与SEO ID NO1相关的多肽与SEQ ID NO1“相关的”多肽含有与全长PBP4或其片段在结构上相关的区域。与SEQ ID NO1相关的多肽是与天然存在的PBP4相应区域序列同一性至少为85％的多肽。所述的“多肽”并不限定最小或最大长度。
与SEQ ID NO1至少85％同一的多肽与SEQ ID NO1相比可含有多达约56个氨基酸改变。在不同的实施方案中，与SEQ ID NO1相关的多肽与SEQ ID NO1有90％、至少94％或至少99％的同一性；与SEQ ID NO1的不同之处在于有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变；或主要由SEQ ID NO1的氨基酸组成。每个氨基酸改变是独立的增加、删除或替代。
所述的“主要由......组成”所指定的氨基酸组成是指存在所指的氨基酸，并可存在额外的氨基酸。额外的氨基酸可以是羧基或氨基末端。在不同的实施例中，可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个额外的氨基酸，在另外的实施例中，多肽包括SEQ ID NO1、甲硫氨酸-SEQ ID NO1、丙氨酸-丝氨酸-SEQ ID NO1或甲硫氨酸-丙氨酸-丝氨酸-SEQ ID NO1。
可对SEQ ID NO1进行改变，以得到可诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的衍生物。例如，可进行改变以获得保持诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的能力的衍生物，或获得除了可提供保护性免疫外，还具有可实现特定目的的区域的衍生物。
图2提供的序列比较可用于指导设计针对SEQ ID NO1的可能的改变。图2提供了不同的天然存在的序列SEQ ID NO3(COL，SA0699；www.tigr.org)；SEQ ID NO4(MSRA.SAR0652，Holden et al，PNAS101(26)9786-9791，2004)；SEQ ID NO5(SAV0642，Kuroda et al，Lancet 3571225-1240，2001)；SEQ ID NO6(MW2，MW0604 Babaet al，Lancet 359181 9-1827，2002，and MSSA，SAS608 Holden et al，PNAS 101(26)9786-9791，2004)；SEQ ID NO7(U29454，Domanskiet al Gene 167111-113 1995)和SEQ ID NO8(X91786，Henze et al，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 402121-2125，1996)。
另外，可根据其它PBP4序列和已知的氨基酸特性来进行改变。通常，为了在替换不同的氨基酸时仍可保持活性，优选地是将其改变为具有相同特性的氨基酸。氨基酸替代要考虑的因素包括氨基酸大小、电荷、极性和疏水性。在本领域中不同的氨基酸R-基团对氨基酸特性的影响是已知的(例如参见Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley，1987-2002，Appendix 1C.)在替换氨基酸并维持活性时，所替代的氨基酸应该具有一个或多个诸如近似相同的电荷和/或大小和/或极性和/或疏水性这样的相似特性。例如，将缬氨酸替换为亮氨酸、精氨酸替换为赖氨酸及天冬氨酸替换为谷氨酸都是很好的考虑，不会引起多肽功能的改变。
实现特定目的的改变包括那些利于多肽生产或功效；或者克隆编码核酸的改变。通过使用适于重组表达的起始密码子(即编码甲硫氨酸)可利于多肽生产。甲硫氨酸可在以后的细胞加工过程中除去。克隆可利于例如引入限制性位点--这同时会伴随氨基酸的增加或改变。
多肽诱导免疫应答的功效可通过抗原决定簇的增强而增强。可通过诸如改变锚定残基以改善肽对MHC分子的亲和性或增加肽-MHC复合物对T细胞受体的亲和性这样的不同的技术，来实现抗原决定簇的增强(Berzofsky et al，Nature Review of immunology 7209-219，2001.)优选地，多肽是纯化的多肽。“纯化多肽”存在于缺少一种或多种可与其天然结合的其它多肽的环境中，和/或代表了至少10％的总蛋白。在不同的实施例中，纯化多肽在样品或制剂中代表至少约50％、至少约75％或至少约95％的总蛋白。
在一个实施例中，多肽是“基本上纯化的”。基本上纯化的多肽存在于缺少与其天然结合的所有或绝大多数多肽的环境中。例如，充分纯化的金黄色葡萄球菌多肽存在于缺少所有或绝大多数其它金黄色葡萄球菌多肽的环境中。环境可以是，譬如，样品或制剂。
所述的“纯化”或“基本上纯化”并不要求多肽必须进行某种纯化，可以包括，譬如，未被纯化的化学合成的多肽。
可通过修饰多肽的羧基或氨基末端来增强多肽的稳定性。可能的修饰的例子包括诸如乙酰基、丙基、琥珀酰、苯甲基、苄基氧基羰基或叔丁氧羰基这样的氨基末端保护基团；和诸如酰胺、甲基酰胺和乙基酰胺这样的羧基末端保护基团。
在本发明的一个实施例中，多肽免疫原是含一个或多个与多肽在羧基末端或氨基末端共价连接的其它区域或基团的免疫原的一部分，其中每个区域或基团独立地选自具有至少一个以下特征的区域或基团增强免疫应答，利于纯化或利于多肽稳定性。例如，可以通过使用诸如位于氨基或羧基末端的聚乙烯乙二醇这样的基团来增强多肽的稳定性。
可通过在羧基或氨基末端添加利于纯化的基团来增强多肽的纯化。利于纯化的基团的例子包括具有亲和标签的多肽。亲和标签的例子包括6-组氨酸标签、trpE、谷胱甘肽和麦芽糖结合蛋白。
可用通常增强免疫应答的基团来增强多肽产生免疫应答的能力。可与多肽连接以增强抗该多肽的免疫应答的基团的例子包括诸如IL-2等细胞因子(Buchan et al，2000.Molecular Immunology 37545-552.)多肽生产可通过包括那些化学合成及从产生多肽的细胞中进行纯化等标准技术来生产多肽。多肽的化学合成技术在本领域是已知的(参见，例如，Vincent，Peptide and Protein Drug Delivery，New York，N.Y.，Decker，1990.)。重组多肽生产及纯化的技术在本领域也是已知的(参见，例如Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-2002.)。
通过重组核酸技术产生多肽这样的方式可以方便地从细胞中获得多肽。产生多肽的重组核酸技术包括向细胞中导入或产生编码多肽的重组基因以及表达该多肽。
重组基因含有编码多肽的核酸，并带有用于多肽表达的调控元件。重组基因可存在于细胞基因组中或作为表达载体的一部分。
作为重组基因一部分的调控元件包括与多肽编码序列天然结合的元件及不与多肽编码序列天然结合的外源调控元件。诸如外源启动子这样的外源调控元件可用于在特定的宿主中表达重组基因或增加表达水平。通常，重组基因中的调控元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和选择性存在的操作子。在真核细胞加工中的优选元件是多聚腺苷酸化信号。
使用表达载体可利于重组基因在细胞中的表达。优选地，表达载体除了重组基因外还包括在宿主细胞中进行自主复制的复制原点、选择标记、有限个数目可以使用的限制性酶位点及高拷贝数的能力。表达载体的例子是克隆载体、修饰的克隆载体、特别设计的质粒和病毒。
由于遗传密码子具有简并性，所以许多不同的编码核酸序列可用于编码同一个特定的多肽。遗传密码子的简并性的产生是由于几乎所有氨基酸是都由核苷酸三聚体的不同组合或“密码子”编码的。氨基酸是用以下密码子编码的A＝Ala＝丙氨酸密码子GCA，GCC，GCG，GCUC＝Cys＝半胱氨酸密码子UGC，UGUD＝Asp＝天冬氨酸密码子GAC，GAUE＝Glu＝谷氨酸密码子GAA，GAGF＝Phe＝苯丙氨酸密码子UUC，UUUG-＝Gly＝甘氨酸密码子GGA，GGC，GGG，GGUH＝His＝组氨酸密码子CAC，CAUI＝Ile＝异亮氨酸密码子AUA，AUC，AUUK＝Lys＝赖氨酸密码子AAA，AAGL＝Leu＝亮氨酸密码子UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUUM＝Met＝甲硫氨酸密码子AUGN＝Asn＝天冬酰胺密码子AAC，AAUP＝Pro＝脯氨酸 密码子CCA，CCC，CCG，CCUQ＝Gln＝谷氨酰胺密码子CAA，CAGR＝Arg＝精氨酸密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGUS＝Ser＝丝氨酸密码子AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCUT＝＝Thr＝苏氨酸密码子ACA，ACC，ACG，ACUV＝VaI＝缬氨酸密码子GUA，GUC，GUG，GUUW＝Trp＝色氨酸密码子UGGY＝Tyr＝酪氨酸密码子UAC，UAU用于表达与SEQ ID NO1相关的多肽的重组核酸的合适细胞是原核细胞和真核细胞。原核细胞的例子包括大肠杆菌；诸如金黄色葡萄球菌这样的葡萄球菌属成员；诸如植物乳杆菌(L.plantarum)这样的乳酸菌属成员；诸如乳酸乳杆菌(L.lactis)这样的乳球菌属成员；及诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)这样的芽孢杆菌属成员。真核细胞的例子包括哺乳动物细胞；昆虫细胞；诸如酵母属成员(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))这样的酵母细胞，毕赤氏酵母属成员(例如巴斯德毕赤氏酵母(P. pastoris))，汉逊酵母属成员(例如多形汉逊酵母(H.polymorpha))，克鲁维酵母属成员(例如乳克鲁维酵母(K.lactis)或脆壁克鲁维酵母(K.fragilis))和裂殖酵母属成员(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe))。
重组基因产生、导入到细胞中及重组基因表达的技术在本领域中是已知的。通过诸如Ausubel，Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley，1987-2002，及Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989这样的参考文献，提供了这些技术的例子。
如果需要，可通过密码子优化来增强在特定宿主中的表达。密码子优化包括使用更优选的密码子。在不同宿主中进行密码子优化的技术在本领域中是众所周知的。
与SEQ ID NO1相关的多肽可以包含翻译后的修饰，例如N-连接的糖基化，O-连接的糖基化或乙酰化。所述的“多肽”或多肽的“氨基酸”序列包括来自诸如哺乳动物、昆虫或酵母宿主细胞这样的宿主细胞、含一个或多个具有翻译后修饰结构的氨基酸的多肽。
翻译后修饰可通过化学方法产生或使用合适的宿主产生。例如，在酿酒酵母中，倒数第二个氨基酸的性质可用来判定N末端甲硫氨酸是否被除去。另外，倒数第二个氨基酸的性质也可用来判定N末端氨基酸是否是Na-乙酰化的(Huang等，Biochemistry 268242-8246，1987)。另一个例子包括由于存在分泌引导序列(例如信号肽)而可进行分泌的多肽，其中多肽是通过N-连接或O-连接糖基化进行修饰的(Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem. 56915-944，1987.)。
佐剂佐剂是可协助免疫原产生免疫应答的物质。佐剂可通过诸如以下一个或多个不同的机制来行使功能增强抗原的生物学或免疫学半衰期；提高抗原对抗原呈递细胞的递送；提高通过抗原呈递细胞对抗原的加工和呈递；及诱导产生免疫调节的细胞因子(Vogel，ClinicalInfectious Diseases 30(suppl.3)S266-270，2000.)。
可使用多种不同类型的佐剂来辅助产生免疫应答。特定佐剂的例子包括氢氧化铝、磷酸铝或其它铝盐、磷酸钙、DNA CpG元件、单磷酯酰脂A、霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素、百日咳毒素、胞壁酰二肽、弗氏不完全佐剂、MF59、SAF、免疫刺激复合物、脂质体、可生物降解的微体、皂甙、非离子阻断共聚物、胞壁酰肽类似物、聚磷腈、合成的多聚核苷酸、IFN-γ、IL-2、IL-12和ISCOMS(Vogel ClinicalInfectious Diseases 30(suppl 3)S266-270，2000，Klein等，Journal ofPharmaceutical Sciences 89311-321，2000，Rimmelzwaan等，Vaccine791180-1187，2001，Kersten Vaccine 27915-920，2003，O’Hagen Curr.Drug Target Infect.Disord.，7273-286，2001.)诱导保护性免疫的患者“患者”是指能被金黄色葡萄球菌感染的哺乳动物。患者可进行预防性或治疗性治疗。预防性治疗可提供足够的降低金黄色葡萄球菌感染的可能性或严重性的保护性免疫。治疗性治疗可用来降低金黄色葡萄球菌感染的严重性。
可用含本申请所述的免疫原的疫苗进行预防性治疗。这种治疗优选地用于人。可对普通人群或对感染金黄色葡萄球菌具有更高风险的人施用疫苗。
对感染金黄色葡萄球菌具有更高风险的人包括健康护理工作者；医院患者；免疫系统虚弱的患者；进行手术的患者；接受外源身体移植，例如导尿管或血管装置的患者；面临导致会削弱免疫的治疗的患者；及所从事职业具有更高烧伤或创伤风险的人(The Staphylococci inHuman Disease，Crossley and Archer(ed.)，Churchill Livingstone Inc.1997.)。
可感染金黄色葡萄球菌的非人类患者包括牛、猪、绵羊、山羊、兔、马、狗、猫和鼠。对非人类患者的治疗用于保护宠物和家畜，及评估特定治疗方法的有效性。
联合疫苗与SEQ ID NO1相关的多肽可单独使用，或与其它免疫原联合使用，来诱导免疫应答。其它免疫原包括一个或多个诸如在上述发明背景中所述的其它金黄色葡萄球菌免疫原；一个或多个针对一个或多个诸如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)或路邓氏葡萄球菌(S.lugunensis)这样的其它葡萄球菌微生物的免疫原；及一个或多个针对其它感染微生物的免疫原。
动物模型系统动物模型系统用于评估免疫原产生针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的有效性。动物模型是一种慢动力学致死模型，包括在静止期从细胞中制备金黄色葡萄球菌，合适的滴定及静脉内给药。该死亡慢动力学可提供足够的时间产生特定的免疫保护来对抗细菌感染(例如10天而不是24小时)。
可从生长在固体培养基上的细胞中获得静止期的金黄色葡萄球菌细胞。也可从液体中获得这种细胞，但生长在固体培养基上的细胞其结果更具有重复性。细胞可在固体培养基上很方便地生长过夜。例如，金黄色葡萄球菌可在加倍时间约为20-30分钟的条件下生长约18到24小时。
可用标准技术从固体或液体培养基中分离金黄色葡萄球菌，并维持金黄色葡萄球菌的效力。分离的金黄色葡萄球菌可在含甘油的磷酸缓冲盐中以洗涤的高密度悬浮液(＞109克隆形成单位(CFU)/mL)保存在例如-70℃。
金黄色葡萄球菌的激发应从第一天或第二天开始，在约7到10天的时间内在动物模型中具有80到90％致死率的效力。可用动物模型进行滴定实验，来监测储存的金黄色葡萄球菌接种物的效力。在接种实验1到2周之前进行滴定实验。
给药可根据本申请提供的指导及本领域已知的技术配置免疫原并对患者给药。药物给药的说明通常在例如Vaccines Eds.Plotkin andOrenstein，W.B.Sanders Company，1999；Remington′s PharmaceuticalSciences 20thEdition，Ed.Gennaro，Mack Publishing，2000；及ModernPharmaceutics 2ndEdition，Eds.Banker and Rhodes，Marcel Dekker，Inc.，1990中提供，它们都通过参考整合在文中。
药学上可接受的载体利于储存以及将免疫原施用于患者。药学上可接受的载体可以包含诸如缓冲液、用于注射的灭菌水、普通盐或磷酸缓冲盐、蔗糖、组氨酸、盐和聚山梨醇酯这样的不同成分。
免疫原可通过诸如皮下、肌肉内或黏膜这样的不同途径给药。皮下和肌肉内给药可通过例如注射器或射流泵(jetinjector)进行。
根据本领域中已知的因素--包括年龄、体重、性别和患者的疾病状况；给药途径；期望效果和所用的特定混合物，来确定合适的剂量用法。可以多剂量疫苗方式使用免疫原。期望每剂可含有范围为1.0μg到1.0mg的总多肽，在本发明的不同实施例中，该范围是0.01mg到1.0mg和0.1mg到1.0mg。
剂量时间依赖于本领域中已知的因素。在最初给药后，可随后给药一次或多次加强剂量来维持或加强抗体滴度。剂量用法的例子可以是第一天、1个月、第三剂在4、6或12个月，如果需要可在间隔的时间给药额外的加强剂量。
抗体产生与SEQ ID NO1相关的多肽可用于产生与多肽或金黄色葡萄球菌结合的抗体和抗体片段。这种抗体和抗体片段具有不同的用途，包括用于多肽纯化、金黄色葡萄球菌鉴定、或针对金黄色葡萄球菌感染的治疗性或预防性治疗。
抗体可以是多克隆或单克隆的。产生和使用抗体的技术在本领域中是众所周知的。这些技术的例子在Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley，1987-2002，Harlow等，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory，1988，and Kohler etal，Nature 256495-497，1975.中有描述。
实施例以下提供的实施例进一步阐释本发明的不同特征。实施例也阐述了实现本发明的可用方法。这些实施例并不作为对本发明的限定。
实施例1保护性免疫本实施例阐述了与SEQ ID NO1相关的多肽在动物模型中提供保护性免疫的能力。作为SEQ ID NO1衍生物的SEQ ID NO2，用于提供保护性免疫。
SEQ ID NO2的克隆和表达将蛋白用具有载体编码的His标签残基的pET24b载体(Novagen)来进行表达。载体提供了起始的Met密码子，随后是在N末端的Ala和Ser密码子，并在C末端添加了Leu、Glu、(His)6和终止密码子(SEQID NO2的378-385氨基酸)。所设计的DNA序列编码385个氨基酸的成熟pbp4的变型(COL-SA0699)。
pbp4 DNA序列通过Vector NTI软件翻译，对得到的氨基酸序列(SEQ ID NO1)进行分析。设计PCR引物来扩增从第25个残基(Thr)起始以除去信号肽序列、到第398个密码子(Glu)终止以除去C末端膜结合位点的基因。正向PCR引物含有NheI限制位点以利于克隆到表达载体中。反向PCR引物含有Xhol限制位点以利于克隆到表达载体中。
将PCR扩增序列用NheI和XhoI消化，并连接到用相同的两个酶消化的pET24b载体(Novagen)中。将连接反应物转入大肠杆菌NovaBlue，并在含50μg/mL卡那霉素的LB中通过生长状况来筛选克隆。制备DNA(Qiagen)，并通过限制消化和序列测定来确定插入片段的完整性。从所需序列中筛选DNA没有发生改变的克隆。
转化大肠杆菌BLR(DE3)细胞(Novagen)，并在含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上培养。从LB(卡那霉素)平板上挑取单克隆接种到液体LB(卡那霉素)培养基中，并在37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物稀释到新鲜LB(卡那霉素)中，培养至A600在0.6到1.0之间，回收未诱导细胞的沉淀，将其余培养物加入IPTG至终浓度1mM进行诱导，并使其表达3小时。通过在5000×g室温下离心3分钟，从1ml培养物中回收细胞沉淀。将细胞沉淀重悬在200μl裂解缓冲液(Bugbuster，具有蛋白酶抑制剂，Novagen)中，然后回收诱导样品的可溶性和不溶性组分。在90℃加热样品3分钟前加入等体积上样缓冲液(添加β-巯基乙醇至终浓度5％)。在Novex 4-12％Tris-甘氨酸凝胶中分离提取物，分析蛋白(考马斯兰染色)，并在硝化纤维素上进行印迹反应，以抗HIS6抗体(Zymed)为探针。
SEQ ID NO2纯化将冻存的重组大肠杆菌细胞(39.7克)溶解，并重悬在100ml裂解缓冲液(蛋白酶抑制剂混合物(Roche#1873580，每10克细胞用1片)，50mM磷酸钠，pH8.0、0.15M NaCl、2rnM氯化镁、10mM咪唑、0.1％Tween-80和0.02％叠氮化钠)中。
向细胞悬浮液中以每克细胞浆1毫升的量加入Benzonase(250单位/毫升，EM#1.10697.O002)。用微射流机制备裂解物。将裂解物在4℃振荡2.5小时。然后通过在4℃，10,000×g离心10分钟而纯化裂解物。通过5微米玻璃纤维过滤器(Millipore#AP2504700)过滤上清。向滤液中加入5M NaCl储液至终浓度0.5M。将滤液与Ni-NTA琼脂糖色谱树脂(Qiagen#30250)混合，在4℃搅拌过夜。
将色谱树脂浆加到色谱柱上，从柱出口通过重力收集未结合组分。用50mM磷酸钠、pH8.0、0.5M NaCl、2mM氯化镁、10mM咪唑及0.1％Tween-80洗涤柱，并用洗脱缓冲液(0.3M咪唑，0.15M NaCl和20mM Tris-HCl，pH8.0)洗脱柱。含蛋白产物的组分通过在硝化纤维素膜上通过点印迹用Ponceau-S染色而鉴定。将含蛋白的组分收集而得到Ni-IMAC产物。通过SEC对Ni-IMAC产物进行分馏，含产物的组分通过SDS/PAGE及考马斯兰染色进行鉴定。收集纯度和浓度最高的SEC组分而得到SEC产物。将SEC产物灭菌过滤，并吸附在羟基磷酸铝佐剂上至终浓度为0.2mg/ml。
金黄色葡萄球菌激发的制备将金黄色葡萄球菌在TSA平板上于37℃培养过夜。向平板上加入5ml PBS将细菌从TSA平板上洗下，并用灭菌涂布器将细菌轻轻重悬。将细菌重悬物于6000rpm用Sorvall RC-5B离心机(DuPontInstruments)离心20分钟。将沉淀重悬在16％甘油中，并等分冷冻储存在-70℃。
在使用前，将菌液溶解，适当稀释后用于感染。每个储液至少滴定3次，以确定在空白小鼠中诱导慢动力致死的合适剂量。持续监测细菌菌液的效力(80-90％致死率)，以确定模型的重复性。在每次激发实验10天前，对10个对照动物(单独用佐剂免疫)的组进行激发和监测。
SEQ ID NO2多肽的保护性研究将20只BALB/c鼠用3个剂量的于羟基磷酸铝佐剂(每个剂量450μg)上的SEQ ID NO2多肽(每个剂量20μg)进行免疫。羟基磷酸铝佐剂(AHP)在Klein等，Journal of Pharmaceutical Sciences 89，311-321，2000有所描述。剂量按照在0、7和21天给药100微升含20微克肌肉内注射剂(每条腿50微升)的方式给药。在28天对鼠采血，通过ELISA对与SEQ ID NO2产生应答的抗体血清进行定量。
在实验的第35天用金黄色葡萄球菌(5-9×108CFU/鼠)激发鼠，并针对仅用AHP免疫的20只鼠的对照组进行评估。以10天为一个周期监测鼠的存活。在实验结束时，SEQ ID NO2免疫组有5只鼠存活，而相比较AHP组有1只存活。结果如图4所示。
其它的实施方案在以下权利要求范围内。虽然已给出并描述了几个实施例，但仍可在不偏离本发明主旨和范围的情况下进行各种改变。
序列表<110>Merck&Co.，Inc.
<120>可诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽<130>PCT21675<150>60/610,814<151>2004-09-17<160>9<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>374<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>金黄色葡萄球菌(S.Aureus)全长序列的衍生物<400>1Thr Asn Ser Asp Val Thr Pro Val Gln Ala Ala Asn Gln Tyr Gly Tyr1 5 10 15Ala Gly Leu Ser Ala Ala Tyr Glu Pro Thr Ser Ala Val Asn Val Ser20 25 30Gln Thr Gly Gln Leu Leu Tyr Gln Tyr Asn Ile Asp Thr Lys Trp Asn35 40 45Pro Ala Ser Met Thr Lys Leu Met Thr Met Tyr Leu Thr Leu Glu Ala50 55 60Val Asn Lys Gly Gln Leu Ser Leu Asp Asp Thr Val Thr Met Thr Asn65 70 75 80Lys Glu Tyr Ile Met Ser Thr Leu Pro Glu Leu Ser Asn Thr Lys Leu85 90 95Tyr Pro Gly Gln Val Trp Thr Ile Ala Asp Leu Leu Gln Ile Thr Val100 105 110Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ala Lys Lys Val Ser115 120 125Lys Asn Thr Ser Asp Phe Val Asp Leu Met Asn Asn Lys Ala Lys Ala130 135 140Ile Gly Met Lys Asn Thr His Phe Val Asn Pro Thr Gly Ala Glu Asn
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<223>含有在氨基末端增加的甲硫氨酸-丙氨酸-丝氨酸及羧基端的His-Tag的SEQID NO1的衍生物<400>2Met Ala Ser Thr Asn Ser Asp Val Thr Pro Val Gln Ala Ala Asn Gln1 5 10 15Tyr Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Tyr Glu Pro Thr Ser Ala Val
20 25 30Asn Val Ser Gln Thr Gly Gln Leu Leu Tyr Gln Tyr Asn Ile Asp Thr35 40 45Lys Trp Asn Pro Ala Ser Met Thr Lys Leu Met Thr Met Tyr Leu Thr50 55 60Leu Glu Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Ser Leu Asp Asp Thr Val Thr65 70 75 80Met Thr Asn Lys Glu Tyr Ile Met Ser Thr Leu Pro Glu Leu Ser Asn85 90 95Thr Lys Leu Tyr Pro Gly Gln Val Trp Thr Ile Ala Asp Leu Leu Gln100 105 110Ile Thr Val Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ala Lys115 120 125Lys Val Ser Lys Asn Thr Ser Asp Phe Val Asp Leu Met Asn Asn Lys130 135 140Ala Lys Ala Ile Gly Met Lys Asn Thr His Phe Val Asn Pro Thr Gly145 150 155 160Ala Glu Asn Ser Arg Leu Arg Thr Phe Ala Pro Thr Lys Tyr Lys Asp165 170 175Gln Glu Arg Thr Val Thr Thr Ala Arg Asp Tyr Ala Ile Leu Asp Leu180 185 190His Val Ile Lys Glu Thr Pro Lys Ile Leu Asp Phe Thr Lys Gln Leu195 200 205Ala Pro Thr Thr His Ala Val Thr Tyr Tyr Thr Phe Asn Phe Ser Leu210 215 220Glu Gly Ala Lys Met Ser Leu Pro Gly Thr Asp Gly Leu Lys Thr Gly225 230 235 240Ser Ser Asp Thr Ala Asn Tyr Asn His Thr Ile Thr Thr Lys Arg Gly245 250 255Lys Phe Arg Ile Asn Gln Val Ile Met Gly Ala Gly Asp Tyr Lys Asn260 265 270Leu Gly Gly Glu Lys Gln Arg Asn Met Met Gly Asn Ala Leu Met Glu275 280 285Arg Ser Phe Asp Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Ile Leu Ser Lys Gly Glu290 295 300Gln Arg Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Tyr Asp305 310 315 320Val Leu Pro Ser Asp Phe Ser Lys Lys Asp Tyr Lys Leu Val Val Glu325 330 335Asp Gly Lys Val His Ala Asp Tyr Pro Arg Glu Phe Ile Asn Lys Asp340 345 350Tyr Gly Pro Pro Thr Val Glu Val His Gln Pro Ile Ile Gln Lys Ala355 360 365Asn Thr Val Ala Lys Ser Met Trp Glu Leu Glu His His His His His
370375380His385<210>3<211>431<212>PRT<213>金黄色葡萄球菌<400>3Met Lys Asn Leu Ile Ser Ile Ile Ile Ile Leu Cys Leu Thr Leu Ser1 5 10 15Ile Met Thr Pro Tyr Ala Gln Ala Thr Asn Ser Asp Val Thr Pro Val20 25 30Gln Ala Ala Asn Gln Tyr Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Tyr Glu35 40 45Pro Thr Ser Ala Val Asn Val Ser Gln Thr Gly Gln Leu Leu Tyr Gln50 55 60Tyr Asn Ile Asp Thr Lys Trp Asn Pro Ala Ser Met Thr Lys Leu Met65 70 75 80Thr Met Tyr Leu Thr Leu Glu Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Ser Leu85 90 95Asp Asp Thr Val Thr Met Thr Asn Lys Glu Tyr Ile Met Ser Thr Leu100 105 110Pro Glu Leu Ser Asn Thr Lys Leu Tyr Pro Gly Gln Val Trp Thr Ile115 120 125Ala Asp Leu Leu Gln Ile Thr Val Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ala Ala130 135 140Leu Ile Leu Ala Lys Lys Val Ser Lys Asn Thr Ser Asp Phe Val Asp145 150 155 160Leu Met Asn Asn Lys Ala Lys Ala Ile Gly Met Lys Asn Thr His Phe165 170 175Val Asn Pro Thr Gly Ala Glu Asn Ser Arg Leu Arg Thr Phe Ala Pro180 185 190Thr Lys Tyr Lys Asp Gln Glu Arg Thr Val Thr Thr Ala Arg Asp Tyr195 200 205Ala Ile Leu Asp Leu His Val Ile Lys Glu Thr Pro Lys Ile Leu Asp210 215 220Phe Thr Lys Gln Leu Ala Pro Thr Thr His Ala Val Thr Tyr Tyr Thr225 230 235 240Phe Asn Phe Ser Leu Glu Gly Ala Lys Met Ser Leu Pro Gly Thr Asp245 250 255Gly Leu Lys Thr Gly Ser Ser Asp Thr Ala Asn Tyr Asn His Thr Ile
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<213>金黄色葡萄球菌<400>5Met Lys Asn Leu Ile Ser Ile Ile Ile Ile Leu Cys Leu Thr Leu Ser1 5 10 15Ile Met Thr Pro Tyr Ala Gln Ala Thr Asn Ser Asp Val Thr Pro Val20 25 30Gln Ala Ala Asn Gln Tyr Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Tyr Glu35 40 45Pro Thr Ser Ala Val Asn Val Ser Gln Thr Gly Gln Leu Leu Tyr Gln50 55 60Tyr Asn Ile Asp Thr Lys Trp Asn Pro Ala Ser Met Thr Lys Leu Met65 70 75 80Thr Met Tyr Leu Thr Leu Glu Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Ser Leu85 90 95Asp Asp Thr Val Thr Met Thr Asn Lys Glu Tyr Ile Met Ser Thr Leu100 105 110Pro Glu Leu Ser Asn Thr Lys Leu Tyr Pro Gly Gln Val Trp Thr Ile115 120 125Ala Asp Leu Leu Gln Ile Thr Val Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ala Ala130 135 140Leu Ile Leu Ala Lys Lys Val Ser Lys Asn Thr Ser Asp Phe Val Asp145 150 155 160Leu Met Asn Asn Lys Ala Lys Ala Ile Gly Met Lys Asn Thr His Phe165 170 175Val Asn Pro Thr Gly Ala Glu Asn Ser Arg Leu Arg Ser Phe Ala Pro180 185 190Thr Lys Tyr Lys Asp Gln Glu Arg Thr Val Thr Thr Ala Arg Asp Tyr195 200 205Ala Ile Leu Asp Leu His Val Ile Lys Glu Thr Pro Lys Ile Leu Asp210 215 220Phe Thr Lys Gln Leu Ala Pro Thr Thr His Ala Val Thr Tyr Tyr Thr225 230 235 240Phe Asn Phe Ser Leu Glu Gly Ala Lys Met Ser Leu Pro Gly Thr Asp245 250 255Gly Leu Lys Thr Gly Ser Ser Asp Thr Ala Asn Tyr Asn His Thr Ile260 265 270Thr Thr Lys Arg Gly Lys Phe Arg Ile Asn Gln Val Ile Met Gly Ala275 280 285Gly Asp Tyr Lys Asn Leu Gly Gly Glu Lys Gln Arg Asn Met Met Gly290 295 300Asn Ala Leu Met Glu Arg Ser Phe Asp Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Ile305 310 315 320Leu Ser Lys Gly Glu Gln Arg Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Val Glu
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385 390 395 400Pro Leu Phe Thr Ile Ile Gly Gly Thr Cys Leu Val Ala Gly Leu Ala405 410 415Leu Ile Va1 His Met Ile Ile Asn Arg Leu Phe Arg Lys Arg Lys420 425 430<210>8<211>431<212>PRT<213>金黄色葡萄球菌<400>8Met Lys Asn Leu Ile Ser Ile Ile Ile Ile Leu Cys Leu Thr Leu Ser1 5 10 15Ile Met Thr Pro Tyr Ala Gln Ala Thr Asn Ser Asp Val Thr Pro Val20 25 30Gln Ala Ala Asn Gln Tyr Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Tyr Glu35 40 45Pro Thr Ser Ala Val Asn Val Ser Gln Thr Gly Gln Leu Leu Tyr Gln50 55 60Tyr Asn Ile Asp Thr Lys Trp Asn Pro Ala Ser Met Thr Lys Leu Met65 70 75 80Thr Met Tyr Leu Thr Leu Glu Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Ser Leu85 90 95Asp Asp Thr Val Thr Met Thr Asn Lys Glu Tyr Ile Met Ser Thr Leu100 105 110Pro Glu Leu Ser Asn Thr Lys Leu Tyr Pro Gly Gln Val Trp Thr Ile115 120 125Ala Asp Leu Leu Gln Ile Thr Val Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ala Ala130 135 140Leu Ile Leu Ala Lys Lys Val Ser Lys Asn Thr Ser Asp Phe Val Asp145 150 155 160Leu Met Asn Asn Lys Ala Lys Ala Ile Gly Met Lys Asn Thr His Phe165 170 175Val Asn Pro Thr Gly Ala Glu Asn Ser Arg Leu Arg Thr Phe Ala Pro180 185 190Thr Lys Tyr Lys Asp Gln Glu Arg Thr Val Thr Thr Ala Arg Asp Tyr195 200 205Ala Ile Leu Asp Leu His Val Ile Lys Glu Thr Pro Lys Ile Leu Asp210 215 220Phe Thr Lys Gln Leu Ala Pro Thr Thr Leu Ala Val Thr Tyr Tyr Thr225 230 235 240Phe Asn Phe Ser Leu Glu Gly Ala Lys Met Ser Leu Pro Gly Thr Asp
245 250 255Gly Leu Lyr Thr Gly Ser Ser Asp Thr Ala Asn Tyr Asn His Thr Ile260 265 270Thr Thr Lys Arg Gly Lys Phe Arg Ile Asn Gln Val Ile Met Gly Ala275 280 285Gly Asp Tyr Lys Asn Leu Gly Gly Glu Lys Gln Arg Asn Met Met Gly290 295 300Asn Ala Leu Met Glu Arg Ser Phe Asp Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Ile305 310 315 320Leu Ser Lys Gly Glu Gln Arg Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Val Glu325 330 335Asn Asp Leu Tyr Asp Val Leu Pro Ser Asp Phe Ser Lys Lys Asp Tyr340 345 350Lys Leu Val Val Glu Asp Gly Lys Val His Ala Asp Tyr Pro Arg Glu355 360 365Phe Ile Asn Lys Asp Tyr Gly Pro Pro Thr Val Glu Val His Gln Pro370 375 380Ile Ile Gln Lys Ala Asn Thr Val Ala Lys Ser Met Trp Glu Glu His385 390 395 400Pro Leu Phe Thr Ile Ile Gly Gly Thr Cys Leu Val Ala Gly Leu Ala405 410 415Leu Ile Val His Met Ile Ile Asn Arg Leu Phe Arg Lys Arg Lys420 425 430<210>9<211>1158<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码SEQ ID NO2的核酸<400>9atggctagca ctaacagtga cgtaacccct gtacaagcag caaatcaata tggttatgca 60ggtttgtcgg ctgcatacga accgacgagt gctgttaatg taagtcaaac tggacaatta 120ctgtatcaat acaatatcga tactaagtgg aatccagcgt ctatgactaa attaatgaca 180atgtacttaa cattggaagc tgtaaataag gggcagcttt cacttgatga cacagtcaca 240atgacgaaca aagaatatat tatgtctaca ctacctgagt tgagtaatac gaaactatat 300cctggacaag tatggacaat cgcagaccta ttacaaatta cagtatctaa ttctagtaat 360gccgcggcat taattttagc taagaaggtt tcaaaaaaca ccagcgattt cgttgattta 420atgaataaca aagctaaagc tatcggaatg aaaaatacac atttcgtcaa tccaacgggt 480gctgaaaatt caagattacg tacatttgca ccaacaaagt ataaagacca agaacgtact 540gtaacgactg ctagagacta tgccatttta gatttacacg tgattaaaga gacacctaaa 600
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权利要求
1.一种含与SEQ ID NO1的同一性至少为85％的氨基酸序列的多肽免疫原，其中所述多肽可针对金黄色葡萄球菌(S.aureus)提供保护性免疫，而且其中如果存在一个或多个额外的多肽区域，所述额外区域不是含SEQ ID NO3中羧基末端的398-431位氨基酸。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽由与SEQ ID NO1的同一性至少为94％的氨基酸序列组成。
3.权利要求2的多肽，其中所述多肽主要由SEQ ID NO1中4-385的氨基酸组成。
4.权利要求3的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO1、甲硫氨酸-SEQ ID NO1、丙氨酸-丝氨酸-SEQ ID NO1或甲硫氨酸-丙氨酸-丝氨酸-SEQ ID NO1的氨基酸序列组成。
5.一种免疫原，其包含与SEQ ID NO1的同一性至少为85％的氨基酸序列及一个或多个与所述氨基酸序列在羧基末端或氨基末端共价连接的额外的区域或基团，其中每个区域或基团独立地选自具有至少一个以下特性的区域或基团，所述的特性指增强免疫应答，利于纯化或利于多肽稳定性。
6.一种能在患者中诱导保护性免疫应答的组合物，它包含免疫有效剂量的、权利要求1-5任何一个中的免疫原以及药物学上可接受的载体。
7.权利要求6的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
8.一种包含重组核酸的基因，所速重组基因包含由编码权利要求1-4任一项中的多肽的核苷酸序列所组成的重组基因的核酸。
9.权利要求8的核酸，其中所述核酸是一种表达载体。
10.一种包含重组基因的重组细胞，所述重组基因由编码权利要求1-4任一项的多肽的核苷酸序列所组成的。
11.一种制备可提供保护性免疫的金黄色葡萄球菌多肽的方法，包括步骤(a)在可表达多肽的条件下培养权利要求10中的重组细胞；及(b)纯化所述多肽。
12.一种在患者中诱导保护性免疫应答的方法，包括对所述患者给药免疫有效剂量的、含有与SEQ ID NO1同一性至少为85％的氨基酸序列的免疫原的步骤。
13.权利要求12中的方法，其中所述患者是人。
14.权利要求13中的方法，其中所述患者针对金黄色葡萄球菌感染进行的是预防性治疗。
15.一种在患者中诱导保护性免疫应答的方法，包括对所述患者施用免疫有效剂量的、通过权利要求11中的方法制备的多肽的步骤。
全文摘要
本发明的特征在于包含与SEQ ID NO1在结构上相关的氨基酸序列的多肽以及这种多肽的用途。SEQ ID NO1是金黄色葡萄球菌的一个全长多肽的截短衍生物。在本申请中该全长多肽指的是全长青霉素结合蛋白4(“PBP4”)。发现SEQ ID NO1的一个组氨酸标签衍生物可产生针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答。
文档编号C07H21/02GK101023186SQ200580031154
公开日2007年8月22日 申请日期2005年9月13日 优先权日2004年9月17日
发明者A·S·安德森, D·L·蒙特戈梅里 申请人:默克公司