专利名称：：来自血浆的低聚糖的分析方法来自血浆的低聚糖的分析方法
技术领域：
：本发明的目的是来自血浆的低聚糖的分析方法，这些低聚糖构成低分子量肝素和非常低分子量肝素。这些肝素是糖胺聚糖族的生物活性剂，它们具有特别有用的抗凝血性。将肝素多糖长链切成低分子量短链，制备出这些低分子量肝素(HBPM)和非常低分子量肝素(HTBPM)。构成HBPM和HTBPM的低聚糖通常用宏观参数(例如它们的平均分子量)或生物活性(例如aXa活性(IU/mg))进行表征。测量与抗凝血酶III相互作用的方法是最常使用的方法。然而，测量这些宏观参数与生物活性并不能回答几个至关重要的问题。特别地，不可能基于这些标准分析构成HBPM和HTBPM的不同低聚糖的药物代谢动力学分布图。例如，aXa活性仅考虑了对ATIII有亲和力的种类，即仅约20%混合物；因此，80%低聚糖的性能没有测定。此外，构成亲和性混合物的每个种类的份额不可能测量到。因此，不可能精确地确定每种低聚糖的血浆浓度，更有理由地，通过简单测定其aXa活性不可能精确地确定其药物代谢动力学分布图。然而，这些分布图为改进HBPM和HTBPM基药品剂量提供了非常有价值的信息。为了能够分析血浆中构成HBPM或HTBPM的不同低聚糖的性能，应该能够完全而再现地将血浆中的这些低聚糖与其它組分(特别是蛋白)分离。现在技术描述的方法利用强蛋白酶处理(Volpi等人，1995,《Biochim.Biophys.Acta.》，1243(1)，49-58)。色谱法或电泳法有可能分析HBPM的不同组分。例如，采用毛细管电泳法(EC)分离肝素低聚糖(Guerrini等人，《糖生物学》(Glycobiology)，2002，12，713-719;Linhardt等人，《BioMethods》，1997，2，183-197)。然而，EC的选择性比液相色镨法低得多。在某些情况下，还可能使用MALDI-TOF质谱分析法分析肝素低聚糖，但这种方法不能应用于复杂的混合物，更不用说它的高成本。因此，特别地采用高效液相色谱法(CLHP)分析硫酸化低聚糖，如构成HBPM和HTBPM的硫酸化低聚糖。最近(WO2004/027087)描述了一种HBPM分析方法，该方法包括酶解聚作用，接着如果必要进行还原反应，与CLHP定量分析。最近欧洲申请(EP042卯789.9)公开了采用阴离子交换色谱法定量测定构成HBPM和HTBPM的低聚糖的方法。该方法利用反相硅胶柱动力学吸附季铵盐，特别地鲸蜡基甲基铵的阴离子交换色谱法，它们在pH2-12范围内保持净正电荷并且不变。在使用CTA-SAX柱进行HBPM和HTBPM的CLHP分析之前，这种方法可能涉及预处理，解聚或采用排阻色谱法的分离。本发明的目的是血浆低聚糖的分析方法，其特征在于进行下述两个步骤誦处理血浆样品，-CLHP的定量分析。在采用CLHP定量分析前，该方法既不涉及对血浆样品中的低聚糖进行酶解聚，也不涉及采用排阻色谱法进行分离。另一方面，根据这种方法，采用过滤方法处理这种血浆样品，以便分离这些低聚糖，让它们在滤液中与血浆污染物，特别是留在浓缩物中的蛋白质再接因此，本发明的目的更特别地是如前面所定义的方法，其中采用过滤方法处理这种血浆样品。本发明的一个非常特别的目的是如前面所定义的方法，其特征在于分子量大于30kDa的分子留在该浓缩物中。为了能够对血浆样品处理方法进行量化，并验证这种处理在样品间的再现性，如果必要往样品中添加内标。这个内标应该是一种低聚糖，如果可能的话在结构上接近定量产物，该产物在过滤前才与血浆混合。本发明的另一个目的因此是如前面所定义的方法，其特征在于在过滤前才往血浆样品中添加对照低聚糖。尽管采用过滤方法将大多数低聚糖与蛋白质分离，但可能的是一部分依然因与浓缩物的静电相互作用而被捕获。在这种情况下，必须使用盐溶液对浓缩物进行一次或多次洗涤。本发明的另一个目的因此是如前面所定义的方法，其特征在于该浓缩物使用盐溶液进行至少一次洗涤。根据本发明，该盐溶液优选地是氯化钾溶液。更特别地，本发明的目的是如前面所定义的方法，其特征在于盐溶液在添加到浓缩物之后的浓度大于或等于1M，非常特别地，是这样一种方法，其中盐浓度大于或等于2M。用盐溶液洗涤一次或多次后，如果必要，该浓缩物再用水洗涤。因此本发明的目的是如前面所定义的方法，该方法包括该浓缩物在用盐溶液洗涤至少一次之后再用水洗涤的步骤。原始滤液与来自洗涤操作的滤液合并，该合并滤液用水稀释5倍。这种稀释使所有的低聚糖在注入色谙柱后能够再浓缩，同时防止由于盐浓度过高造成峰加宽。注射后立即添加1NHC1将溶液的pH调节到3。根据本发明方法，直接注入全部的滤液，如果必要，还有全部洗液，并进行CLHP分析。阴离子交换CLHP是最适合于这样一种复杂混合物的分离方法。特别地，CLHP使用通过共价键接枝季铵的阴离子交换柱。这类色谱柱的优点是能够使用高氯酸盐作为流动相，而使用CTA-SAX色谱柱则是不可能的，因为高氯酸盐与CTA有强络合作用。因此，本发明的另一目的是如前面所定义的方法，其中采用阴离子交换CLHP定量测定低聚糖。更特别地，本发明的目的是如前面所定义的方法，其中采用CLHP，使用通过共价键接枝季铵的阴离子交换柱定量测定低聚糖.可以使用粒度9-13pm、长度25cm的IonPAcAS11型(Dionex)柱。可以使用直径l-4.6mm的所有常用色谱柱，但优选使用直径2mm的色谱柱。在更一般的范围内，可以使用更小直径(例如lmm)的柱，实际上需要更少量的血浆，还能够提高分析灵敏度.使用的装置可以是能形成洗脱梯度，使用UV检测器的色谱仪。应优选使用装有二极管阵列的检测器，它能够获得这些成分的UV光谱，记录由两个不同波长的吸光度(absorbance)之差造成的复杂信号，该复杂信号使得检测血浆源化合物中的乙酰化低聚糖成为可能。使用直到200nm都透明的移动相能够有利于区分这些成分。这里使用的移动相优选地应是高氯酸钠溶液，不过也可以使用甲磺酸盐或磷酸盐。因此，本发明的目的是如前面所定义的方法，其特征在于使用直到200nm都透明的移动相。特别地，本发明的目的是如前面所定义的方法，其特征在于移动相是高氯酸钠溶液、甲磺酸盐溶液或磷酸盐溶液。非常特别地，本发明的的目的是如前面所定义的方法，其特征在于移动相是高氯酸钠溶液。这种分离所推荐的pH是2-6.5。优选地使用pH约3。添加盐(如磷酸盐)可以达到该pH，磷酸盐在pH-3的緩冲能力比高氯酸盐的好。作为实例，下面给出色语分离的标准条件-溶剂a:2.5mmNaH2P04，添加H:jP04将pH调节到2.9，-溶剂B:lNNaC104，2.5mmNaH2P04，添加H3P04将pH调节到3.0，洗脱梯度可以如下T=0min:%B=3;T=40min:%B=60;T=60min:o/oB=80对于直径2mm的色镨柱，选择的流量例如是0.22ml/min，柱温度401C。采用uv检测在过滤血浆样品中的低聚糖。由于所有非乙酰化多糖在一定的pH下都具有几乎相同的UV谘，所以以两个选择波长的吸光度(absorbance)之差取作信号，以便消除非乙酰化糖类的吸收率(absorptivit6)时，于是有可能选择性地检测乙酰化糖类。在下述情况下，选择202nm和230nm作为参比波长，记录202_230nm的信号。对于本
技术领域：
的技术人员显而易见的是，选择波长将取决于移动相的pH，因此为了达到所述最佳条件，可能有必要调节几个nm。最适合这种技术的检测器是AgilentTechnologies公司的DAD检测器.在这种情况下，每个样品都进行二次检测，一次在234nm，另一次在202-230nm'还可以进行三次检测，每个样品额外测定在280nm的吸光度，这样能够确认该信号没有被蛋白残余物污染。因此，本发明的目的是如前面所定义的方法，其特征在于该检测方法能够选择性地检测乙酰化糖类。本发明的另一个目的是如前面所定义的方法，其特征在于以两个选择波长的吸光度之差取作信号，以便消除非乙酰化糖类的吸收率时，进行乙酰化糖类的选择性检测。因而非常特别地，本发明的目的是如前面所定义的方法，其特征在于通过测定在202-230nm和234nm的吸光度时，进行选择性检测乙酰化糖类的方法。因而非常特别地，本发明的目的是如前面所定义的方法，其特征在于通过测定在202-230nm、234nm和280nm的吸光度，进行选择性检测乙酰化糖类的方法。如前面所定义的方法更特别地能够分析所有(3-不饱和低聚糖。更特别地，它应用于构成依诺肝素、octaparine、贝米肝素(bemiparine)和亭扎肝素(tinzaparine)的低聚糖。实验实施例操作方式血浆处理取出体积100-lOOOjil的血浆样品，如果必要，往该血浆样品添加内标。均化后，把得到的溶液加到预先用250nl水漂洗的30kDUUrafree05超滤管(Millipore)中，以10000转/分离心5分钟.如果过滤量大于500^1，则血浆可一次或两次加到离心管的上部。该离心管以速度10000转/分离心1-2小时，然后取出滤液，如果必要，第二部分待过滤血浆加到离心管的上部，离心管再进行离心。加入血浆准确量进行称重。离心管进行离心直到离心管上部的蛋白质残余物不到初始部分的约1%。取出滤液，往浓缩物里添加每ml过滤血浆为210jil3MKCl。均化后，该离心管以速度IO000转/分离心1-4小时.离心管进行离心直到离心管上部中的蛋白质残余物不到初始部分的约10%.取出笫二次滤液，第二次往浓缩物里添加每ml过滤血浆为210|il3MKC1。均化后，该离心管以速度10000转/分离心1-4小时。离心管进行离心直到离心管上部中的蛋白质残余物不到初始部分的约10%。取出第三次滤液，添加每ml过滤血浆为2S0jd水。均化后，离心管以速度IO000转/分离心l-4小时。离心管进行离心直到离心管上部中的蛋白质残余不到初始部分的约10%。这些滤液合并，并用水稀释5倍，全部滤液直接注入到阴离子交换CLHP中。在注入前添立即加1NHC1使注入溶液的pH调节到3。CXHP法过滤的血浆采用阴离子交换CLHP进行分析。使用的柱是IonPAcAsll柱(Dionex)，长度25cm，内径2mm。使用的检测器是装有二极管阵列的UV分光光度计。添加NHC1将pH调整到3之后，注入全部pH。选择流量是0.22ml/min;柱温度是40匸。以梯度方式进行洗脱。使用的两种溶液是溶剂A:2.5mmNaH2P04，添加H3P04见pH调节到2.9，溶剂B:lNNaC104，2.5mmNaH2P04，添加H3P04将pH调节到3.0,洗脱梯度如下T-Omin:%B=3;T=40min:%B=60;T=60min:%B=80实施例1监测雄性比格猎犬血液中三种八糖混合物的变化。表示为AIIaIIsIsIs、Alsllallsls和AIIalIsIsIs"6脱水的这三种八糖是Lovenox⑧八糖部分的主要亲和力八糖。它们对ATIH具有高亲和力，因此具有抗血栓形成活性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>以这三种组分每种目标剂量0.5mg/kg往3只雄性比格犬皮下给药该混合物。给药溶液是在0.5mg/ml目标浓度时三种八糖混合物的0.9°/NaCl溶液。在给药后O、0.25h、0.5h、lh、2h、4h、6h、8h、24h、30h和48h时间取出5ml血液样品。取出的血液样品收集在装有400^1CTAD(柠檬酸盐、茶碱、腺苷、双嘧达莫)混合物的试管中。均化后，该溶液在15匸下在3000g离心lSmin。回收血浆的上清液，在-20C储存直到使用。为了在CLHP注入前处理血浆，取出约lml血浆并称重，往该血浆里加入浓度约0.02g/l的5(HU内标溶液。内标这样选择，使得在结构上尽可能地接近被分析产物。其结构如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>使用的四糖能够校正提取产率变化的可能影响。血浆进行处理并采用CLHP分析。得到的结果列在表l中，相应的色谱图描绘在图1中.表l:3种八糖的血浆浓度QtM)随给药后时间的变化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例2人类志愿者以目标剂量1.4mg/kg给药平均分子量2500Da的HTBPM。在给药后0、0.25h、0.5h、0.75h、lh、1.25h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、14h和24h时间取出血液样品。由于使用的HTBPM是低聚糖的复杂混合物，其研究限于选自这种混合物的某些组分。此外，由于没有找到在色谱水平不干扰混合物的其中一种组分的内标，所以取实施例1中用亲和力八糖得到的摩尔应答系数作为摩尔应答系数，进行了定量测定。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>结果证明，构成所研究低分子量肝素的低聚糖之间在性能上有极大的差异。具有aXa活性的低聚糖比其它硫酸化低聚糖具有緩慢得多的除去动力学，这由监测aXa活性是不能觉察的。得到的结果列在表2中。相应的色谱图描绘在图2中。表2:主要低聚糖的血浆浓度(HM)随给药后时间的变化<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>图1:犬l的3种八糖的药物代谢动力学的色谱监测。表2:构成非常低分子量肝素的主要低聚糖色谱监测随给药后时间的变化。权利要求1.来自血浆的低聚糖的分析方法，其特征在于进行下述两个步骤a、处理样品，然后b、采用高效液相色谱法(CLHP)的定量测定。2.根据权利要求l所述的方法，其特征在于采用过滤方法处理血浆样品。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于分子量大于30kDa的分子留在浓缩物中。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在过滤前往血浆里添加对照低聚糖。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于该浓缩物在盐溶液中洗、涤至少一次。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于盐溶液是氯化钾溶液。7.根据权利要求5或6中任一项权利要求所述的方法，其特征在于添加浓缩物后盐溶液的浓度高于或等于1M。8.根据权利要求5或6中任一项权利要求所述的方法，其特征在于添加浓缩物后盐溶液的浓度等于或高于2M。9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于该浓缩物在盐溶液中洗涤至少一次，然后再用水洗涤。10.根据权利要求l-9中任一项权利要求所述的方法，其特征在于注入全部滤液，如果必要，注入全部洗涤液，并采用CLHP进行分析.11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于该色谘法是阴离子交换色谱法。12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于该色谦法是使用阴离子交换柱与通过共价鍵接枝季铵的阴离子交换色谱法.13.根据权利要求ll所述的方法，其特征在于使用直到200nm是透明的移动相。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于该移动相是高氯酸钠溶液、曱磺酸盐溶液或磷酸盐溶液。15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于该移动相是高氯酸钠溶液。16.根据权利要求ll所述的方法，其特征在于它包括能够选择性检测乙酰化糖类的检测方法。17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于以两个波长的吸光度之差取作信号，以便除去非乙酰化糖类的吸收率，进行选择性检测乙酰化糖类的方法。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于通过测定在202-230nm和234nm的吸光度，进行选择性检测乙酰化糖类的方法。19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于通过测定在202-230nm、234nm和280nm的吸光度，进行选择性检测乙酰化糖类的方法。20.根据权利要求1所述的方法在(3-不饱和低聚糖定量测定中的用途。21.根据权利要求1所述的方法在依诺肝素、octaparine、贝米肝素或亭扎肝素定量测定中的用途。22.根据权利要求1所述的方法在下述一种或多种八糖定量测定中的用途<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>23.根据权利要求1所述的方法在下述一种或多种低聚糖定量测定中的用途<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>全文摘要本发明涉及血浆低聚糖的分析方法，这些低聚糖构成低分子量肝素和非常低分子量肝素。文档编号G01N33/66GK101107526SQ200680002555公开日2008年1月16日申请日期2006年1月18日优先权日2005年1月19日发明者C·维斯科夫,P·莫里尔申请人:艾文蒂斯药品公司