专利名称：用于诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽的制作方法
用于诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽 相关申请的交叉引用
本申请要求于2005年1月21日提交的美国临时专利申请No. 60/645,811的优先权，通过引用将它合并于本文中。
背景技术：
在本申请全文中引用的对比文件不被认为是所要求保护的发明的 现有技术。
5V"/;/^/oc0cc"s "i^ens (金黄色葡萄球菌)是作用于多种疾病和状 况(condition)的病原体。由S.做reMs引起的疾病和状况的例子包括 菌血症、感染性心内膜炎、毛嚢炎、邦、痈、脓疱病、大疱性脓疱病、 蜂窝组织炎、botryomyosis、毒性休克综合症、烫伤样皮肤综合中枢神 经系统感染、传染性和炎症性的眼病、骨髄炎和其它关节及骨骼的感 染和呼吸道感染。(The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer ( eds.) ， Churchill Livingstone Inc. 1997.)
可以采用基于免疫学的策略来控制51. flMWlW感染和51. flfM"MS的传 播。基于免疫学的策略包括被动和主动的免疫。被动免疫采用靶向&
的免疫球蛋白。主动免疫诸导针对& a w s的免疫反应。 潜在的& "iweMS疫苗乾向51. ""reus多糖和多肽。把向可以通过使 用适合的S. a"""s多糖或多肽作为疫苗成分来实现。可以被用作为潜 在的疫苗成分的多糖的例子包括& 5型和8型荚膜多糖。
(Shinefield et al. ， N. Eng. J. Med. 346:491-496 ， 2002.)可以用作为可
能的疫苗成分的多肽的例子包括胶原粘附素、纤维蛋白原结合蛋白和 聚集因子.(Mamo et al" FEMS Immunology and Medical Microbiology 10:47-54， 1994， Nilsson et al" J. Clin. Invest 101:2640-2649, 1998， Josefsson et al" The Journal of Infectious Diseases 184:1572-1580， 2001.)
关于5". flwe^多肽序列的信息可以通过对5". flM/*et 基因组效、J序来 获得。(Kurodaetal" Lancet 357:1225-1240， 2001， Baba et al" Lancet359:1819-1827， 2000， Kunsch et al.，欧洲专利公开EP 0 786 519， 1997 年7月30日公开)。使用生物信息学的努力在一定程度上表征了从基 因组测序获得的多肽序列。(Kunsch et al.，欧洲专利公开EP 0 786 519， 1997年7月30日公开)
一些技术，例如涉及展示(display)技术和来自受感染患者的血 清的技术，已经用于努力帮助鉴定编码潜在抗原的基因。(Foster et al.，国际公开号WO 01/98499， 2001年12月27日公开，Meinkeetal.， 国际公开号WO 02/059148， 2002年8月1日公开，Etz et al., PNAS 99:6573-6578， 2002.)
发明概述
本发明涉及包含与SEQ ID NO: 1结构上相关的氨基酸序列的多 肽或其片段、5". fl"retwAhpC-AhpF组合物，以及此类多肽和组合物的 用途。SEQ ID NO: 1具有全长S. aureus AhpC序列。含有氨基His-tag 和三个额外羧基氨基酸的SEQ ID NO: 1的衍生物被发现产生针对S. aureus的保护性免疫应答。
提到"保护性"免疫或免疫应答表明针对S. aureus感染的可检测
水平的保护。可以使用动物模型，例如在本文中描述的那些来评定保 护的水平。
因而，本发明的第一个方面描述了多肽免疫原，其包含与SEQID NO: l或SEQ ID NO: 1的片段至少85%相同的氨基酸序列，其中所 述多肽提供了针对又的保护性免疫，并且所述多肽免疫原不是 SEQ ID NO: 1的多肽。提到免疫原表明提供针对& ""^"s的保护性
免疫的能力。
提到包含与SEQ ID NO: 1至少85%相同的氨基酸序列表明存 在SEQ ID NO: 1的相关区域，并且可以存在其它的多肽区域。与参 考序列的同一性百分比(也称为百分比相同于)是通过对多肽序列与 参考序列进行比对并确定相应区域中相同氨基酸的数目来测定的。这 个数目除以参考序列(例如，SEQ ID NO: 1)中的氨基酸总数，然后 乘以IOO并四舍五入到最接近的整数。
本发明的另一个方面描述了免疫原，其包含提供针对^做"w的 保护性免疫的多肽，以及在羧基末端或氨基末端与所述多肽共价连接的一个或多个其它区域或部分(moiety)，其中每个区域或部分独立地 选自具有至少一种以下性质的区域或部分增强免疫应答，有利于纯 化或有利于多肽稳定性。
提到"其它区域或部分"表明不同于^ ""re"s AhpC区域的区域 或部分。其它区域或部分可以是，例如，其它的多肽区域或非肽区域。
本发明的另一个方面描述了由AhpC-AhpF组合物组成的纯化的 免疫原。AhpC组分包含至少85%相同于SEQ ID NO: 1的多肽。AhpC 组分包含至少85%相同于SEQ ID NO: 3的多肽。提到纯化的表明所 述组合物存在于缺少一种或多种下述其它多肽的环境中，所述其它多 肽是AhpC和AhpF与之天然地相关的或代表了存在的总蛋白中的至少 约10%。
优选地，所述组合物是基本上纯化的。"基本上纯化的"AhpC和 AhpF组合物存在于缺少所有的或大多数下述其它多肽的环境中，所述 其他多肽是AhpC和AhpF多肽与之天然地相关的。
提到"纯化的"或"基本上纯化的"不需要多肽经历任何纯化， 可以包括，例如，没有被纯化的化学上合成的多肽。
本发明的另一个方面描述了能在患者中诱导针对S. aureus的保护 性免疫的组合物。所述组合物包含药学上可接受的载体和免疫有效量 的提供针对S. aureus的保护性免疫的免疫原。
免疫有效量是足以提供针对S. aureus感染的保护性免疫的数量。 该数量应当足以显著地防止S. aureus感染的可能性或严重度。
本发明的另一个方面描述了包含重组基因的核酸，所述重组基因 编码提供针对S. aureus的保护性免疫的多肽。重组基因含有编码多肽 的重组核酸以及用于适当的转录和加工的调节元件(其可以包括翻译 和翻译后元件)。重组基因可以独立于宿主基因组存在，或可以是宿 主基因组的一部分。
重组核酸是其序列和/或形式在自然中不存在的核酸。重组核酸的 例子包括纯化的核酸、组合在一起提供了不同于自然中发现的核酸的 两个或多个核酸区域，以及相互之间天然相关的一种或多种核酸区域 (例如，上游或下游区域)的缺少。
本发明的另一个方面描述了重组细胞。所述细胞包含重组基因， 所述重组基因编码提供针对S. aureus的保护性免疫的多肽。本发明的另一个方面描述了产生提供针对S. aureus的保护性免疫 的多肽的方法。所述方法包括培养含有编码所述多肽的重组核酸的重 组细胞，并纯化所述多肽。
本发明的另一个方面描述了提供针对S. aureus的保护性免疫的多 肽，所述多肽由下述过程生产，所述过程包括在宿主中培养含有编码 所述多肽的重组核酸的重组细胞，并纯化所述多肽。可以采用不同的 宿主细胞。
本发明的另一个方面描述了分离的AhpC-AhpF结合蛋白。所述结 合蛋白包含与AhpC-AhpF复合物结合的抗体可变区。
提到"分离的"表明与天然发现的形式不同的形式。所述不同形 式可以是，例如，与天然发现有所不同的纯度和/或天然没有发现的结 构。天然没有发现的结构包括下述重组结构，其中不同的区域被组合 在一起，例如，人源化抗体，其中一个或多个鼠的互补决定区(CDR) 被插入到人类框架支架(framework scaffold)上；杂交抗体，其中来 自抗体结合蛋白的一个或多个CDR被插入到不同的框架支架上；以及 来自天然人类序列的抗体，其中编码轻和重可变区的基因被随机组合 到一起。
优选地，分离的蛋白基本上没有血清蛋白。基本上没有血清蛋白 的蛋白质存在于缺乏大多数或所有血清蛋白的环境中。
本发明的另一个方面描述了针对S. aureus感染对患者加以治疗的 方法。所述方法包括向所述患者施用一种或多种以下物质的步骤
(a) 免疫有效量的免疫原，其包含与SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: 1的片段至少85。/o相同的氨基酸序列，其中所述多肽提供了针对 S. aureus的保护性免疫
(b) 免疫原性组合物，其包含与SEQIDNO: 1至少85%相同的 多肽和与SEQIDNO: 3至少85%相同的多肽；或
(c) 有效量的AhpC-AhpF结合蛋白。
除非特定的术语互相排斥，提到"或"表明可能性之一或两者都 有。有时，例如"和/或"等用语被用于突出之一或两者的可能性。
引述开放性的术语例如"包含"允许添加元素或步骤。有时用语 例如"一个或多个，，与或不与开放式术语一同使用来强调添加元素或 步骤的可能性。除非明确地声明，提到术语例如"a"或"an"不局限于一个。例 如，"细胞(a cell)"不排除"多个细胞(cells)，，。有时例如"一 个或多个"等用语被用于强调多个的存在的可能性。
根据在此提供的包括不同实施例的其它描述，本发明的其它特征 和益处是明显的。提供的实施例例举了在实践本发明中有用的不同成 分和方法。实施例不限制要求保护的发明。根据当前的公开，熟练的 技术人员可以鉴定和采用对于实践本发明有用的其它成分和方法。
附图的简要说明
附
图1阐示了SEQIDNO: 1和SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。 完整的序列是SEQIDNO: 2。粗体显示的部分是SEQ ID NO: 1。下 划线的区域是氨基His-tag区域和在羧基端的其它氨基酸。
附图2阐示了对来自S. aureus ( SEQ ID NO: 1)和S.印idermidis (SEQ ID NO: 6， GenBank Accession No. AE016752 )的AhpC序列 之间的序列比较。氨基酸差异以粗体显示。
附图3阐示了编码SEQIDNO: 2的核酸序列(SEQ ID NO: 5)。 额外的His-tag和羧基氨基酸编码区以粗体显示.
附图4阐示了编码SEQ ID NO: 3的DNA序列(SEQ ID NO: 4)。
附图5A和5B阐示了对来自S. aureus: SEQ ID NO: 3 ( GenBank 登记No. U92441 ) 、 9 ( GenBank登记No. AP004823 )和10 ( GenBank 登记No. BX57183 )和S. epidermidis, SEQ ID NO: 8 ( GenBank登记 No. AE016752)的不同AhpF序列之间的序列比较。氨基酸差异以粗体 显示。
附图6A和6B阐示了使用处于氢氧化磷酸铝佐剂中的SEQ ID NO: 2多肽(圆團)或单独的佐剂(三角形)进行实验的结果。
发明的详细说明
在下文提供的使用SEQ ID NO: 2的实施例中阐释了 SEQ ID NO: l相关多肽提供保护性免疫的能力。SEQ ID NO: 2是SEQIDNO: 1 的衍生物，其含有氨基His-tag和三个额外的羧基氨基酸。His-tag有利 于多肽纯化和鉴定。
与SEQ ID NO: 1结构上相关的多肽包括含有不同S. aureus菌林中存在的相应区域和天然发生区域的衍生物的多肽。SEQ ID NO: l的 氨基酸序列由附图1中的粗体区域阐示。附图l还阐示了 SEQ ID NO: 2中存在的氨基His-tag和额外的羧基氨基酸。 I. AhpC序列
S. aureus AhpC最初被鉴定为与E. coli烃基过氧化氬物还原酶具 有广泛相似性的由、渗透上调休克(osmotic up shock) i秀导的蛋白质 (AhpC ) 。 (Amstrong-Buisseret et al" Microbiology 141:1655-1661 ， 1995.)不同相似性的AhpC同源物存在于哺乳动物脑中和不同的生物 体，包括许多细菌物种中。(Chae et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7017-7021， 1994， Yanetal.， Helicobacter 6:274-282， 2001.)
S. aureus AhpC相关序列已经在不同的参考文献中被给出了不同 的名称。在TIGR ( SA0452 ); Babaetal" Lancet 359:1819-1827， 2002 (MW0357); K訓da et al" Lancet 357:1225-1240， 2001 ( SAV0381 ); 和Ohta et al" DNA Research 1:51， 2004 ( SAV0381 and SAV0773 )中
提供了不同名称的例子。。
附图2提供了对S. aureus ( SEQ ID NO: 1)和S. epidermidis ( SEQ ID NO: 6)中存在的S. aureus AhpC相关序列之间的序列比较。可以 从其它AhpC序列进行另外的比较。
可以根据与已知AhpC序列相比高度的序列相似性或连续氨基酸 的存在，来鉴定天然存在的其它AhpC序列。连续的氨基酸提供了特 征性标签。在不同的实施方式中，天然存在的AhpC序列是在 Staphylococcus中、优选的S. aureus中发现的序列，具有如SEQ ID NO: l中至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸；和/或具有与 SEQ ID NO: 1的至少85%序列相似性或同一性。
可以通过不同的算法和本领域公知的技术来确定序列相似性。一 般地，可以通过比对两个序列来获得最大氨基酸同一性，容许序列之 一中的缺口、添加和替换的技术来确定序列相似性。
例如，使用利用程序lalign (由Huang和Miller开发，Adv. Appl. Math. 12:337-357， 1991，《sim》程序)的局部比对工具，可以确定序列 相似性。选项和环境变量是第一个残基缺口的^#_罚分(默认-14); -经#_缺口中每个其它残基的罚分(默认-4) ， -sstr (SMATRIX)可选 择的计分矩阵文件的文件名。对于蛋白质序列，通过默认-w #_(LINLEN )序列比对输出线长度(60)来使用PAM250。 II. SEQIDNO: l相关多肽
SEQIDNO: 1相关多肽含有与SEQ ID NO: 1至少85%相同的氨 基酸序列。提到"多肽"时不提供最小或最大大小限制。
至少85%相同于SEQ ID NO: 1的多肽含有SEQ ID NO: 1的多 至约28个氨基酸改变。每个氨基酸改变独立地是氨基酸替换、删除或 添加。在不同的实施方式中，SEQ ID NO: 1相关多肽至少90%、至少 94%或至少99%相同于SEQIDNO: 1;与SEQ ID NO: 1不同0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或20个氨基酸改变；或基本上由SEQIDNO: 1组成。
本发明的一种实施方式涉及多肽免疫原，其包含或基本上由至少 85%、至少95%或100%相同于SEQIDNO: 1的氨基酸178-189的序 列组成。在另一些实施方式中，包含SEQIDNO: 1的氨基酸H8-189 的多肽由总共不超过13、 15、 20、 25、 50、 100或150个氨基酸组成； 和/或整个多肽至少85%、至少90。/。或相同于SEQIDNO: 1区域并包 含SEQ ID NO: 1的氨基酸178-189。可能存在的其它氨基酸包括其它 的SEQ ID NO: 1氨基酸或其它氨基酸区域。优选的其它氨基酸是氨 基末端甲硫氨酸。
提到"基本上由"指明的氨基酸"组成"表明存在所指的氨基酸 并且可能存在其它氨基酸。其它氨基酸可以是在羧基或氨基末端。在 不同的实施方式中，存在1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20个其它氨基酸。
可以对SEQIDNO: 1多肽或其片段进行改变，来获得诱导针对S. aureus的保护性免疫的衍生物。例如，可以进行改变来获得保持了诱 导针对S. aureus的保护性免疫能力的衍生物，或来获得除了提供保护 性免疫之外还具有可以实现特定目的的区域的衍生物。
附图2中提供的序列比较和与其它S. aureus AhpC序列的比较， 可以用于指导设计潜在的改变。此外，可以考虑氨基酸的已知性质进 行改变。
一般地，在取代不同氨基酸以保持活性的过程中，交换具有相似 性质的氨基酸是优选的。对于氨基酸替换而言，可以考虑的因素包括 氨基酸大小、电荷、极性和疏水性。不同的氨基酸R基团对氨基酸性质的影响是本领域7〉知的。(参见，例如Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002， Appendix 1C.)
在交换氨基酸以维持活性的过程中，置换氨基酸应具有一种或多 种相似的性质，例如大约相同的电荷和/或大小和/或极性和/或疏水性。 例如，缬氨酸对亮氨酸、精氨酸对赖氨酸、和天冬酰胺对谷氨酰胺的 替换是不引起多肽功能变化的良好候选。
实现特定目的的改变包括被设计以有利于多肽的生产或效力的那 些；或编码核酸的克隆的那些。通过使用适合于重组表达的起始密码 子(例如，编码甲硫氨酸)可以便于多肽生产。甲硫氨酸稍后可以在 细胞加工期间被除去。例如，通过引入可伴随有氨基酸添加或改变的 限制性位点，可以协助克隆。
可以通过表位强化来增强多肽诱导免疫反应的效力。可以使用不 同的技术进行表位强化，所述技术例如，涉及改变锚定残基来改善肽 对MHC分子的亲和性的那些，以及提高肽-MHC复合物对T细胞受 体的亲和性的那些。(Berzofsky et al.， Nature Review 1:209-219， 2001.)
优选地，所述多肽是纯化的多肽。"纯化的多肽"存在于缺乏一 种或多种下述其它多肽的环境中，所述其它多肽天然地与之相关和/或 以存在的总蛋白中的至少约10%存在.在不同的实施方式中，纯化的 多肽在样品或制品中代表总蛋白的至少约50%、至少约"％或至少约 95%。
在一种实施方式中，多肽是"基本上纯化的"。基本上纯化的多 肽存在于缺少与之天然相关的所有或大多数其它多肽的环境中。例 如，基本上纯化的S. aureus多肽存在于缺少所有或大多数其它S. aureus多肽的环境中。环境可以是，例如，样品或制品。
提到"纯化的"或"基本上纯化的"不需要多肽经历任何纯化， 可以包括，例如，没有被纯化的化学上合成的多肽。
可以通过修饰多肽羧基或氨基末端来增强多肽稳定性。可能的修 饰的例子包括氨基末端保护基团，例如，乙酰基、丙基、丁二酰基、 苯甲基、苄氧基羰基或t-丁氧羰基；和羧基末端保护基团，例如酰胺、 曱酰胺和乙酰胺。
在本发明的一种实施方式中，多肽免疫原是下述免疫原的部分， 所述免疫原含有在羧基末端或氨基末端与所述多肽共价连接的一个或多个其它区域或部分，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种
以下性质的区域或部分增强免疫应答，有利于纯化或有利于多肽稳 定性。例如，使用可以存在于氨基或羧基末端的基团如聚乙二醇，可 以增强多肽稳定性。
可以通过向羧基或氨基末端添加基团以有利于纯化来增强多肽纯 化。可用来有利于纯化的基团的例子包括提供亲合性标签的多肽。亲 合性标签的例子包括六组氨酸标签、trpE、谷胱甘肽和麦芽糖结合蛋 白。
可以使用通常能增强免疫应答的基团来增强多肽产生免疫应答的 能力。可以与多肽连接来增强针对所述多肽的免疫应答的基团的例子 包括细胞因子，例如IL國2。 ( Buchan et al.， 2000. Molecular Immunology 37:545-552.)
III. AhpC-AhpF免疫原
AhpC-AhpF免疫原是含有AhpC和AhpF组件的组合物。AhpC 组件由SEQIDNO: l相关多肽组成。AhpC组件由SEQ ID NO: 3相 关多肽组成。
SEQ ID NO: 1相关多肽含有与SEQ ID NO: 1至少85%相同的氨 基酸序列。SEQ ID NO: 1相关多肽的不同的实施方式在上文II节中 有所描述。
SEQ ID NO: 3相关多肽含有与SEQ ID NO: 3至少85%相同的氨 基酸序列。每个氨基酸改变独立地是氨基酸替换、删除或添加。在不 同的实施方式中，SEQ ID NO: 3相关多肽至少90%、至少94%、至 少99%或相同于SEQIDNO: 3;与SEQ ID NO: 3不同0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20 个氨基酸改变；或基本上由SEQIDNO: 3组成。
对SEQ ID NO: 3相关多肽进行改变来获得与SEQ ID NO: 1相 关多肽组件一同使用的衍生物。例如，可以进行改变，来获得保持了 诱导针对S. aureus的保护性免疫能力的完整组合物，或来获得除了提
供保护性免疫之外还具有可以实现特定目的的区域的完整组合物。
可用于帮助设计AhpF组件的不同的AhpF序列的例子在附图5A
和5B中提供。产生对多肽的改变的其他指导在以上的II节中提供了。 在不同的参考文献中对S. aureus AhpF相关序列给出了不同的名称。在TIGR (SA0451 ) ; Baba et al.， Lancet 359:1819-1827， 2002 (MW0356) ; Kurodaetal.， Lancet 357:1225-1240， 2001 ( SAV0380 andSA0365);和Enright et al" PNAS 99:9786-9791， 2002 ( SAS0357 andSAR0398).中提供了不同名称的例子。
优选地，使用表达两个组件的构建体重组产生AhpC和AhpF组合 物。例如，E. coli菌林可以被工程化来共表达ahpC和ahpF，可以分 离AhpC和AhpF复合物。关于多肽生产的其它指导和例子在下文的 IV节中提供。
IV.多肽生产
多肽可以使用标准技术来生产，包括涉及化学合成的那些和涉及 从产生所述多肽的细胞提纯的那些。对多肽进行化学合成的技术是本 领域公知的。(参见，例如Vincent, Peptide and Protein Drug Delivery, New York, N.Y., Decker, 1990.)用于重组多肽生产和纯化的技术也 是本领域/>知的。(参见，例如，Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002.)
使用重组核酸技术来产生多肽有利于从细胞获得多肽。用于产生 多肽的重组核酸技术包括在细胞中导入或产生编码所述多肽的重组 基因并表达所述多肽。
重组基因含有编码多肽的核酸以及用于多肽表达的调节元件。重 组基因可以存在于细胞基因组中，或是表达载体的部分。
可以作为重组基因的部分存在的调节元件包括天然与所述多肽编 码序列相关的那些，以及天然不与所述多肽编码序列相关的外源的调 节元件。外源调节元件(例如外源启动子)对于在特定宿主中表达重 组基因或提高表达的水平是有用的。 一般地，重组基因中存在的调节 元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子以及任选地，存在的 操纵子(present operator)。用于真核细胞中加工的优选元件是多腺 苷酸化信号。
通过使用表达载体，有利于重组基因在细胞中的表达。优选地， 除重组基因之外，表达载体还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制 起点、选择性标记、有限数量的有用的限制性内切酶位点以及高拷贝 数的可能性。表达栽体的例子是克隆载体、经修饰的克隆载体、专门 设计的质粒和病毒。由于遗传密码的简并性，大量的不同编码核酸序列可以用于编码 特定的多肽。由于几乎所有的氨基酸由不同的核苷酸三联体组合或"密 码子，，编码，从而产生了遗传密码简并性。由密码子编码的氨基酸如
下
A-Ala-丙氨酸密码子GCA， GCC, GCG， GCU C-Cys-半胱氨酸密码子UGC， UGU D-Asp-天冬氨酸密码子GAC， GAU E-Glu-谷氨酸密码子GAA， GAG F-Phe-苯丙氨酸密码子UUC， UUU G-Gly-甘氨酸密码子GGA， GGC, GGG， GGU H-His-组氨酸密码子CAC， CAU I-Ile-异亮氨酸密码子AUA， AUC， AUU K-Lys-赖氨酸密码子AAA, AAG
L-Leu-亮氨酸密码子UUA， UUG， CUA， CUC， CUG, CUU M二Met-甲硫氨酸codon AUG N-Asn-天冬酰胺密码子AAC， AAU P-Pro,氨酸密码子CCA， CCC， CCG， CCU Q-Gln-谷氨酰胺密码子CAA， CAG
R-Arg-精氨酸密码子AGA， AGG， CGA， CGC， CGG， CGU S-Ser-丝氨酸密码子AGC， AGU， UCA， UCC， UCG， UCU T-Thr-苏氨酸密码子ACA， ACC， ACG， ACU V-Va卜缬氨酸密码子GUA, GUC， GUG， GUU W-Trp-色氨酸codonUGG Y-Tyr-酪氨酸密码子UAC， UAU
适合用于SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: 3相关多肽的重组核酸 表达的细胞是原核生物和真核生物。原核细胞的例子包括E. coli; Staphylococcus属的成员，例如S. aureus; Lactobacillus属的成员，例 如L. plantarum; Lactococcus属的成员，例如L. lactis; Bacillus属的 成员，例如B.subtilis。真核细胞的实例包括哺乳动物细胞；昆虫细胞； 酵母细胞，例如Saccharomyces属的成员(例如，S. cerevisiae) 、 Pichia 属的成员(例如，P. pastoris ) 、 Hansenula属的成员(例如，H. polymorpha ) 、 Kluyveromyces属的成员(例如，K. lactis或K. fragilis )和Schizosaccharomyces属的成员(例如，S. pombe)。
重组基因产生、导入细胞和重组基因表达的技术是本领域公知 的。在参考文件中提供了这些技术的例子，例如Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002和Sambrook et al" Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
如果需要的话，可以通过密码子优化来增强特定宿主中的表达。 密码子优化包括使用更优选的密码子。在不同宿主中的密码子优化技 术是本领域公知的。
多肽可以含有翻译后修饰，例如，N-连接的糖基化，O-连接的糖 基化，或乙酰化。提到多肽的"多肽"或"氨基酸"序列包括多肽， 其含有来自宿主细胞(例如酵母宿主)的、 一个或多个具有翻译后修 饰的结构的氨基酸。
翻译后修饰可以化学地产生或通过使用适合的宿主产生。例如， 在S. cerevisiae中，倒数第二个氨基酸的性质看起来决定了 N-末端甲 硫氨酸是否被除去。此外，倒数第二个氨基酸的性质还决定了 N-末端 氨基酸是否是N、乙酰化的(Huang et al" Biochemistry 26:8242-8246， 1987)。其它例子包括由于分泌前导区(例如信号肽)的存在靶向分 泌的多肽，其中蛋白质被N-连接的或O-连接的糖基化修饰。 (Kukumzinskaetal" Ann. Rev. Biochem. 56:915-944， 1987.)
V.佐剂
佐剂是可以在产生免疫反应中协助免疫原的物质。佐剂可以通过 不同的机制起作用，例如以下机制的一种或多种提高抗原的生物学
或免疫学半衰期；改善抗原对抗原呈递细胞的递送；改善抗原呈递细
胞的抗原加工和呈递；以及诱导免疫调节细胞因子的产生。(Vogel， Clinical Infectious Diseases 30 ( suppl. 3) :S266國270， 2000.)
可以采用各种不同种类的佐剂来协助产生免疫反应。特定佐剂的 例子包括氢氧化铝、磷酸铝或铝的其它盐，磷酸钙、DNA CpG基序、 单磷酰基脂质A、霍乱毒素、E.coli不耐热肠毒素、白喉毒素、胞壁酰 二肽、Freimd，s不完全佐剂、MF59、 SAF、免疫刺激复合物、脂质体、 生物可降解的微球体、皂角苷、非离子块共聚物、胞壁酰肽类似物、 聚磷腈(polyphosphazene)、合成的多核苷酸、IFN-y、 IL-2、 IL-12和ISCOMS。
( Vogel Clinical Infectious Diseases 30 ( suppl 3 ) :S266-270， 2000， Klein etal" Journal of Pharmaceutical Sciences 89:311-321， 2000， Rimmelzwaan et al" Vaccine 19:1180-1187， 2001 ， Kersten Vaccine 21:915-920， 2003， O，Hagen Curr. Drug Target Infect. Disord.， 1:273-286， 2001.)
VI. 患者
"患者"是指能用S. aureus感染的哺乳动物。患者可以被预防性 地或治疗性地处理。预防性处理提供了足够的保护性免疫来降低S. aureus感染的可能性或严重度。治疗性处理可以被进行来降低S. aureus感染的严重度。
预防性治疗可以使用含有本文中描述的免疫原的疫苗来进行。这 种处理优选在人类上进行。疫苗可以被施用给普通群体，或处于提高 的S. aureus感染风险下的那些人，
具有提高的S. aureus感染风险的人包括护理工作者；医院患者； 具有减弱的免疫系统的患者；经历手术的患者；接受异体植入物的患 者，例如导管或脉管设备；面对导致减弱的免疫性的治疗的患者；和 在具有高风险的灼伤或创伤的职业中的人。(The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer ( ed.) ， Churchill Livingstone Inc. 1997.)
可能被S. aureus感染的非人类患者包括牛、猪、绵羊、山羊、兔、 马、狗、猫、猴、大鼠和小鼠。对非人类患者的处理可用于保护宠物 和家畜，以及评估特定处理的效力。
VII. 组合疫苗
本文中描述的免疫原可以单独使用，或与其它免疫原组合使用， 来诱导免疫反应。可以存在的其它免疫原包括 一种或多种其它的S. aureus免疫原，例如在上文的发明背景中引用的那些；靶向一种或多 种其它Staphylococcus生物体(例如S. epidermidis、 S. haemolyticus、 S. warneri或S. lugunensis )的一种或多种免疫原；和乾向其它感染生
物体的一种或多种免疫原。
VIII. 动物模型系统
动物模型系统被用于评估免疫原产生针对S. aureus的保护性免疫 应答的效力。动物模型是緩慢的动力学死亡率模型，包括从稳定期的细胞制备的S. aureus,适当地滴定，并且静脉内施用。这种死亡的緩
慢动力学提供了足够的时间用于特定免疫防御来排斥细菌性感染(例 如，10天而不是24小时)。
稳定期的S. aureus细胞可以从培养于固体培养基上的细胞获得。 它们也可以从液体获得，然而固体培养基上培养的细胞的结果更有重 现性。细胞可以在固体培养基上被方便地培养过夜。例如，S. aureus 可以在倍增时间为约20-30分钟的条件下被培养约18到约24小时。
S. aureus可以使用标准技术分离自固体或液体培养基，以维持S. aureus效力。例如，分离的S. aureus可以保存于-701C ，作为在含甘油 的磷酸盐緩冲盐水中的经洗涤高密度悬浮液(>109集落形成单位 (CFU) /mL)被保存。
S. aureus攻击(challenge)应当在自第一天或第二天开始的约7 到IO天期间在动物模型中提供约80%到90%死亡的效力，可以使用动 物模型进行滴定实验来监视保存的S. aureus接种物的效力。滴定实验 可以在接种试验前约一到两周进行。
IX.抗体
含有SEQIDNO: 1相关多肽和AhpC-AhpF组合物的免疫原可以 用于产生结合免疫原或S. aureus的结合蛋白.这种结合蛋白具有不同 的用途，包括在多肽纯化、S. aureus鉴定或在针对S. aureus感染的预 防或治疗处理中使用。优选地，所述结合蛋白基本上没有血清蛋白。
结合蛋白包含第一可变区和第二可变区。所述可变区具有来自重 链或轻链的抗体可变区结构。抗体重链和轻链可变区含有间插到框架 上的三个互补决定区。互补决定区对于识别特定表位负有主要责任。 抗体结合蛋白的例子包括单链抗体、完整抗体、抗体片段和其衍生物。
优选的抗原结合蛋白是单克隆抗体。提到"单克隆抗体"表示具 有相同的、或基本上相同的互补决定区和结合特异性的一组抗体。单 克隆抗体中的变异是这样的变异如果抗体从相同的构建体产生其将 会发生。
例如，可以从特定的杂交瘤，以及从含有编码抗体的一种或多种 重组基因的重组细胞来产生单克隆抗体。抗体可以由超过一个重组基 因编码，其中，例如， 一个基因编码重链， 一个基因编码轻链。
含有抗体可变区的抗体片段包括Fv、 Fab和Fab2区域。每个Fab区域含有由可变区和恒定区组成的轻链以及含有可变区和恒定区的重
链区域。轻链通过恒定区由二硫键连接到重链。Fab区域的轻链和重链 可变区提供了参与抗原结合的Fv区域。
抗体可变区也可以是含有可变区的蛋白质，例如单链抗体和微型 抗体(minibody)的一部分。单链抗体含有通过接头连接在一起的轻 链和重链可变区。接头可以是，例如，约5到16个氨基酸。微型抗体 是单链-CH3融合蛋白，其自身组装成约80kDa的二价二聚体。
可变区的特异性由三个高变区(也称为互补决定区)决定，它们 插入狱更保守的侧翼区域(也称为框架区)之间。可以如Kabatetal.， Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991所述，对与框架区和互补决定区相
连的氨基酸进行编号和比对。
产生抗原结合蛋白(例如单链抗体、抗体或抗体片段)的技术是 本领域公知的。这些技术的例子包括噬菌体展示技术的使用、对啮齿 动物抗体的鉴定和人源化，以及4吏用XenoMouse或Trans-Chromo小 鼠产生人类抗体。 (E.g. ， Azzazy et al. ， Clinical Biochemistry 35:425-445, 2002， Berger et al.， Am. J. Med. Sci. 324( 1 ) :14-40， 2002.)
鼠抗体可以被人源化，可以使用本领域公知的技术将CDRs移植
到人类抗体框架上。通过将鼠可变区移植到人类抗体框架上，如果需 要的话，进行进一步的修饰来人源化鼠抗体，在这些方面对这些技术 进行了 一般'法描述。(例如O，Brien et al" Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting, p 81-100， From Methods in Molecular Biology Vol 207: Recombinant antibodies for Cancer Therapy: Methods and Protocols (Eds. Welschof and Krauss ) Humana Press, Totowa， New Jersey, 2003.)
优选使用重组核酸技术或通过使用杂交瘤来产生抗原结合蛋白。 重组核酸技术包括构建用于蛋白质合成的核酸模板。杂交瘤是产生抗 原结合蛋白的永生化细胞系。
编码抗原结合蛋白的重组核酸可以在宿主细胞中表达，所述宿主 细胞实际上充当了编码的蛋白质的工厂。重组核酸可以提供编码抗原 结合蛋白的重组基因，其自主存在于宿主细胞基因组之外，或者是宿 主细胞基因组的部分。重组基因含有编码蛋白质的核酸以及用于蛋白质表达的调节元 件。 一般而言，重组基因中存在的调节元件包括转录启动子、核糖体 结合位点、终止子以及任选地存在的操纵子。用于在真核细胞中加工 的优选元件是多腺苷酸化信号。还可以存在抗体相关的内含子。用于
抗体或抗体片段生产的表达盒的例子是本领域公知的。(例如，Persic et al.， Gene 187:9-18， 1997， Boel et al. ， J. Immunol. Methods 239:153-166， 2000, Liang et al.， J. Immunol. Methods 247:119-130， 2001.)
使用表达载体有利于重组基因在细胞中的表达。优选地，除重组 基因之外，表达载体还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、 选择性标记、有限数量的有用的限制性内切酶位点和高拷贝数的可能 性。用于抗体和抗体片段生产的表达栽体的例子是本领域公知的。 (E.g., Persic etal" Gene 187:9-18， 1997, Boel et al" J. Immunol. Methods 239:153-166， 2000， Liang et al. ， J. Immunol. Methods 247:119-130， 2001.)
如果需要的话，可以使用本领域公知的技术将编码抗体的核酸整 合进宿主染色体中。(参见，Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998， Mark et al., U.S. Patent No. 6,743,622.)
可以使用各种不同的细胞系用于重组抗原结合蛋白表达，包括来 自原核生物的(例如，E. coli、 Bacilli和Streptomyces )以及来自真核 生物(例如，酵母、Baculovirus和哺乳动物)的那些。(Breitling et al" Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc. and Spektmm Akademischer Verlag， 1999，)
用于重组抗原结合蛋白表达的优选宿主是能产生具有适当的翻译 后修饰的抗原结合蛋白的哺乳动物细胞。翻译后修饰包括二硫键形成 和糖基化。另一种类型的翻译后修饰是信号肽裂解。
适当的糖基化对于抗体功能可能是重要的。(Yooetal" Journal of Immunological Methods 261:1-20， 2002.)天然存在的抗体含有附着于 重链的至少一个N-连接的碳水化合物。(Id.)其它N-连接的碳水化合 物和O-连接的碳水化合物可能存在，并且对于抗体功能可能是重要 的。(Id.)不同类型的哺乳动物宿主细胞可以用于提供有效的翻译后修饰。
这种宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO) 、 HeLa、 C6、 PC12 和骨髓瘤细胞。 (Yoo et al,， Journal of Immunological Methods 261:1-20， 2002， Persic etal.， Gene 187:9-18， 1997.)
可以4吏用例如在 Ausubel Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998， Harlow et al. ， Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988和Kohler et al" Nature256， 495-497， 1975中描述的技术来产生杂交瘤。
X.施用
使用本文提供的指导以及本领域公知的技术，可以配制免疫原和 结合蛋白并施用给患者。 一般的药物施用原则在例如Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein， W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences 20thEdition, Ed. Gennaro， Mack Publishing, 2000;和Modern Pharmaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker， Inc., 1990中提供，通过引用将每一份并入本文。
药学上可接受的载体有利于免疫原的保存和向患者的施用.药学 上可接受的载体可以含有不同的组分，例如緩冲液、灭菌注射水、生 理盐水或磷酸盐緩冲盐水、蔗糖、组氨酸、盐和聚山梨酸酯。
免疫原和结合蛋白可以通过不同的途径，例如皮下的、肌肉内的 或粘膜的途径来施用。皮下的和肌肉内的施用可以使用例如针头或喷 射注射器来进行。
考虑本领域公知的因素，包括患者的年龄、体重、性别和医学状 况；给药途径；期望的效果；和采用的特定化合物，优选地确定合适 的给药方式。免疫原或结合蛋白可以以多剂量形式使用。预期的是， 剂量将由1.0吗到l.Omg总多肽的范围组成，在本发明不同的实施方 式中，所述范围是0.01 mg到1.0 mg和0.1 mg到1.0 mg。
给药的时机取决于本领域公知的因素。在初次施用之后，可以随 后施用一次或多次强化剂量来维持或强化抗体滴度。给药方式的例子 将是第1天、第1个月、在第4、 6或U个月的第三次给药，以及以 所需的时间间隔进行的其它强化.实施例
下面提供实施例，以进一步阐述本发明的不同特征。这些实施例 还阐述了实践本发明的有用的方法。这些实施例不对要求保护的发明 加以限制。
实施例1:保护性免疫
这个实施例阐述了 SEQ ID NO: 1相关多肽在动物模型中提供保 护性免疫的能力。SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: l的His标记的衍生 物，被用于提供保护性免疫。
SEQ ID NO: 2克隆和表达
由COL SA0452编码的蛋白质被设计为从pET16b载体(EMD Biosciences, Madison, WI)表达，该栽体具有N-末端组氨酸残基和 由载体编码的终止密码子。还由该载体编码的是组氨酸tag后的九个另 外的氨基酸，和在羧基末端的三个另外的氨基酸。设计PCR引物来扩 增COLSA0452，从第一个丝氨酸密码子开始，在末端异亮氨酸残基处 的终止密码子之前结束.正向和反向引物分别是 5，GGGAATTC￡A1A1GTCATTAATTAACAAAGAAATCTTACC3，
( SEQ ID NO : 7 ) 和
5，GGG￡1￡AG￡GATTTTACCTACTAAATCTAAACCAG3， ( SEQ ID NO: 11)，含有其它的限制性位点(下划线的)，即NdeI(正向引物) 和Bpul10211 (反向引物)和GC夹(clamp)以有利于向表达载体中 克隆。
从S. aureus COL菌林MB5393纯化基因组DNA并将其用作为 PCR的模板。在DifcoTryptic Soy Broth (Becton Dickinson, Sparks, MD)中在37TC对50 mL培养物培养过夜，通过离心收集细胞。在5 mL 10 mM Tris pH 7.5、 25°/ 蔗糖中洗涤细胞一次，重悬浮于含50 pg/mL 溶葡萄菌素(Sigma, St. Louis， MO)的相同溶液中。在371C孵育混 合物1小时，随后添加2.5 mL 0.25 MEDTApH 8.0。在冰上孵育15分 钟之后，添加7.5 mL 2% sarkosyl，轻轻地涡旋(swirl)混合物，并令 其在冰上再保持30分钟。添加0.1 M醋酸钠中5 mg/mL的l50 |uL RNAse，混合物在37X:孵育一'J、时。然后，添加25 mg/mL的0.6 mL 蛋白酶K，继续孵育2小时，继之以在41C孵育过夜。通过在室温下轻 轻旋转30.分钟，用15mL水饱和的苯酚来提取溶胞产物。为了分相，在室温下在4，000rpm对混合物离心10分钟。收集水 相，苯盼提取重复两次或更多次。然后，用等体积的氯仿提取水相10 次。在最后的提取之后，收集水相，测量体积，添加一半体积的7.5M 乙酸铵。
通过添加两倍体积的100%乙醇来沉淀DNA，通过用玻璃棒巻绕 来收集。将DNA溶于含有4 ^L焦碳酸二乙酯的5.0 mLTE中，在4 "C过夜。乙醇沉淀重复两次或更多次。
在以一式两份制备的50 ^L体积反应物中通过PCR扩增ahpC基 因。每体系含有250 ng基因组DNA、 125 ng每种正向和反向引物、1 微升10 mM dNTPs、 2.5单位天然Pfu聚合酶和IX Pfu緩冲液 (Stratagene， LaJollaCA)。热循环条件如下941C 5分钟的一个循 环；94TC 45秒、56*C 45秒、72*C l分钟的30个循环；721C 10分钟 的一个循环。用合适的限制性内切酶消化扩增的DNA序列(584 bp)， 按厂商说明书使用Gene Clean II ( QBIOgene， Carlsbad, CA)进行 凝胶纯化。使用已经工程化到PCR引物中的Ndel/Bpu11021位点将 DNA连接进pET16b载体，并导入E. coli NovaBlue感受态细胞(EMD Biosciences)。
转化混合物在37"在低盐Lennox L Broth琼脂平板上被培养过 夜，所述琼脂平板含有各IOO pg/mL的氨节青霉素、IPTG和X-gal, 才艮据厂家的i兌明书4吏用imMediaTM Amp Agar (Invitrogen， Carlsbad, CA )制备。选择克隆，在具有50 |ng/mL氨节青霉素的Luria Broth( LB) 中对其进行培养，产生DNA微制备物(miniprep) (Promega)，通 过限制性内切酶消化来确定合适的插入物。对来自两份微制备物的质 粒DNA进行测序，选择不含有对期望序列的DNA改变的克隆，并命 名为pAhpC5。
用pAhpC5转化E. coli BLR ( DE3 )感受态细胞(EMD Biosciences)，并在含有氨节青霉素(100|ng/mL)的LB平板上生长。 为了测试ahpC的表达，将分离的菌落接种到5 mL液体LB (氨苄青 霉素)中，在37匸、220rpm孵育6小时。培养物在4TC保持过夜，次 日接种到20.0 mL LB肉汤(氨苄青霉素)中，使得起始OD600等于 0.02。培养物在37t:、 220rpm孵育四小时到OD600=0.8。在三种不同 温度下比较表达的诱导。将45微升100 mM IPTG添加到三个4.5 mL培养物体积中(IPTG终浓度lmM)，并在37TC孵育3小时，25TC或 181C 24小时，所有的都在220rpm摇动。对于溶胞产物制备，通过离 心收集来自未诱导的和诱导的培养物的分别的1.5 mL和1.0 mL培养物 体积，并重悬浮于300 mL BugBuster HT ( EMD Sciences)和3 mL Proteinase Inhibitor Cocktail ( Sigma， St. Louis, MO)中。混合物在 冰上保持5分钟，随后超声三次10秒，中间每次进行冷却。为了获得 "可溶的"和"不可溶的"部分，混合物在4TC在14,000 rpm离心五 分钟'上清液被称为"可溶的"，将团粒重悬浮在300 mL BugBuster HT 和3 mL Proteinase Inhibitor Cocktail中，并称为"不可溶的"。通过 BIO-RAD Protein Assay Dye Reagent系统(BIO-RAD， Hercules, CA ),
根据厂家的说明书测定蛋白质浓度。
为了通过SDS-PAGE凝胶的Coomassie染色分析ahpC(由SEQ ID NO: 3编码)的表达，在还原和变性条件下，在1 x Tris甘氨酸SDS 緩冲液(BIO-RAD)中，在4-15%梯度Tris-HCl Criterion凝胶剂
(BIO-RAD)上，对样品进行电泳。为了估计蛋白质大小，将15和 250 kDa之间的标准物(BIO-RAD)与溶胞产物平行地运行(run)。 根据厂家的方案用Bio陽Safe Coomassie--Coomassie G250染料
(BIO-RAD)来对凝胶染色。
在从所有三种温度诱导的样品制备的溶胞产物中都特异性地检测 到了 24 kDa蛋白质。在所有三种温度下获得了良好的表达，ahpC定 位到可溶和不可溶的级分中。25TC的诱导是产生可溶ahpC的最适温 度。
SEQ ID NO: 2纯化
实现了下述目的将上述小规模步骤直接扩大到20升工作体积的 搅拌罐发酵器(30升规模)。在含有50 mL Luria-Bertani (LB)培养 基(加氨苄青霉素)的250 mL烧瓶中培养接种物，用lmL冷冻的种 子培养物接种，并培养6小时。1 mL这种种子被用于接种含有500 mL LB培养基(加氨苄青霉素)的2升烧瓶，并孵育16小时。用20升LB 培养基(加氨节青霉素)培养大规模发酵器升规模)。发酵器的 发酵参数是压力-5psig，搅动速度-300rpms、气流=7.5升/分钟和温 度=3710 。将细胞孵育到600 nm波长处1.3光密度单位的光密度(OD )， 用异丙基-(3-K-硫代半乳糖苷(IPTG)以1 mM的浓度诱导。IPTG诱导时间是两小时。通过将温度降低到151C来收获细胞，通过穿过 500KMWCO空心纤维盒来浓缩，以8,000倍重力在41C离心20分钟来 离心。轻轻倒出上清液，将重组E. coli湿细胞团粒在-70"C冷冻。
将冷冻的重组E. coli细胞糊(24克)解冻，并重悬浮于两体积的 裂解緩沖液(50 mM磷酸钠、pH8.0、 0.15 M NaCl、 2 mM氯化镁、 10mM咪唑、20mM2-巯基乙醇、0.1% Tween-80和蛋白酶抑制物混 合物(Complete ,无EDTA， Roche #_1873580—每50 mL裂解緩冲 液一片)中。Benzonase (EM #_1.01697.0002 )以125单位/mL添加到 细胞悬液中)。用微流化剂制备溶胞产物。在41C对溶胞产物搅拌三小 时，通过在4TC在10，000 xg离心10分钟来澄清。上清液滤经玻璃-纤 维预过滤微孔，从5 M j^备溶液将NaCl添加到0.5 M的终浓度。过滤 的上清液被上样到Ni-NTA琼脂糖层析树脂(Qiagen #_30250)，浆液 在4"C混合过夜。将层析树脂的浆液注入层析柱，通过重力从柱出口收 集未结合的级分。用IO倍柱体积的洗涤緩冲液(50 mM磷酸钠、pH 8.0、 0.5MNaCI、 2 mM氯化镁、lOmM咪唑、20mM2-巯基乙醇、 0.1。/o Tween-80和蛋白酶抑制物混合物(CompleteTM，无EDTA， Roche #_1873580—每50 mL洗涤緩冲液一片)对柱进行洗涤。用洗脱緩冲液 (50 mM磷酸钠(pH 7.4) 、 0.3 M咪唑、2 mM氯化镁、0.1% Tween-80 和20 mM 2-巯基乙醇)对柱进行洗脱。通过在用Ponceau-S染色的硝
化纤维膜上点滴印迹来鉴定含有蛋白质的级分，将含有最高蛋白质浓 度的级分合并来产生Ni-IMAC产物。Ni-IMAC产物通过SEC分馏。 通过Coomassie染色的SDS/PAGE来鉴定含有产物蛋白质的SEC级 分。合并含有产物的SEC级分来产生SEC产物。将SEC产物无菌过 滤，以0.2 mg/mL的终浓度吸附在氬氧化磷酸铝佐剂上。 S. aureus攻击的制备
S. aureus在37TC在TSA平板上培养过夜。通过添加5 mL PBS到 平板上来从TSA平板洗下细菌，用无菌的涂布器(spreader)轻轻地 重悬浮细菌。使用Sorvall RC-5B离心机(DuPont Instruments)将细 菌悬浮液在6000 rpm旋转20分钟。团粒在16%甘油中重悬浮，分为 小份在-70lC冷冻保存。
使用之前，将接种物解冻，适当地稀释并用于感染。每个原种滴 定至少3次来确定在天然小鼠中诱导緩慢的死亡动力学的合适的剂量。时常地监视细菌接种物的效力(80到90%死亡率)来确保模型的 重现性。每个攻击实验前十天， 一组10只对照动物(用单独的佐剂免 疫的)被攻击和监视。
对SEQIDNO: 2多肽的保护研究
在两项独立实验中，二十只BALB/c小鼠中每只用氢氧化磷酸铝佐 剂(450 |ug每次注射))上的SEQ ID NO: 2多肽(20 每次注射) 三次剂量来免疫，20只小鼠每只用氢氧化磷酸铝佐剂(450)Lig每次注 射)免疫。氢氧化磷酸铝佐剂(AHP)由Klein et al.， Journal of Pharmaceutical Sciences 89:311-321， 2000描述。在第0、 7和21天以 两处50itiL肌肉注射来施用材料，在笫28天使小鼠出血，通过ELISA 筛选它们的血清对SEQIDNO: 2的反应性。
在每项实验的第35天，通过S. aureus的静脉内注射(剂量7 x 108 CFU/mL)来攻击小鼠。在11天中监视小鼠的存活率。在第一项实验 结束时，在SEQIDNO: 2多肽免疫的组中12只小鼠存活，相比之下， AHP对照组中5只存活。结果在附图6A中阐示。在第二个实验结束 时，在SEQIDNO: 2多肽免疫的组中11只小鼠存活，相比之下，AHP 对照组中7只存活。结果在附图6B中阐示。
其它实施方式也在以下的权利要求之内。尽管已经展示和描述了 几个实施例，但是可以对此进行各种修改和替换而不背离本发明的精 神和范围。
权利要求
1. 一种多肽免疫原，其包含与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的片段至少85％相同的氨基酸序列，其中所述多肽提供了针对S.aureus的保护性免疫，并且其中所述多肽免疫原不是SEQ ID NO1的多肽。
2. 权利要求l的多肽，其中所迷氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1 的氨基酸178-189。
3. 权利要求2的多肽，其中所述氨基酸序列至少95Y。相同于SEQ ID NO: 1。
4. 权利要求3的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸 22-213组成。
5. 权利要求3的多肽，其中所迷多肽是基本上纯化的。
6. —种免疫原，其包含至少85。/o相同于SEQIDNO: 1的氨基酸 序列，和在羧基末端或氨基末端与所述氨基酸序列共价连接的一个或 多个其它区域或部分，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种 以下性质的区域或部分增强免疫应答，有利于纯化或有利于多肽稳 定性。
7. —种纯化的免疫原，其包含至少85%相同于SEQIDNO: l的 多肽和至少85%相同于SEQIDNO: 3的多肽。
8. —种能在患者中诱导保护性免疫应答的组合物，其包含免疫有 效量的权利要求1-7的任一项的免疫原和药学上可接受的载体。
9. 权利要求8的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
10. —种包含重组基因的核酸，所述重组基因包含编码权利要求 1-5的任一项的多肽的核苷酸序列。
11. 权利要求10的核酸，其中所述核酸是表达载体。
12. —种包含重组基因的重组细胞，所述重组基因包含编码权利要 求1-5的任一项的多肽的核苷酸序列。
13. —种产生提供保护性免疫的& fl""MS多肽的方法，包括步骤(a) 在其中所述多肽被表达的条件下培养权利要求12的重组细 胞；以及(b) 纯化所述多肽。
14. 一种分离的结合蛋白，包含与权利要求7的免疫原结合的可变区。
15. 权利要求14的结合蛋白，其中所述结合蛋白由包括以下步骤 的方法产生(a) (1)使用所述免疫原来选择所述结合蛋白；或(a) (2) 使用所述免疫原来诱导所述结合蛋白的产生；以及(b) 基本上纯化所述抗原结合蛋白。
16. 权利要求15的结合蛋白，其中所述结合蛋白是抗体，或包含 抗体片段。
17. —种针对S. fl"reiw感染治疗患者的方法，包括向所述患者施 用一种或多种以下物质的步骤(a) 免疫有效量的免疫原，包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的片段至少85%相同的氨基酸序列，其中所述多肽提供了针对& ""/ eiw的保护性免疫(b) 免疫有效量的权利要求l-7的任一项的免疫原；或(c) 有效量的权利要求14的结合蛋白。
18. 权利要求17的方法，其中所迷患者是人类。
19. 权利要求18的方法，其中针对&"MW"s感染对所述患者进行 预防性治疗。
20，权利要求18的方法，其中所述免疫原是权利要求1-7的任一 项的免疫原。
全文摘要
本发明涉及包含与SEQ ID NO1结构上相关的氨基酸序列的多肽或其片段、S.aureus AhpC-AhpF组合物，以及此类多肽和组合物的用途。SEQ ID NO1具有全长S.aureus AhpC序列。含有氨基His-tag和三个额外羧基氨基酸的SEQ ID NO1的衍生物被发现产生针对S.aureus的保护性免疫应答。
文档编号G01N33/53GK101432017SQ200680002556
公开日2009年5月13日 申请日期2006年1月17日 优先权日2005年1月21日
发明者L·D·舒尔茨, M·A·米勒, M·D·耶格, R·凯利, T·麦克尼利 申请人:默克公司