免疫应答评价方法

专利名称：免疫应答评价方法
技术领域：
本申请涉及鉴定免疫调节肽的方法，更具体地，涉及通过免疫应答的多重分析来鉴定抗原肽的新方法和系统。
背景技术：
免疫系统提供了对抗微生物攻击的保护。其真实的本质是一个复杂的系统，因为它必须能够识别并适应不断变化的威胁，同时限制对自我组织的附带损害。这种复杂性的结果是免疫机能障碍，活性过度或不足，是许多人类疾病的根源。获得性免疫系统(包括B细胞和T细胞)识别分子模型形式的抗原，如肽，糖肽，磷肽和脂质，结合并在分化类别的抗原递呈分子的范围内递呈。由T细胞识别的抗原衍生的片段，例如肽，称为抗原决定部位。广泛认可的是通过T-细胞识别其特异性抗原决定部分是获得性免疫功能中的关键事件。
这些分化的抗原递呈分子包括i)典型的人白细胞抗原(HLA)蛋白，其是高度多形性的并可以分成两个主要的类别，I类和II类；ii)由HLA E，F和G亚基因座编码的非典型群(Braud VM，Curr OpinImmunol.1999年2月；11(1)100-8)，和iii)抗原递呈分子的CD1家族(Bendelac A，Science 1995年7月14日；269(5221)185-6)。HLA I类分子由HLA A，B和C基因座编码并对CD8+细胞毒性T细胞递呈8-10个氨基酸(AA)肽(Adama EJ，Immunol Rev.2001年10月；18341-64)。HLA II类分子对CD4+辅助T细胞递呈12-16个AA肽并由HLA DR，DP和DQ基因座编码(Korman AJ，ImmunolRev.1985年7月；8545-86)。T细胞只在抗原递呈分子范围内且仅在合适的抗原加工和递呈后识别抗原。对于HLA依赖性抗原递呈，抗原加工通常包括蛋白质的蛋白水解破裂作用，形成适合HLA分子凹槽的多肽，这种肽/HLA复合物随后对T细胞在抗原递呈细胞的细胞表面上递呈(Rock，K，Adv Immunol，2002；801-70，CresswellP，Curr Biol.1994年6月1日；4(6)541-3)。非典型群由HLA E，F和G亚基因座编码且特征在于低程度的多形性以及结合免疫效应细胞并对免疫效应细胞递呈有限系列肽的能力。已经证明通过非典型HLA分子递呈的肽的识别在如母体胎儿接触和/或肿瘤免疫性方面的诱导免疫耐受性是重要的。这些分化分子中的其他重要群是CD1家族，其涉及脂质如细菌糖脂对免疫系统中的分化效应细胞的递呈。
T细胞免疫性的三个主要类型可以遵循抗原识别1型(Th-1)，2型(Th-2)和调节(T-调节)。1型免疫性对于胞内病原体的清除和抗肿瘤免疫性是重要的，其主要特征在于IFNγ(IFN-γ)的表达。2型免疫性对于胞外病原体的清除是关键的，其主要特征在于细胞因子如IL-4，IL-5，IL-9和IL-13的表达。通过细胞因子如IL-10或TGF-β介导的T-调节类型的免疫性，对于自我耐受性的产生和维持是必要的。这三种类型的应答不限于典型的TCR+CD8+T细胞，还可以通过γ/δTCR+CD8+T细胞以及天然杀伤(NK)细胞和NK T细胞来介导。因此，特定抗原决定部位通过这些细拔类型任一种识别导致它们的激活和与众不同的专门化应答。因此可以通过观察细胞因子模式(1型，2型和T-调节)的协调表达来描述免疫应答的特性。
免疫反应过程中合适T-细胞应答的激活通常涉及一个分化应答优于其他的优势。这种合适的专门化T-细胞应答的选择性激活是疾病结果的关键决定因素。这是在麻风个体应答中证明的惊人实例，其中对感染的1型-应答的特征在于保护性的免疫性而2型应答通常导致致命的疾病。另一个关于肿瘤免疫性的惊人实例中，已经表明导致朝向T-调节应答的不合适转变的tolerogenic抗原决定部分导致随后人体中的肿瘤进展，而通过肿瘤抗原决定部位激活1型应答与肿瘤生长的抑制相关。此外，如果自我抗原得到递呈，远离T-调节应答的不合适转变可以导致自身免疫性疾病的产生。自身免疫性疾病特异性的临床实况将取决于显性应答1型，如在1型糖尿病情况中，或2型，如在过敏的情况中。
因为这些专门化T-细胞应答的激活取决于特异性抗原决定部位对它们的递呈，因此鉴定这些肽抗原决定部位是有利的。通过在疾病状态早期鉴定这些专门化的T-细胞抗原决定部位，提高合适的T-细胞应答或消除不合适的T-细胞应答的机会增加，并因此转变免疫应答的平衡来改善疾病结果。这些抗原T-细胞抗原决定部位的定量鉴定和定性表征方法对于疫苗设计以及感染、自体免疫和肿瘤疾病的诊断和治疗方法是重要的基础。
发明概述本发明包括鉴定一种或多种来自个体的免疫调节肽的组合物和方法，通过在取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的一种或多种肽的存在下培养个体的免疫细胞并同时分析培养物的多个免疫反应性参数如特异性和对肽上抗原决定部位的细胞因子应答，其中通过对个体HLA类型无关的肽的免疫反应性的存在来鉴定免疫调节肽。例如，反应性抗原决定部位可以选自肽集合中的免疫调剂肽。该方法还包括从特定的个体分离肽特异性的效应细胞。
另一个实例是鉴定一个或多个免疫调节片段的方法，通过从个体分离免疫细胞；在一个或多个来自处理过肽文库的片段存在下培养免疫细胞；并同时分析培养物的多个免疫特异性参数和细胞因子对片段的应答，其中通过对片段的免疫反应性的存在来鉴定免疫调节片段。使用该方法，可以分离多种肽片段特异性的效应细胞，甚至纯化成例如混合物或无性繁殖群。另一个实例中，本发明包括鉴定个体对抗原物质表达的免疫反应性类型的方法，通过分离并在一个或多个抗原片段存在下培养一种或多种个体的免疫细胞；鉴定免疫细胞产生的细胞因子；并基于应答抗原物质的协调细胞因子表达来测定免疫反应性类型。抗原物质可以包括抗原，肽，微生物，细胞及其组合的混合物。抗原蛋白包括具有已知或未知氨基酸序列的肽，来自已知或未知蛋白和/或肽片段，乃至在用于方法和随后的表征之前通过大小分级取自己知蛋白质或肽的重叠肽文库。一些实施方案中，抗原材料包括以不同比例提供的多种抗原物质和/或肽来驱动免疫应答的类型，例如，Th1v.Th2或Tc1v.Tc2或其混合和组合。
本发明还包括用于测定个体免疫状态的诊断方法，通过从个体分离免疫细胞，在取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的系列肽的存在下培养免疫细胞并同时分析培养物的多个免疫反应性参数来鉴定至少一种用于个体的免疫调节分子以基于鉴定所产生的细胞因子来测定对免疫调节分子的免疫反应性类型，其中免疫反应性类型表现出个体的免疫状态。例如，该方法可以测定个体免疫抑制的程度，个体免疫系统超活化的程度，个体的T-细胞所有组成成分，甚至免疫反应性类型，其可以表现出个体免疫相关疾病的风险。使用本发明可以监控的免疫相关疾病的非限制性实例包括传染病，自身免疫性疾病，自体炎症疾病，癌症，慢性炎症和过敏。
本发明的另一用途是在预测个体对治疗应答的方法中，其中在取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的存在下培养个体的免疫细胞，分析培养物的多个免疫反应性参数来鉴定对于个体T细胞和HLA清单的至少一种免疫调节分子并分析培养物的细胞因子产生来测定对免疫调节分子的免疫反应性类型，在治疗之前基于所产生的细胞因子的鉴定来测定个体抗原决定部位特异性免疫状态，作为治疗结果的指示剂。治疗可以是免疫治疗，如接种疫苗，被动免疫治疗和过继细胞转移。另一个实例是预测个体疾病进程和临床结果的方法，通过在取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的系列肽存在下培养一种或多种个体的免疫细胞，并分析培养物的细胞增殖和细胞因子产生特征来测定对免疫调节分子的免疫反应性类型，其中细胞因子产生特征是疾病严重程度和疾病进展或退化状态的标志。
另一个实例是定制用于个体的治疗干预的方法，通过基于多个免疫反应性参数的分析包括所产生的细胞因子的分析来鉴定一种或多种个体的免疫调节分子；并制备含有一种或多种免疫调节分子的抗原决定部位特异性免疫疫苗。疫苗包括，例如，一种或多种提高或降低个体特定类型的免疫应答的抗原；一种或多种提高或降低个体抗原决定部位特异性细胞因子产生的抗原；一种或多种提高或降低个体抗原产生或提高细胞介导的免疫性的抗原。
再一个免疫调节个体的方法包括用一种或多种从文库鉴定的免疫调节肽使个体免疫；测定个体的抗原决定部位特异性免疫状态，通过在暴露于一种或多种免疫调节肽后分离个体的免疫细胞；并比较免疫之前和之后的免疫应答类型来测定个体抗原决定部位特异性免疫状态的改变。
实施中，治疗需要免疫治疗的个体的方法包括将个体的免疫细胞暴露于一种或多种免疫调节肽来测定由一种或多种免疫调节肽引发的免疫应答类型；用影响免疫应答类型的免疫调节肽来治疗个体；在用一种或多种免疫调节肽治疗个体后评价免疫应答的类型，且如果需要，改变一种或多种免疫调节肽来改变免疫应答类型。治疗效力的测定可以用来监控疫苗治疗，抗癌治疗，抗肿瘤治疗，器官移植，过敏，自身免疫性疾病的治疗和传染病的治疗。本发明的另一种方法包括鉴定和表征用于免疫治疗的新治疗剂，通过在免疫调节剂和一种或多种取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的肽的存在或不存在下培养分离的免疫细胞；同时分析培养物的多个免疫反应性参数如特异性和对肽上的抗原决定部位的细胞因子应答；并将免疫调节剂存在时的免疫反应性和免疫调节剂不存在时的免疫反应性相比较，其中免疫反应性的抑制表示为免疫抑制治疗剂，其中免疫反应性的提高表示为佐剂，甚至可以驱动对Th1，Th2，Tc1，Tc2或其组合的免疫应答类型。
通过以下方法来鉴定一种或多种治疗剂在免疫调节剂和一个或多个来自目标抗原剂的片段存在和不存在下培养分离的免疫细胞；同时分析培养物的多个免疫反应性参数如特异性和对片段的细胞因子应答；并分离免疫反应性细胞。抗原剂可以是传染病，癌症，肿瘤，自身免疫性疾病，自体炎症疾病，关节炎，糖尿病，过敏，器官移植和骨髓移植。还可以通过以下方法来鉴定疫苗抗原决定部位在一种或多种取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的肽的存在下培养分离的免疫细胞；分析培养物的多个免疫反应性参数和细胞因子产生以基于所产生的细胞因子的鉴定来测定对肽的免疫反应性类型；并使用一个或多个具有相同鉴定序列的肽来制备疫苗。该方法足够灵活使得甚至可以在分离后测定一种或多种肽。还可以通过以下方法来鉴定疫苗抗原决定部位在取自抗原剂的重叠肽文库的系列肽的存在下培养分离的免疫细胞并分析培养物的多个免疫反应性参数和培养物中的细胞因子产生来测定对一种或多种肽的免疫反应性类型，其中疫苗抗原决定部分的特征在于它们引发了对抗原剂的免疫反应性。抗原剂的实例包括病毒，细菌，真菌，原生生物，寄生物或蠕虫。抗原剂可以是自我抗原。还可以分析细胞培养物并测定一种或多种T细胞，B细胞，树突细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞和红血球的特征。
本发明的组合物包括一种或多种从对于特定个体鉴定为免疫反应性的肽文库分离的选择来改变免疫应答类型的肽，已经在该个体中鉴定了对于Th1和Th2T细胞的反应性肽。再一个实例组合物包括一种或多种从对于特定个体鉴定为免疫反应性的肽文库分离的选择来改变免疫应答类型的肽，已经在该个体中鉴定了对于Tc1和Tc2 T细胞的反应性肽。可以将这些组合物配制成疫苗，以干的或液体形式等。
附图简述为了更完整地理解本发明的特征和优势，现在参照本发明的详述和附图，其中

图1是描绘了根据本发明评价的正常捐献者的免疫应答的图，其中从HLA-A0201+健康志愿者新鲜吸出的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，以2×105细胞/孔重复三份接种于圆底96-孔平板中，并用1μl的HLA-A0201限制性肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV)或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)孵育；48h后收集培养物上清液并使用Luminex技术来定量评价细胞因子和趋化因子的存在；图2是描绘了根据本发明的正常捐献者对HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)的免疫应答的另一个实例的图。从另一个HLA-A0201+健康志愿者新鲜吸出的血液中分离PBMC，以5×105细胞/孔重复三份接种于圆底96孔平板中，并用10μl/ml的HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV)或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)孵育；48h后收集培养物上清液并使用Luminex技术来定量评价细胞因子和趋化因子的存在；图3A-3D是描绘了根据本发明评价的2名黑素瘤患者免疫应答的图；图4A-4C是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图5是描绘了根据本发明评价的正常捐献者免疫应答动力学的图；图6描绘了根据本发明的抗原决定部位聚焦的略图，其中将重叠肽文库分成肽簇(5-10个肽/簇)，进行簇的分析，接着抗原决定部位聚焦；图7是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图8是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图9是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图10是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图11是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；
图12A和12B是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其中用15-mer MART-1肽或稀释剂刺激DC接种前和8次DC接种疫苗后从黑素瘤患者(与图10的相同)获得的PBMC；图13是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图14是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图15是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图16A-D是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图17是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图18是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图19是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图20是描绘了用图19中所示的鉴定15-mer肽刺激时CD4+T细胞的IL-2产生的图；图21A-B是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，使用从图19所示的相同黑素瘤患者获得的PBMC。
图22A-C是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图23是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图24是描绘了用图23中所示的鉴定15-mer肽刺激时CD4+T细胞的IL-5产生的图。
图25是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图26是描绘了根据本发明评价的三名黑素瘤患者免疫应答的图；图27描绘了用EPIMAX方法鉴定的4种黑素瘤抗原，即gp100，MART-1，NY-ESO1和TRP-1内的CD4+和CD8+T细胞的新抗原决定部位的概述；图28描绘了根据本发明评价的三名黑素瘤患者免疫应答的图；图29A-D是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图30包括描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图31是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图32是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图；图33包括描绘了根据本发明评价的三名正常健康志愿者的免疫应答的图；图34包括描绘了根据本发明评价的三名正常健康志愿者的免疫应答的图；
图35包括描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者的免疫应答的图；图36是描绘了根据本发明从冻融的PBMC评价三名正常健康志愿者的免疫应答的图；图37是描绘了根据本发明从冻融的PBMC评价三名正常的健康志愿者的免疫应答的图；图38A和38B是描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图；图39A和39B是描绘了正常健康志愿者对抗EPIMAX测试中鉴定的肽的免疫应答的图，并证明了EPIMAX可以鉴定功能Flu-MP特异性CD4+T细胞的抗原决定部位；图40是描绘根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图，并显示了特异性CD4+T细胞的新抗原决定部位的鉴定；图41A和B是描绘了正常健康志愿者对抗EPIMAX测试中鉴定的肽的免疫应答的图；图42是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答和个体的抗原决定部位的图，两个肽都含有氨基酸错配并显示出在器官移植的环境中鉴定异源抗原特异性T细胞的能力；图43是描绘了根据本发明评价的1型糖尿病个体免疫应答的图；图44A-44B描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T细胞引起的各种类型的免疫应答；图45是描绘了根据本发明评价的五名正常健康志愿者免疫应答的图，其允许鉴定由非T细胞引起的各种类型的免疫应答；图46包括两张描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T-细胞引起的各种类型的免疫应答；图47是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T-细胞引起的各种类型的免疫应答；图48包括四张描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T-细胞引起的各种类型的免疫应答；和图49包括两张描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，并证明了由非T-细胞引起的各种类型的免疫应答的鉴定。
发明详述尽管以下详细讨论了本发明各种实施方案的形成和使用，应当认识到本发明提供了许多在各种特定内容中具体化的可应用创造性概念。在此讨论的特定实施方案只是以特定方式来说明形成和使用本发明并不是限制本发明的范围。
为了帮助理解本发明，以下定义了多个术语。在此定义的术语具有本发明相关领域的技术人员通常理解的意思。如术语“a”，“an”和“the”不仅仅用来指单数实体，而是包括总的分类，其中的一个特定实例可用于说明。在此的术语用于描述本发明的特定实施方案，但是它们的使用没有限定本发明，除了权利要求中列出的以外。
本发明包括能够测定抗原特异性免疫应答的组合物和方法，不考虑所诱导的应答类型。如在此所用的，术语“诱导的免疫应答类型”或“免疫应答的类型”用于描述通过Th1，Th2，Tc1，Tc2及其组合的免疫细胞应答或其他与递呈肽或抗原的主要组织相容性复合体(MHC)无关的基于T细胞的获得性免疫的激活或调节，借此T细胞识别并应答MHC范围内的特定肽或抗原，及其对相同的细胞、邻近的细胞或影响特定T细胞的细胞的作用或其对递呈肽或抗原的细胞的作用。有经验的免疫学者将识别可能重叠的术语，即，通常所指的蛋白质已经通过抗原递呈细胞加工并装载成肽、抗原或抗原决定部位，其在特定MHC糖蛋白范围内递呈，即，I类或II类。
清楚的是在此范围内所用的术语“肽”，“抗原”或“抗原决定部位”可关于抗原递呈细胞递呈后T细胞的免疫调节的递呈来使用。如在此所用的，术语“肽”用于描述氨基酸链。
如在此所用的术语“抗原”，“免疫原”，“抗原决定部位”和“抗原决定簇”可交替使用来描述调节免疫应答的那些肽。如在此所用的术语“调节”用于描述免疫应答的激活，调整，无反应性(anergization)或甚至抑制，例如通过细胞的增殖，细胞因子或免疫因子分泌，细胞间的相互作用，凋亡等所测量的。例如，T细胞应答可以是“调节”的，其中通过能够激活特定类型应答的T细胞释放特定细胞因子或免疫因子，例如，抗体产生；并同时降低另一种类型的应答，例如，细胞毒性T细胞或NK细胞的激活。
如在此所用的术语，“免疫调节”用于描述特定抗原，免疫原，抗原决定部位或抗原决定簇对效应细胞的作用，效应细胞即在原位或甚至在效应级联下游中激活的细胞。
本发明者认识到之前已经产生了用于预测和表征抗原决定部位的许多工具。例如，主要基于MHC肽复合体的X-射线晶体结构数据的肽-主要组织相容性复合体(MHC)相互作用的计算机模型化通常用于预测蛋白质内潜在的抗原决定部位。尽管该方法极大地得益于引入了新的预测算法，然而，这取决于结构数据库的大小，因此在预测该数据组未表示的MHC复合体时就不太有效。该方法提供了鉴定抗原决定部位的方法，但不可以用于表征由那些抗原决定部位引发的特定应答(Flower DR，Novartis Found Symp.2003；254102-20；讨论120-5，216-22，250-2)。
从MHC洗脱肽，接着质谱测序已经成功用于鉴定抗原决定部位(Hunt DF，Science.1992年3月6日；255(5049)1261-3)。尽管是鉴定的有效方法，但肽洗脱是昂贵的，缓慢的，并需要大的样品尺寸，使得在临床环境中使用是不切实际的。该方法还提供了鉴定抗原决定部位的方法，但不可以用于表征由那些抗原决定部位引发的特定应答。
重叠肽文库已经用于鉴定病原体相关蛋白中的抗原决定部位(Martin R，Methods.2003年3月；29(3)236-47)。肽文库筛选使用生物测试作为反应性的读出并因此可以用于测定对抗原决定部位的应答的量级。通过使用重叠文库，可以鉴定所有潜在的I类和II类抗原决定部位。迄今为止，使用肽文库用于评价潜在抗原决定部位的生物测试包括以下方法细胞质内细胞因子，ELISA和细胞增殖(Martin R，Methods.2003年3月；29(3)236-47)。这些测试的任一个中对文库内给定肽的反应是抗原决定部位存在的表示；然而，关于对该抗原决定部位的应答性质，这些方法中没有一个给出清楚的表示，例如，抗原性、过敏性、致耐受性或任何其他特定的应答。
还报道了用于预测和表征抗原决定部位的已知技术的组合。以下给出了组合测试的实例。
肽文库和ELISPOT。ELISPOT技术使用表面结合的捕获抗体来结合平板上培养的细胞分泌的细胞因子。将第二个标记的抗体用于定量分泌细胞因子细胞的数量。通过用重叠肽文库孵育细胞并通过ELISPOT测试细胞因子产生，分离抗原决定部位(Geginat G，JImmunol.2001年2月1日；166(3)1877-84)。然而，该方法是局限的，因为对于任何给定的样品，只有少数细胞因子的产生可以得到测量。这种测量应答抗原决定部位识别所产生的所有范围的细胞因子和趋化因子的无能使得免疫应答(即，1-型，2-型或T-调节)的任何表征变得极其困难。
肽文库和ELISA。ELISA技术使用表面结合的捕获抗体来结合细胞分泌的可溶性细胞因子。将第二个标记的抗体用来与标准曲线相比较时定量分泌的细胞因子的浓度。通过用重叠肽文库孵育细胞并通过ELISA测定细胞因子产生，抗原决定抗原部位得到分离。然而，该方法是局限的，因为对于任何给定的样品，只有少数细胞因子的产生可以得到测量。这种测量应答抗原决定部位识别所产生的所有范围的细胞因子和趋化因子的无能使得免疫应答(即，1-型，2-型或T-调节)的任何表征变得极其困难。此外，通过ELISA测定单个细胞因子需要相当大的至少100微升生物流体和/或培养物上清液的体积。
肽文库和细胞增殖测试。细胞增殖测试使用放射性核素结合或荧光染料稀释来监控响应刺激的细胞分裂。通过用重叠的肽文库孵育细胞并通过细胞增殖测试来测定细胞分裂，抗原决定部位得到分离(Mutch D，J Acquir Immune Defic Syndr.1994年9月；7(9)879-90)。然而，该方法是局限的，因为尽管细胞分裂可以表示抗原应答规模，但关于应答的性质(即，1-型，2-型或T-调节)，该测试没有给出信息抑制。还应答注意到一些抗原特异性应答与快速细胞增殖无关如T-调节应答。
肽文库和细胞毒性淋巴细胞测试(CTL)。细胞淋巴细胞测试监控放射性核素或荧光染料从装载抗原(包括但不限于cDNA，病毒和噬菌体表达文库，完整蛋白，蛋白片段，肽，修饰的肽和脂质)的靶细胞的释放，作为抗原决定部位识别和细胞毒性细胞功能的测量。通过用重叠的肽文库孵育细胞并通过细胞毒性淋巴细胞测试来测定细胞的细胞毒性，抗原决定部位得到分离。尽管细胞的细胞毒性可以表示1-型抗原应答的规模，但测定1-型以外的应答(即，2-型和T-调节)时，该方法的使用是局限的。由于受体从靶细胞中释放出来，使用CTL测试的抗原特异性细胞毒性的表征通常受到低敏感性的困扰。还应当注意到该方法需要大规模的细胞培养扩大且因此不能认为是高通量的。
肽文库和细胞质内的细胞因子染色。细胞质内的细胞因子染色技术使用标准的荧光染色程序和抗细胞因子抗体来测量响应抗原刺激所产生的胞内细胞因子的水平。然后可以通过标准的细胞计数、显微镜或分光光度技术来完成细胞因子产生的测量和产生细胞因子细胞的定量。通过用重叠肽文库孵育细胞并通过细胞质内的染色来测定细胞因子产生，抗原决定部位得到分离(Karlsson AC，J Immunol Methods.2003年12月；283(1-2)141-53)。然而，该方法是局限的，因为对于任何给定的样品，只有少数细胞因子的产生得到测量。。这种测量应答抗原决定部位识别所产生的所有范围的细胞因子和趋化因子的无能使得免疫应答(即，1-型，2-型或T-调节)的任何表征变得极其困难。该方法进一步受到限制，因为需要大量细胞用于分析且对受分析的细胞是破坏性的。
肽洗脱和质谱测序。从MHC洗脱肽接着质谱测序已经成功用于鉴定抗原决定部位(Hunt DF，Science.1992年3月6日；255(5049)1261-3)。尽管对于鉴定是有效的方法，但肽洗脱是昂贵，缓慢且需要大的体积大小，使其在临床环境中使用是不切实际的。该方法提供了鉴定抗原决定部位的方法，但不能用于表征由那些抗原决定部位引发的特定应答(即，1-型，2-型，T-调节)。
肽MHC相互作用的计算机模型化。主要基于MHC肽复合体的X-射线晶体结构数据的肽-主要组织相容性复合体(MHC)相互作用的计算机模型化通常用于预测蛋白质内潜在的抗原决定部位。尽管该方法极大地得益于引入了新的预测算法，然而，这取决于结构数据库的大小，因此在预测该数据组未表示的MHC复合体时就不太有效(Kuhara S.Pac Symp Biocompt.1999；182-9)。该方法提供了鉴定抗原决定部位的方法，但不能用于表征由那些抗原决定部位引发的特定应答。
通过重组表达克隆的抗原血清学鉴定(SEREX)。SEREX技术涉及通过组合表达文库筛选鉴定由血清抗体识别的抗原决定部位。尽管对于激素免疫应答SEREX技术给出了鉴定，但对于细胞免疫应答的规模或性质没有给出这样的鉴定(Tureci O，Mol Med Today.1997年8月；3(8)342-9)。该技术费时费力，并因此在临床环境中是不切实际的。
用于多重细胞因子分析的实时PCR。实时PCR可以用于以定量方式测量编码多重细胞因子的RNA的表达(Giulietti A.，Methods.2001年12月；25(4)386-401)。然而，该技术是费时费力的，需要大量细胞来分离足够量的RNA用于分析，且对于细胞是破坏性的。最后，RNA的表达不表示生物活性细胞因子的分泌。
如上所述，已经报道了能够预测并表征抗原决定部位的技术，且在一些情况中，为了最大化有用信息的量，已经将各种技术结合起来，如基于荧光的增殖测试和胞内细胞因子测试。这些结合的测试通常受到其单个组成测试的限制，如与上述的细胞质内细胞因子染色相关的局限性。
存在对高通量多参数技术的迫切且迄今为止未完成的需要，该技术易于自动化，非破坏性的并需要小的样品大小，使其可应用于临床诊断环境，使得可以测定人体内的免疫应答。考虑到其中需要提供免疫应答的图像和/或鉴定病原体性质的快速测试的新兴和再次新兴的病原体以及生物威胁剂，这种需求特别重要。上述的方法中没有一个提供对抗原决定部位的定性和定量免疫应答的清楚表征。除计算机模型化以外，这些方法没有提供高通量，限制了它们在诊断或免疫监控立场的实用性。
本发明提供了免疫调节肽及其衍生物的鉴定，因此允许评价健康和患病个体中诱导的具有诊断、预后和治疗含义的免疫应答类型。该方法还给出了应答的性质和规模的测量，而同时鉴定了对其产生应答的抗原决定部位。
一发明中，本发明是测定抗原特异性免疫应答的方法，与诱导的应答类型无关，因此允许评价健康和患病个体中诱导的免疫应答类型。该方法同时给出了免疫应答的定性和定量测量，而同时鉴定了对其产生应答的抗原决定部位。
本发明的方法是三种方法的结合，人或动物的免疫细胞的细胞培养，非MHC限制的抗原物质的递呈，并分析细胞因子和/或趋化因子的存在，其提供了观察所有类型免疫应答的能力。一实施方案中，三种技术包括人或动物的免疫细胞的细胞培养，非MHC限制的重叠肽文库，和细胞因子和/或趋化因子存在的多重分析。优选，本发明是测定抗原特异性免疫应答的多阶段方法，其中第一个阶段是高通量筛选(阶段I)，和第二个阶段提供特定抗原决定部位的鉴定(阶段II)。
本发明的方法使用细胞培养物分析，使用呈现能够不同抗原加工，递呈和识别肽和非肽抗原决定部位(例如，糖脂)的多种细胞类型。用于本发明方法的合适细胞包括但不限于T细胞，B细胞，树突细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞和红血球。包括T细胞，B细胞，NK细胞和NK-T细胞的分离外周血单核细胞(PBMC)提供了用于本发明的多种细胞类型的易获得来源。此外，用于培养还支持细胞因子产生的人或动物细胞的任何本领域已知的标准化程序适用于本发明中。
本发明的方法中，任何抗原物质可以用于引发免疫应答。适用于本发明的抗原物质的来源包括抗原，肽，蛋白质，微生物，细胞，组织，肿瘤或其组合物。合适的抗原物质包括但不限于包括肽，糖肽，磷肽，脂质，糖脂和磷脂的组合物。
一实施方案中，在本发明中使用重叠肽文库来鉴定目标蛋白上的抗原决定部位并用来刺激免疫应答。该技术提供了鉴定给定抗原的所有可能的I类和II类抗原决定部位并适于CD4和CD8 T-细胞应答。且抗原决定部位的鉴定不受HLA-单套形的限制。
将目标蛋白的氨基酸序列分成小的重叠肽，例如，一系列具有3至4个氨基酸偏移(offset)的8-至15-mer重叠肽。根据本发明，可以制得或从商业可获得来源购买重叠肽文库。例如，从含有296个氨基酸的流感基质蛋白质，可以制得60个重叠15-mer肽(具有4个氨基酸偏移)的重叠肽文库。
从重叠肽文库，用一种或多种粘附培养容器的肽来准备细胞培养容器。在一个多阶段方法中，将多孔的阶段-I培养平板用于筛选目的，其中每个孔含有几个重叠肽的簇。筛选需要的每簇重叠肽的数量和簇的数量取决于蛋白质自身的大小。优选，每个簇含有约5-10个重叠肽；对于较小的蛋白质，约3-7个重叠肽。在一个多阶段实施方法中，将目标蛋白的重叠肽文库通过簇分配至编号的预先处理的96孔阶段I培养平板中，每孔每簇5-10个肽。对于阶段II，以每个孔单个肽来分配反应性簇内的重叠肽。为了最大化通量和最小化测试与测试之间的变化，预先制备阶段I的培养平板。预先制备并存储于-80℃的平板具有最少一年的货架期。且一定程度上发现特异性阶段I簇是重复抗原性的，也可以预先制备阶段-II的培养平板。
为了开始本发明的免疫应答测试，将目标免疫细胞加入上述的培养容器中并在支持响应粘附于培养容器的抗原肽的细胞因子产生的条件下培养一段时间。使用该方法可以测定的免疫细胞包括但不限于PBMC，淋巴细胞，T细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞，NK细胞，NKT细胞，TCR T细胞，B细胞，单核细胞，树突细胞和粒细胞。在一种方法中，使用外周血单核细胞(PBMC)。在多阶段方法中，例如，将PBMC以2×105每孔接种于一个或多个上述含有目标抗原重叠肽文库的编号的预先处理的96孔阶段-I培养平板中，每孔每簇5-10个肽。然后在支持细胞因子产生的条件下孵育免疫细胞，使用对于特定细胞类型选定的培养基、温度和孵育条件。例如，如实施例1中所述的，优选将PBMC在完全培养基中37℃孵育18-48小时。孵育后，将细胞沉淀并从每个孔中分离出上清液并分析多种细胞因子和趋化因子的存在。对于在此所述的本发明，术语“细胞因子”用来表示细胞因子和趋化因子两者。
根据本发明，对于相同样品中几种细胞因子的存在，优选20或更多种细胞因子，本领域中已知的能够同时分析上清液的任何方法可用于本发明中。这样的方法包括质谱，基于抗体的矩阵，和多元分析珠子技术。使用细胞因子多元分析，因为i)可以同时测量多个免疫参数，ii)需要小体积的样品，iii)提供不破坏样品的灵敏测试；iv)支持专门化免疫应答的特征性特定细胞因子的协调表达，和v)提供免疫效应的直接测量。合适的可购得的细胞因子多元分析仪是Luminex100细胞因子多元工作台(Luminex Corp.，Austin，Texas)，其能够同时测量高达100个分析物，需要小体积的样品，并快速检测每微升1-32,000微微克动态范围内的细胞因子的存在。细胞因子多元矩阵技术(Luminex)允许同时定量小体积中的多种细胞因子和趋化因子(Earley MC，Cytometry，2002年10月15日；50(5)239-42)。该测试本质上是高通量的，并可以应用于多种生物样品的分析。通过分析响应刺激或病原损害的协调细胞因子表达，可以描述对应于特异性免疫应答的所述特异性生物性质。
在一种方法中，将50微升上清液以96孔形式转移至Luminex100细胞因子多元工作台中(Luminex Corp.，Austin，Texas)并根据制造商的说明来分析。快速筛选重复两份的上清液中多种细胞因子的存在，使用预先制备并使之有效的珠子和试剂的总混合物。
在多阶段的方法中，将通过阶段-I细胞因子分析证明反应阳性的抗原簇分解成它们构成的肽组成部分，用于如上所述的抗原决定部位聚焦阶段-II培养平板上的抗原肽的鉴定。在一种方法中，阶段-II培养平板包括编号的预先处理的孔-条带，孔-条带含有每个簇的各个成分肽，重复两份。将目标免疫细胞加入孔-条带中并在支持响应粘附孔-条带的抗原肽的细胞因子产生的条件下培养一段时间。例如，将融化的PBMC以2×105细胞每孔加入孔-条带中并在37℃培养18-48小时。培养后将细胞沉淀，分离上清液并分析细胞因子产生。在一种方法中，将50微升上清液转移至Luminex工作台中用于分析。对于给定肽条带的阶段-II中的多元筛选包括响应阶段-I分析过程中的亲本簇所产生的细胞因子。阶段II筛选中鉴定的肽表示由该个体识别的抗原决定部位。响应鉴定的肽而产生的细胞因子和趋化因子的特征模式是该抗原决定部位引发的特定应答类型的表示。
本发明的方法是高通量的方法，用于快速鉴定和表征肽特异性的T-细胞抗原决定部位。如在此所示的，测试的产生和证实已经引起选定组细胞因子和趋化因子的鉴定，其允许鉴定-1型，2-型和T-细胞调节表型。
本发明的这种方法具有优于现有技术的几个优势，包括a)高灵敏度对于所有测试的细胞因子，在每微升微微克检测；b)高通量可以在48小时内完成测试；c)小体积生物流体中多种分析物的分析，例如测定50微升体积中至少30种细胞因子和趋化因子；d)非破坏性允许增加基于细胞的测试用于多个参数的分析；和e)以HLA单套形无关的方式来鉴定抗原决定部位。本发明的方法使用细胞因子多元化来监控多个免疫参数并因此能够表征免疫应答的性质，包括但不限于抗原性、过敏性和致耐受性应答。通过监控多种细胞因子的协调应答，抗原决定部位的鉴定和表征也比本领域技术的现有状态更灵敏。现有本领域技术中没有一个单独或结合能够提供细胞因子的多参数测定，而本发明方法的抗原决定部位的鉴定和表征可以提供。此外，本发明的方法包括高通量技术的优势。还应当注意到相对于本领域技术的现有状态，本发明的方法对测试的细胞不是破坏性的；因此其可以结合许多标准或定制免疫测试，包括但不限于增殖，胞内细胞因子和表面受体染色，CTL活性和ELISPOT。最后，本发明的方法需要比任何其他目前可用技术更小体积的生物流体和/或培养物上清液和更少数量的细胞用于测试。因此，本发明的方法是高通量的，低体积的，非破坏性的技术，易于自动化，并因此对于诊断、预后和治疗用途是实用的。
一方面中，本发明是允许鉴定免疫调节肽及其衍生物的方法，具有诊断、预后和治疗应用。(a)诊断该技术可以用于测定个体先前存在的免疫状态。通过鉴定和表征多种抗原的抗原决定部位，可以测定个体完整T-细胞组成部分的完整图。该技术是高通量的，易于自动化，非破坏性的和需要小的样品大小，使其可应用于临床诊断环境中。因此，可以用作多种自体反应性疾病和超免疫应答诊断中的工具，包括但不限于过敏症、糖尿病、关节炎、狼疮和多发性硬化。(b)预后通过该技术测定治疗前个体的抗原决定部位特异性免疫状态可以作为治疗结果的预后指示。因此，可以调整治疗干预的过程来提高或消除这种免疫状态。该技术可以用于抗肿瘤免疫治疗、气管移植、过敏症和自身免疫性疾病治疗的预后测定。(c)治疗本发明的方法可以用作治疗过程中的免疫调控工具。治疗过程中的抗原决定部位特异性免疫应答的特异性、规模和性质的完整图可以用来测定正在进行的治疗的效用。基于该方法的数据，可以调整治疗来提高、调节或抑制特定的免疫应答。因此，该技术可以用于指导疫苗研发、抗肿瘤免疫治疗、器官移植、过敏症和自身免疫性疾病领域中正在进行的治疗。
另一方面中，本发明可用于设计新的药物，包括但不限于疫苗、生物活性肽和靶向试剂。(a)疫苗本发明的方法极大地有助于有效疫苗的研发。使用该技术鉴定的抗原决定部位本身可以作为有效的疫苗来提高对抗传染病或癌症的免疫应答，或使对抗用于自身免疫性疾病、过敏症或器官移植治疗的蛋白质的免疫应答变成无反应性(tolerize)。(b)生物活性肽已经描述了通过较大蛋白质的蛋白水解产生的生物活性肽具有意义深远的神经调节和免疫调节功能。使用该技术，可以快速鉴定具有这些特定的蛋白质。(c)靶向试剂使用该技术鉴定的与细胞上特定受体相互作用的生物活性肽可以用作靶向试剂，将药物传送至特定的细胞群。
本发明的方法适用于数种医学应用中，包括但不限于慢性感染、过敏症、肿瘤疾病、自身免疫性疾病、阿尔海默氏病、急性传染病、器官移植和动脉血管粥样硬化。可以理解这些应用意味着是代表性的，且本领域已知的其他应用作为本发明的一部分来考虑。
慢性感染。惊人数量和种类的人类疾病是由慢性致病感染而引起的。尽管这些疾病的进程不同，它们全部可以通过无力引发并有效应答病原体来表征，不管是1-型或2-型。一旦应答得到引发，蛋白质相关病原体中的自我抗原决定部位拟态也可以诱导自体免疫应答，其在清除感染后还能持续很长时间，如Lyme关节炎和Herpes相关的脱髓鞘疾病。病原体免疫识别后的自体免疫反应的出现使得可以选择对安全而有效的治疗关键的特异性抗原决定部位。研究已经涉及一些慢性感染中调节应答的不适当激活。本发明的方法适用于关于慢性感染的诊断、预后和治疗应用。(a)诊断用于一些慢性感染剂的非入侵诊断测试，如用于HBV的基于PCR的测试，证明在临床环境中非常有效。通过对病原体相关肽的特异性应答的快速检测和表征，本发明的方法可应用于慢性感染的诊断。通过使用该技术也有助于病原体相关自体免疫并发症的诊断。(b)预后本发明的方法可用于检测和表征对特定病原体相关抗原决定部位的反应，1-型，2-型或T-调节，随后其可作为疾病结果的预后指示，因此指导抗生素治疗。本发明的方法适用于检测和表征对特定病原体相关抗原决定部位的反应，其对于感染相关的自身免疫性疾病的发作，也可以作为预后指示。(c)治疗通过本发明的病原体相关蛋白的抗原决定部位的鉴定和表征可以有助于安全有效的预防和治疗疫苗的研发。这些包括实现避免自我抗原决定部位拟态的疫苗。疫苗还将包括全部变体抗原决定部位的鉴定，靶向病原体蛋白组内的不变抗原决定部位，因此提供对抗相同病原体的多个菌株以及每种病原体的常见突变体的保护，如在HIV和疟疾的情况中。通过这种技术的应用鉴定和消除T-调节抗原决定部位和响应细胞在启动保护性抗病原体应答中起作用。
过敏症。过敏症是对通常无害物质的超免疫应答。已经报到不恰当的转变成2-型应答在引发过敏性免疫应答中起关键作用。已经鉴定出许多过敏原，包括吸入过敏原，如屋尘螨虫，花粉和霉菌；食品过敏原如蛋，小麦，大豆和坚果；或一些药物如青霉素。可以导致严重的通常为致命的反应，称为过敏性反应。因此过敏症范围内的T-调节应答的激活是有利的。(a)诊断皮肤测试和血液测试，如过敏原特异性IgE水平，通常用于鉴定过敏原。然而，皮肤测试对于一些经受过敏性反应的个体是危险的。本发明的方法可以应用作为鉴定个体特异性抗原决定部位的安全诊断工具。(b)预后本发明的方法允许鉴定个体过敏症个体的过敏原抗原决定部位。这对于监控治疗过程中的免疫应答或对于后续是有用的。还可以在治疗后鉴定致耐受性T-调节刺激抗原决定部位并可以作为成功治疗的预后指示。(c)治疗抗原决定部位的鉴定可以形成基于肽的新疫苗，其可以用于将免疫应答转换成T-调节或选择性地消除或抑制不恰当的2-型细胞。
肿瘤疾病。将肿瘤疾病定义为从正常组织突变的异常细胞不受控制的生长。这些包括癌症，实体肿瘤和淋巴/造血系统的恶化，将所有这些总称为肿瘤。已经报道肿瘤环境通过几种不同的机理诱导对抗肿瘤抗原的免疫耐受性。尽管对抗肿瘤细胞的1-型T细胞的产生涉及肿瘤生长的压抑或抑制，对耐受性转变的免疫应答抑制癌症特异性1-型T细胞的产生。然而，在一些癌症中，肿瘤抗原特异性1-型T应答通过过敏性拟态诱导自身免疫性疾病。例如，已经报道CDR2(乳房和卵巢肿瘤抗原)特异性的细胞毒性T细胞，诱导一些个体中的肿瘤性侧小脑恶化(PCD)。
抗肿瘤免疫性过程中自体反应的出现使得可以选择对安全有效治疗关键的特异性抗原决定部位。(a)诊断通过使用本发明的方法有助于肿瘤相关自体免疫并发症的诊断。(b)预后使用该技术对特异性肿瘤相关抗原决定部位反应(1-型，2-型或T-调节)的检测和表征，可以作为疾病结果的预后指示。通过比较接种疫苗前和接种疫苗后之间的肿瘤特异性免疫应答的性质和规模，本发明的方法允许评价任何种类的疫苗治疗。对于肿瘤相关自身免疫性疾病的发作，使用该技术对特定肿瘤相关抗原决定部位反应的检测和表征可以作为预后指示。(c)治疗通过本发明的方法对肿瘤相关蛋白的抗原决定部位的鉴定和表征有助于安全有效治疗疫苗的研发。这将包括实现避免自我抗原决定部位拟态的疫苗。
自体疾病。将自体疾病定义为由对抗身体自身组织的免疫应答引起的失调。认为自我抗原递呈范围中远离T-调节功能的不恰当转变是自身免疫性疾病的发作和进展中的关键因素。所得到疾病的特定性质取决于显性应答。例如，在1-型糖尿病的情况中，已经分离了个体体内识别胰岛的1-型细胞(Arif S，J Clin Invest.2004 113451)。此外，在多发性硬化个体中，存在表明髓磷脂碱性蛋白(MBP)-反应性1-型极化T-细胞经受体内激活和无性繁殖扩大的证据，已经报道其在发病机制中起主要作用。(a)诊断本发明的方法允许鉴定引起给定类型的自体反应性免疫细胞扩大的显性自我抗原决定部位。(b)预后本发明的方法允许鉴定个体自体免疫个体的自我抗原决定部位。这对于监控治疗过程中的免疫应答或用于继续是有用的。还可以在治疗后鉴定致耐受性T-调节刺激抗原决定部位并作为成功治疗的预后指示。(c)治疗抗原决定部位的鉴定可以形成基于肽的新疫苗，其可以将免疫应答转变成T-调节或选择性地消除或抑制不当1-型或2-型细胞。
阿尔海默氏病。阿尔海默氏病(AD)是缓慢进展形式的痴呆，其是智力功能功能渐进性或获得性的削弱。AD的特征在于大脑区域中42-残基淀粉状蛋白(Abeta)的渐进性沉积。报道表明与年龄相当的成人相比较时，相当高比例的健康老年对象和AD个体具有强烈的1-型和2-型特征的Abeta-反应性T-细胞应答。(a)诊断许多情况中，阿尔海默氏病和老年痴呆之间的不同诊断只有在mortem后才能得到确凿的确定。本发明的方法可用于鉴定Abeta反应性T细胞应答，因此其可以作为AD的诊断指示。(b)预后通过本发明方法的特定免疫应答的鉴定可以允许预测疾病的临床过程。
急性感染。对抗病原体的1-型应答的诱导对于从胞内微生物如细菌和病毒的恢复是关键的。相反，胞外病原体如蠕虫诱导2-型细胞的产生，其细胞因子指引IgE和嗜曙红细胞介导的病原体破坏。一些病毒，如埃博拉病毒或登革热病毒，导致具有高死亡率的严重疾病，对于这两种病毒还没有建立得到许可的疫苗。在小鼠模型中，已经证明使用源自埃博拉病毒糖蛋白(GP)和基质蛋白(VP40)的病毒样颗粒(VLP)的疫苗激活T细胞和B细胞，并保护不受病毒激发的影响。(a)诊断本发明的方法适用于鉴定诊断新兴和再次新兴病原体和生物威胁剂存在的新抗原决定部位。(b)治疗本发明的方法通过筛选从这些疾病恢复的个体可以鉴定病毒抗原的T细胞抗原决定部位。因此，可以制得对抗急性致命感染的基于肽的新疫苗。
器官移植。器官移植的排异通常是由对抗移植器官或在移植对宿主疾病的情况中(GVHD)对抗接收者的显性1-型应答引起的超免疫应答。调节功能在产生耐受性和长期移植接受中起关键作用。因此器官移植范围内的T-调节激活或显性1-型应答的选择性消除是有利的。(a)诊断本发明的方法适用于测定免疫反应的模式，其可以是急性GVHD和最特别是慢性GVHD产生的预示。(b)预后在移植之前或出现之后，捐献者或接收者样品中存在的显性1-型抗原决定部位可以是移植排斥的预后指示，本发明适用于测定显性1-型抗原决定部位的存在。还可以在治疗后通过本发明鉴定致耐受性T-调节刺激抗原决定部位并可以作为移植耐受性的预后指示。(c)治疗通过本发明鉴定的抗原决定部位可以形成基于肽的新疫苗，其可以将免疫应答转换成T-调节，或选择性地消除或抑制不当1-型细胞。
动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是常见的动脉疾病。脂肪、胆固醇和其他物质累积在动脉壁中并形成“粉瘤”或斑点。通常认识到慢性炎症细胞介导的免疫应答涉及动脉粥样硬化的发病机制。报道了动脉粥样硬化斑中的T-细胞激活是由斑产生的抗原如氧化的LDL(oxLDL)启动的。其他报道了人颈动脉粥样硬化斑中的衣原体肺炎-反应性T细胞的检测。(a)诊断本发明的方法适用于免疫反应性早期模式的鉴定。(b)预后本发明的方法允许定量测量涉及动脉粥样硬化发病机制的抗原如oxLDL或交叉反应性衣原体抗原的抗原决定部位，其由T细胞识别。(c)治疗本发明的方法适用于测定特异性的抗原决定部位，其可以用于产生基于肽的新疫苗来防止动脉粥样硬化的进展。
可以理解以下给出的实施例是本发明的表示并且是本发明的说明，但并不解释为以任何方式来限制本发明的范围。在本发明的方法特征中可以形成改变而没有脱离本发明的范围。本领域技术人员显而易见的是也可以使用可替换的方法而没有脱离本发明的范围。特别地，实施例中呈现的测量细胞因子产生的方法只是代表性的且本领域中用于测量细胞因子浓度的任何已知方法可用于本发明中。
实施例1早在48小时时通过用病毒肽简单孵育正常捐献者的PBMC细胞来检测抗原特异性免疫应答。为了检测通过本发明的方法使用PBMC和单种肽是否可以检测抗原特异性免疫应答，用HLA-A0201限制肽孵育HLA-A0201+正常志愿者的新鲜制备PBMC。通过其他方法已知捐献者具有Flu-MP-特异性CD8+T细胞但没有Mage 3-特异性CD8+细胞(数据未显示)。
通过Ficoll-Paque密度梯度离心从HLA-A0201+健康志愿者新鲜吸出的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC以1×106细胞/ml的浓度重悬浮于补充10％热灭活的人AB血清(Gemini Bio-Products)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(200UI/ml)、链霉素(200μg/ml)、丙酮酸钠(1mM)、1％非必需氨基酸、2-β-巯基乙醇(50μM，Sigma)和HEPES pH7.4(25mM，Gibco)的RPMI培养基(完全培养基CM)中。将2×105细胞/孔重复三份接种于圆底96孔平板中，并用1μl HLA-A0201限制肽(储备浓度1mg/ml，培养浓度10μg/ml)；Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV，MuitiPeptide System，San Diego，CA)，或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)孵育。在48小时后收集培养物上清液，并用Luminex来测量细胞因子和趋化因子。
用F1u-MP刺激的PBMC在48小时内诱导了大量的细胞因子，包括IFN-γ(数据未显示)。结果证明正常捐献者的新鲜PBMC响应Flu-MP肽并产生大量的细胞因子且早在48小时时可以通过用肽简单孵育PBMC来检测抗原特异性免疫响应。
实施例2为了PBMC中肽反应性细胞宽泛的所有组成部分，早在48小时时检测抗原特异性免疫应答，包括肿瘤抗原。病毒性抗原通常能够诱导比肿瘤抗原更强烈的恢复应答。为了测定通过本发明的方法是否可以检测肿瘤抗原特异性免疫应答，用冷的PBS融化液氮中低温保存的来自2名接受至少8次DC疫苗(自体CD34+造血前体细胞产生的DC，装载4个黑素瘤相关抗原的HLA-A2肽)注射的黑素瘤患者的PBMC。用PBS第二次洗涤后，将PBMC在CM中37℃孵育15分钟，并用尼龙细胞滤器除去细胞碎片。用CM将细胞再次洗涤，并以1×106/ml重悬浮于CM中。然后，以2×105细胞/孔重复三份接种于圆底96-孔平板中，并用各自1μl的HLA-A0201限制肽(储备浓度1mg/ml，培养浓度10μg/ml)；Flu-MP 58-66；CMV PP65(NLVPMVATV，Biosynthesis，Lewisville，TX)，MAGE-3 271-279，MART-1 27-35(AAGIGILTV)，gp100g209-2M(IMDQVPFSV)，酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV，NCI)，或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)来孵育。48小时后收集培养物上清液，并用Luminex技术测量所产生的细胞因子。此外，根据制造商(Mabtech)的实验方案进行ELISPOT测试来检测产生抗原特异性IFN-γ的T细胞。简而言之，在10μg/ml肽的存在或不存在下，将PBMC(2×105细胞/孔)加入预先覆盖10μg/ml主要抗-IFN-γ单克隆抗体(Mabtech，Stockholm，Sweden)的平板中。
患者1，通过直接IFN-γELISPOT已知对于Flu-MP和CMV具有CD8+T细胞(数据未显示)，证明了响应Flu-MP或CMV肽的IL-1α，IFN-γ，TNF-α和IP-10的诱导，但是不具有4个黑素瘤肽(数据未显示)。这表明黑素瘤肽没有非特异性地调节免疫应答。患者2，证明其具有MART-1特异性CD8+T细胞以及Flu-MP或CMV(数据未显示)，呈现了响应MART-1肽的IL-1α轻微提高和IP-10显著提高，但不具有其他黑素瘤肽(数据未显示)。结果表明正常捐献者的新鲜PBMC响应Flu-MP肽并产生IL-1α和IP-10。两个不同的正常捐献者之间的细胞因子/趋化因子产生特征是不同的，表明使用EPIMAX测试可以鉴定识别相同Flu-MP肽的不同类型的CD8+T细胞。基于响应IFN可以上调IP-10的事实，DC-T相互作用可以诱导T细胞产生IFN-γ，其导致从DC产生IP-10。因此，IP-10对于1-型T细胞应答是有用的标记物。
实施例3响应接种装载肽的CD34-DC的黑素瘤患者中的Mart-1肽的IP-10诱导依赖于IFN-γ。为了检测IP-10产生是否依赖于IFN-γ，在阻断抗-IFN-γR1 mAb存在下用MART-1肽#6(10μM)或Flu-MP HLA-A2肽(10μg/ml)刺激从黑素瘤患者获得的PBMC，该个体接种自体装载HLA-A2黑素瘤肽的CD34-DC。通过IFN-γR1的阻断完全消除了IP-10产生(数据未显示)。因此，IP-10产生依赖于IFN-γ产生，表明IP-10是IFN-γ产生的替代标记物。
将融化的液氮中低温保存的来自2名接受至少8次DC疫苗(自体CD34+造血前体细胞产生的DC，装载四个(4)黑素瘤相关抗原的HLA-A2肽)注射的黑素瘤患者的PBMC重复三份播种于圆底96孔平板中，并用各自10μg/ml的HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66，CMV PP65(NLVPMVATV)，MAGE-3271-279(FLWGPRALV)，MART-127-35(AAGIGILTV)，gp100g209-2M(IMDQVPFSV)，酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV)，或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)孵育；并在48h后收集培养物上清液并使用Luminex技术定量评价细胞因子和趋化因子的存在。为了检测产生抗原特异性IFN-γ的T细胞进行ELISPOT测试，其中在10μg/ml肽的存在或不存在下，将PBMC(2×105细胞/孔)加入预先覆盖10μg/ml主要抗IFN-γ单克隆抗体的平板中。
结果证明通过本发明的方法鉴定了PBMC中肽反应性细胞的宽泛清单。
实施例4本发明的方法允许鉴定T细胞识别的特异性肽序列。为了测定抗原决定部位是否由T细胞识别和使用本发明的方法是否可以鉴定该抗原决定部位诱导的免疫应答，用接受CD34-DC疫苗的HLA-A0201+黑素瘤患者获得的PBMC孵育5簇由4-7个来自15-merMART-1肽文库的肽构成的肽。设计具有四个(4)氨基酸偏移的15-mer重叠肽来覆盖整个MART-1(Mimotopes，San Diego，CA)的氨基酸序列。每个肽用2mM的50％乙腈来重建，并保存于-80℃直至使用。从接受DC疫苗的黑素瘤患者获得PBMC。将4-6个成簇的肽(每个肽1μl)，或单个肽(1μl)重复三份接种于96孔平板中，并在室温干燥。然后，将200μl CM中的2×105个PBMC加入每个孔中并在潮湿的5％CO2培养箱中37℃孵育48小时。用Luminex测量培养物上清液中的细胞因子或趋化因子水平。
发现在簇#1培养物中检测到显著较高含量的IP-10。接着用MART-1文库的单个肽制得PBMC的第二个培养物来鉴定簇#1内负责的肽。肽#6诱导显著的IP-10，表明这种肽是黑素瘤患者T细胞的抗原决定部位。令人感兴趣的，这种肽含有HLA-A0201显性抗原决定部位序列(MART-127-35；AAGIGILTV)。从接受DC疫苗的黑素瘤患者获得PBMC。该个体是HLA-A*0201pos，并使用四聚物结合测试表明具有识别HLA-A*0201-限制的显性抗原决定部位(MART-126-35)的MART-1特异性CD8+T细胞(数据未显示)。用这种HLA-A*0201显性MART-1肽来培养PBMC时，显著诱导了两种细胞因子，IL-1α和IP-10，但注意到没有IFN-γ的上调(数据未显示)。已知IP-10响应I型或II型干扰素而由许多细胞类型分泌，我们猜测IP-10响应MART-1特异性T细胞分泌的IFN-γ而产生。因此，通过阻断IFN-γ的功能完全阻止了IP-10产生(图4C)。结果表明IP-10响应接种装载肽的CD34-DC的黑素瘤患者的MART-1肽的诱导依赖于IFN-γ。
为了检测该个体的PBMC是否含有识别这种显性抗原决定部位的CD8+T细胞，用装载MART-127-35或其他HLA-0201肽(例如，Mage-3，酪氨酸酶和Flu-MP)的自体单核细胞衍生的DC来培养PBMC，并用特定的四聚物来检测抗原特异性CD8+T细胞群的诱导。如图4B-4E中所示的，在7天内MART-1特异性CD8+T细胞容易扩大，表明该个体对于MART-1具有记忆或效应CD8+T细胞，且根据本发明的方法用MART-1文库来识别这种CD8+T细胞群。
实施例5本发明的方法允许鉴定各种类型的免疫应答。本发明的方法允许同时鉴定用于免疫应答的抗原决定部位以及所诱导的应答类型。根据实施例4中给出的一般方法，用5-6个MART-1或NY-ESO1肽文库的肽簇孵育来自接种疫苗前或接种疫苗后的黑素瘤患者的PBMC 48小时(MART-15个簇；NY-ESO18个簇)。显示典型的结果来表示对应于不同免疫应答的细胞因子特征的信号(数据未显示)。展示每种免疫应答模式的肽簇以灰色条显示。在1-型应答中，抑制了IL-10产生，而诱导了IP-10。相反，在T-调节应答中，诱导了更多的IL-10，由于1-型应答的抑制而阻止了IP-10产生。在2-型应答中检测到IL-13和嗜酸性粒细胞活化趋化因子，而没有影响IP-10的含量。因此，本发明早在48小时内鉴定了由任一种抗原诱导的各种类型的免疫应答。用HLA-A0201限制的Flu-MP58-66，Mage3271-279或稀释剂重复三份来刺激HLA-A0201+捐献者的2×105个新鲜PBMC。用基于珠子的多元细胞因子测试来测量培养物上清液中的细胞因子。从重复三份的数据显示平均±SD。该结果显示了在肽刺激48h时，IL-1α和IP-10的肽特异性产生达到平台期。
实施例6本发明的方法允许鉴定由非T-细胞诱导的其他类型的免疫应答。已知15-mer肽由其他免疫细胞如B细胞，NK细胞或NK-T细胞来识别，且一些肽结合未鉴定的受体，导致免疫应答的调节。本发明的另一个实施例用于鉴定由非T-细胞诱导的免疫应答，使用在MNC-非限制中呈现调节信号的肽。用survivin文库的肽簇孵育黑素瘤患者的PBMC。如图6A-6H中所示的，survivin簇#3的肽#15诱导了细胞因子产生的强烈调节模式。即，强烈诱导了IL-10和IL-1β，且作为1-型应答标记的IL-1α和IP-10得到严重阻止。
为了测定这种应答是否限于特定类型的MHC-分子，用survivin肽#15孵育取自5名正常健康志愿者新鲜血液的PBMC 48小时，并根据本发明的方法来测量细胞因子浓度。肽#15抑制了全部五名正常志愿者的IP-10产生(数据未显示)，表明这种肽不限于特定的HLA亚型。表明survivin肽#15具有改变免疫应答的强烈能力，因为在肽#15存在下用活的流感病毒刺激黑素瘤患者的PBMC呈现了IP-10诱导的强烈阻止，显然是由于IL-10产生(数据未显示)。此外，肽#15部分地抑制了TSST-1诱导的T-细胞增殖(数据未显示)。耗尽研究表明CD56+细胞引起IL-10产生和IP-10阻断(数据未显示)，表明survivin肽#15作用于NK，NK-T细胞或γ/δT细胞群。还表明肽#15维持CD3-CD56+NK细胞的存活(数据未显示)。因此，本发明的方法可用于鉴定任何种类由特定类型肽诱导的免疫调节。
实施例7本发明的方法可用于接种疫苗过程中黑素瘤患者的免疫调节。将细胞以2×105每孔接种于编号的，预先处理的96孔阶段-I培养平板中。阶段-I培养平板含有肿瘤抗原GP100，MAGE3，NY-ESO和MART-1各自的5个肽簇，重复四份，使用每个簇12个重叠肽，每个15个氨基酸长，以及KLH和杀灭的Colo细胞对照。预先制备平板来最大化通量和最小化测试与测试之间的变化。将细胞在37℃孵育5天。平行地，在装载全谱抗原肽簇的自体成熟DC存在下，将指定用于再次刺激的细胞孵育7天，PBMC与DC的比例为30∶1。在第七天，将这些细胞大范围洗涤并转移至阶段-I培养平板24小时。孵育后，将这些再次刺激的细胞沉淀，并将各自150微升的上清液以96-孔形式转移至装有TECAN Genesis RPS机械样品处理器的全自动化Luminex100细胞因子多元工作台中(TECAN)。
可以结合条形码识别和随机微平板分析来使用能够运行独立样品处理的工作台。将重复两份的上清液快速筛选INF-γ，TNF-α，IL-13，IL-10和颗粒酶-B的存在，使用预先制备的且使之生效的多元珠子和试剂的总混合物。将剩余的上清液样品冷冻用于之后的分析。预期共同培养的DC可以在阶段-I平板的24小时孵育过程中引起背景细胞因子产生。因此，将成熟DC的上清液用作细胞因子多元分析中的对照。将最初刺激测试的细胞沉淀并重悬浮于含有H3胸腺嘧啶核苷的培养基中并在37℃孵育。5天后，通过胸腺嘧啶核苷结合测试重复四份测定抗原特异性增殖。将最初刺激测试的上清液冷冻于-80℃用于稍后的分析。筛选那些再次刺激后细胞因子产生阳性的肽簇在最初刺激过程中的细胞因子产生。
将通过阶段-I细胞因子多元测试证明反应阳性的肿瘤抗原簇分解成它们的组成部分，用于阶段-II培养平板上的抗原肽鉴定。阶段-II培养平板包括孔-条带，孔-条带含有各自簇的12个成份肽，重复两份。预先制备阶段-II肽孔-条带并置于条形码标记的框中。将融化的PBMC在37℃用装载阶段-I鉴定的特定肽簇的自体成熟DC孵育7天，洗涤并以2×105每孔转移至阶段-II培养平板24小时。孵育后，将细胞沉淀，并将150微升上清液转移至Luminex工作台用于分析。对于给定肽条带的阶段-II的多元筛选包括在阶段-I分析过程中响应其亲本簇产生的细胞因子和趋化因子。成熟DC单独作用阶段-II分析的背景对照。一旦给定簇的抗原肽得到鉴定，将它们用于分离抗原特异性效应物群。
阶段III监控包括特异性效应细胞的鉴定和表征肽。该程序中，融化2×106个PBMC并用载有阶段-II中各自分离的抗原肽的自体成熟DC在37℃孵育7天。然后将细胞洗涤并接受24小时的再次刺激。再次刺激后，将细胞进行布雷菲德菌素A处理，固定，渗透并用一组抗体染色来表征表面标记和胞内细胞因子表达。使用能够9色分析和分选的FACSaria流式细胞计数器/分选器(Becton-Dickinson)通过多色流式细胞计数分析来完成抗原特异性效应群的鉴定。通过Cr51释放测试来体外测定刺激的T细胞的CTL功能，使用装载肽的、EBV转化的自体B-LCL作为目标。鉴定后，用装载自体成熟抗原肽的DC在IL-2和IL-6存在下将抗原特异性效应细胞群培养7天来亚克隆，接着在IL-2和IL-7存在下用装载肽的成熟DC每周再刺激。一旦建立克隆的效应细胞群，进行基因表达模式和细胞毒性功能的大范围表征。
实施例8本发明的方法允许选择癌症中的疫苗抗原决定部位。使用该技术对特异性肿瘤相关抗原决定部位反应(1型，2-型或T-调节)的检测和表征可以作为鉴定和表征用于疫苗接种时引发所需类型免疫应答的肿瘤相关蛋白的抗原决定部位的工具。
为了选择疫苗抗原决定部位，将个体的PBMC暴露于表示肿瘤相关蛋白的抗原决定部位的系列肽文库。48小时培养后，收集上清液，并根据本发明的教导来分析所分泌的细胞因子。鉴定诱导1-型T细胞应答的肽簇，例如，产生IFN-γ但不产生IL-10(T-调节应答)或2-型细胞因子。接下来的步骤中，可以进一步选择对应于给定个体HLA型的肽并用于该特定个体的疫苗接种。因此，使用本发明可以测定用于特定的疫苗接种以在个体中产生所需免疫应答类型的药剂。
实施例9本发明的方法允许选择传染病中的疫苗抗原决定部位。已知许多目前可用的对抗微生物剂的疫苗没有给予保护性免疫力，例如登革热病毒疫苗。保护性免疫力的缺乏可能是由于不当免疫应答的诱导而引起的，例如，一些目前的疫苗抗原决定部位可以诱导2-型，或调节T细胞而不是1-型T细胞，因此偏移和/或抑制免疫应答朝向非保护性。该实施例中，本发明的技术可以作为鉴定和表征用于接种疫苗时引发所需类型免疫应答的微生物相关抗原的抗原决定部位的工具。
为了选择疫苗抗原决定部位，将个体的PBMC暴露于表示来自微生物例如登革热病毒的抗原决定部位的系列肽文库。48小时培养后，收集上清液，并根据本发明的教导分析所分泌的细胞因子。鉴定诱导1-型T细胞应答的肽簇，例如，产生IFN-γ但不产生IL-10(T-调节应答)或2-型细胞因子。接下来的步骤中，可以进一步选择并用于疫苗接种的肽。因此，本发明的方法可以选择允许在接种疫苗时诱导保护性抗微生物免疫性的抗原决定部位。
图1是描绘了根据本发明评价的正常捐献者免疫应答的图，其中从HLA-A0201+健康志愿者新鲜吸出的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，以2×105细胞/孔重复三份接种于圆底96孔平板中，并用1μl HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV)，或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)来孵育；并在48h后收集培养物上清液并使用Luminex技术定量评价细胞因子和趋化因子的存在。结果表明正常捐献者的新鲜PBMC响应Flu-MP肽并产生大量的细胞因子。
图2是描绘了根据本发明的对正常捐献者中HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)的免疫应答的另一个实施例。从另一名HLA-A0201+健康志愿者新鲜吸出的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，以5×105细胞/孔重复三份接种于圆底96孔平板中，并用10μg/ml HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MART-127-35(AAGIGILTV)，或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)孵育；并在48h后收集培养物上清液并使用Luminex技术来定量评价细胞因子和趋化因子的存在。结果表明正常捐献者的新鲜PBMC响应Flu-MP肽并产生IL-1α和IP-10。两个不同正常捐献者之间的细胞因子/趋化因子特征是不同的，表明用EPIMAX测试可以鉴定识别相同Flu-MP肽的不同类型的CD8+T细胞。
图3A-3D是描绘了根据本发明评价的2名黑素瘤患者免疫应答的图。图3A和3C中，各自对应于患者1和2，将融化的低温保存于液氮中的来自2名接受至少8次DC疫苗(自体CD34+造血前体细胞衍生的装载四个(4)黑素瘤相关抗原的HLA-A2肽的DC)注射的黑素瘤患者的PBMC重复三份接种于圆底96-孔平板中，并用各自10μg/ml的HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66，CMV PP65(NLVPMVATV)，MAGE-3271-279(FLWGPRALV)，MART-127-35(AAGIGILTV)，gp100g209-2M(IMDQVPFSV)，酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV)，或肽稀释剂(H2O中的5％DMSO)孵育；并在48h后收集培养物上清液并使用Luminex技术来定量评价细胞因子和趋化因子的存在。在各自对应于患者1和2的图3B和3D中，为了检测产生抗原特异性IFN-γ的T细胞，进行ELISPOT测试，其中在10μg/ml肽的存在或不存在下，将PBMC(2×105细胞/孔)加入预先覆盖10μg/ml主要抗IFN-γ单克隆抗体的平板中。结果表明通过本发明的方法鉴定了宽的PBMC中肽反应性细胞的所有组成部分。
图4A-4C是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。对于图4A，从接受DC疫苗的HLA-A*0201pos黑素瘤患者获得PBMC，并用装载HLA-A*0201-限制的显性MART-1肽(MART-126-35)的自体DC来刺激。使用四聚物测试表明个体具有识别HLA-A*0201-限制的显性抗原决定部位(MART-126-35)的MART-1特异性CD8+T细胞(图4A)。用该HLA-A*0201显性MART-1肽直接培养PBMC时，特异性地诱导了两种细胞因子，IL-1α和IP-10，但是注意到没有IFN-γ的上调(图4B)。已知由许多细胞类型响应I型或II型干扰素而产生IP-10，我们推测IP-10响应MART-1特异性T细胞分泌的IFN-γ而产生。因此，通过使用IFN-γR阻断mAb来阻断IFN-γ的功能而完全阻止了IP-10的产生(图4C)。结果表明响应接种装载肽的CD34-DC的黑素瘤患者中的MART-1肽的IP-10诱导依赖于IFN-γ。
图5是描绘了根据本发明评价的正常捐献者免疫应答动力学的图。用HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66，或Mage3271-279，或稀释剂重复三份刺激HLA-A0201*捐献者的2×105个新鲜PBMC所示的时间段。用基于珠子的多元细胞因子测试来测量培养物上清液中的细胞因子。从重复三份的数据中显示平均SD。这些结果表明在肽刺激48h时，EPIMAX测试中的IL-1a和IP-10的肽特异性产生到达平台期。
图6描绘了根据本发明的抗原决定部位聚焦的略图。首先，将编码抗原蛋白的15-mer重叠肽文库重复两份分成肽簇(5-10个肽/簇)。首先用每个簇肽刺激5×105PBMC(簇分析)。用基于珠子的多元细胞因子测试来测量培养物上清液中的多种细胞因子，并测定了“碰撞(hit)”簇。第二个培养物中，抗原决定部位聚焦，用“碰撞”簇的单个肽培养PBMC 48h，随后用多重细胞因子分析来测定抗原肽。
图7是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由特异性T细胞识别的抗原决定部位。从接受DC疫苗的黑素瘤患者获得PBMC。该个体是HLA-A*0201pos，并使用四聚物结合测试表明具有识别HLA-A*0201-限制性显性抗原决定部位(MART-126-35)的MART-1特异性CD8+T细胞(图4A)。将覆盖整个MART-1氨基酸序列的具有4个氨基酸偏移的15-mer重叠肽以4-6个成簇的肽(10μM每个肽)或单个肽(10μM)重复三份接种于96-孔平板中；并将200μl CM中的2×105细胞PBMC加入每个孔中并在潮湿的5％CO2培养箱中37℃孵育48小时；并用Luminex测量培养物上清液中的化学因子或趋化因子水平。如图7中所示的，MART-1#6肽诱导了从接种疫苗的黑素瘤患者获得的PBMC中IP-10的强烈产生。MART-1肽#6含有10-mer HLA-A2显性抗原决定部位，如图4A中所绘的。因此，本发明的方法可以鉴定肽特异性的T细胞应答。
图8是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。从接受DC疫苗的黑素瘤患者获得PBMC。该个体是HLA-A*0201pos，且使用四聚物结合测试表明具有识别HLA-A*0201限制性显性抗原决定部位(MART-126-35)的MART-1特异性CD8+T细胞(图4A)。在阻断IFNγR mAb(20μg/m1)或对照mAb存在下，用A2-MART-1肽或15-mer MART-1肽#6刺激PBMC 48h。将A2-HIVpol肽和15-merMART-1肽#15用作对照肽。显示了培养物上清液中的IL-1a和IP-10水平。该结果表明了IL-1a和IP-10的产生都依赖于肽特异性T细胞的IFN-γ产生，证明了IL-1a和IP-10是1型T细胞应答的替代标记，即Th1和Tc1细胞。
图9是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。用编码黑素瘤抗原的重叠肽簇或单个肽刺激从黑素瘤患者获得的PBMC48h。用Luminex测量培养48小时的培养物上清液中的细胞因子/趋化因子水平。该结果表明抗原决定部位聚焦的概念可以应用于本发明方法中的任何抗原和任何细胞因子。
图10描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用编码MART-1(黑素瘤分化抗原)的重叠肽簇或单个肽来刺激从接受DC疫苗的黑素瘤患者获得的PBMC。显示了培养48h时培养物上清液中的IL-1a和IP-10水平。使用簇分析(上图)，簇#2和#3诱导了IL-1a和IP-10的上调。使用抗原决定部位聚焦(下图)，簇#2的肽#6和簇#3的肽#13鉴定为特异性T细胞的抗原决定部位。该结果表明本发明的方法可以鉴定能够产生IFNγ的特异性T细胞的抗原决定部位。
图11描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用白细胞清除术从图10相同的个体获得PBMC，在冻存管中制得等份试样，并保存于液氮中直至使用。用MART-1 15-mer肽#6，肽#13或稀释剂刺激融化的PBMC。将该实验分开重复三次。显示了培养48h时培养物上清液中的IL-1a和IP-10水平。3个实验中的三个都表明了用肽#6或#13刺激时IL-1a和IP-10的上调，证明了该EPIMAX测试的高度再现性。
图12A是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。用单个15-mer MART-1肽或稀释剂刺激从DC接种前和8次DC接种后的黑素瘤患者(与图10的相同)获得的PBMC。显示了培养48h时培养物上清液中的IL-1a和IP-10水平。尽管后-PBMC显示了响应鉴定的两种(2)15-mer肽(肽#6和#13)的IL-1a和IP-10上调，前-PBMC对于响应肽#13的IL-1a和IP-10上调失败。前-PBMC响应肽#6的IL-1a和IP-10产生比后-PBMC的低。这些结果表明DC接种诱导了肽#13特异性T细胞应答并提高了肽#6-特异性T细胞应答。为了检测这种假设，我们使用了一种不同的充分确定的方法，胞内细胞因子检测测试。在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素的存在下，用MART-1 15-mer单个肽刺激相同的PBMC 8h。细胞膜渗透后，用抗IFN-γ mAb将细胞染色并用流式细胞计数器来分析IFN-γ+群(图12B)。尽管在后-PBMC中约0.15％的CD8+T细胞响应肽#6或#13而产生IFN-g，在前-PBMC中没有检测到IFN-g产生。这些结果证明EPIMAX可以用于监控癌症个体中的抗原特异性T细胞，并表明通过检测EPIMAX中的细胞因子/趋化因子的调节规模来预测每个特异性T细胞应答的规模。
图13描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。CFSE(56-羧基荧光素二醋酸丁二酰亚胺酯)是允许用流式细胞计数器鉴定细胞分裂数量的痕量染料。因为EPIMAX是非破坏性测试，我们将EPNMAX结合CFSE技术来测定抗原特异性T细胞的增殖能力。证实CFSE染色没有改变EPIMAX中的细胞因子产生。首先用1μMCFSE将从相同黑素瘤患者(与图10的相同)获得的PBMC染色，并用编码MART-1的重叠肽簇或单个肽刺激。在培养的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC将细胞染色，并分析响应肽刺激的T细胞增殖。图显示了CD8+T细胞增殖的分析。MART-1簇#2和#3，以及肽#6和#13诱导了一些CD8+T细胞群中CFSE强度的稀释，证明肽刺激诱导了抗原特异性CD8+T细胞的增殖。该结果表明结合其他方法可以获得抗原特异性T细胞的更多表型和/或功能表证。
图14描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。首先用1μM CFSE将从相同黑素瘤患者(与图10中的相同)获得的PBMC染色，用编码MART-1的单个肽重复三份来刺激。在培养的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC将细胞染色，并分析响应肽刺激的T细胞增殖。图显示了CD8+T细胞群内CFSE稀释的CD8+T细胞群的％。MART-1肽#6和#13诱导了一些CD8+T细胞群中CFSE强度的稀释，证明肽刺激诱导了抗原特异性CD8+T细胞的增殖。
图15描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。CD8+T细胞识别抗原递呈细胞上表达的MHC-I类分子范围内的8-10mer肽。为了检测鉴定的CD8+T细胞的准确抗原决定部位，用15mer MART-1肽#13内的1个氨基酸延迟来产生10mer重叠肽，并用于刺激相同个体的PBMC。显示了48h时培养物上清液中的IL-1a和IP-10水平，和培养8天时的CFSE稀释试验。这些结果证明MART-154-62是CD8+T细胞的抗原决定部位，其允许IFN-γ的产生和特异性CD8+T细胞的增殖。因此，EPIMAX允许鉴定CD8+T细胞的准确抗原决定部位。
图16A-D描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用编码NY-ESO1(在大部分黑素瘤细胞中广泛表达的睾丸癌抗原)的重叠肽簇或单个肽刺激从HLA-A2neg黑素瘤患者获得的PBMC。簇#5内的NY-ESO1肽#24在48h时诱导了IP-10的上调(图16A)。这些结果表明NY-ESO193-107是作为抗原决定部位由特异性T细胞识别的。为了检测是哪个T细胞子集识别该抗原决定部位，在抗MHC I类阻断mAb(W6/32)或同型对照mAb存在下，用NY-ESO1肽#24刺激个体的PBMC。如图16B中所示的，通过W6/32完全阻止了响应肽#24的IP-10产生，表明IP-10的产生依赖于MHC I类分子，因此CD8+T细胞识别肽#24。
为了鉴定CD8+T细胞的准确抗原决定部位，产生肽#24内的9mer重叠肽，并用于刺激个体的PBMC。如图16C所示的，NY-ESO194-102诱导了强烈的IP-10上调，表明这是CD8+T细胞的抗原决定部位。
为了鉴定HLA-限制性组成部分，用NY-ESO1肽#24脉冲的自体单核细胞衍生的DC在IL-2(10IU/ml)存在下刺激PBMC。在培养的第9天，用编码各种HLA的表达质粒转化的缺乏MHC I类分子的LCL再次刺激细胞，用NY-ESO194-102肽脉冲或未脉冲。用ELISA测量8h刺激过程中的IFN-γ分泌。如图16D所示的，用NY-ESO194-102肽脉冲的HLA-B*3501转化子诱导了T细胞的IFN-γ产生，表明这种新的肽是通过HLA-B*3501分子递呈的，这些结果表明EPIMAX允许鉴定HLA-A2neg个体中CD8+T细胞的新抗原决定部位，结合其他方法允许我们鉴定它们的HLA限制性组成部分。
图17描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用MART-1 15-mer肽#6和#13内的10mer重叠肽刺激从黑素瘤患者(与图10的相同)获得的PBMC 48h。图17显示了48小时时培养物上清液中的IP-10水平。MART-126-35(已知抗原决定部位)和MART-153-62(新抗原决定部位)是抗原决定部位。
图18描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用MART-1 15-mer肽#6内的10mer重叠肽刺激从两名HLA-A2neg黑素瘤患者获得的PBMC 48小时。显示了48小时时培养物上清液中的IP-10水平。MART-126-35(已知抗原决定部位)是两名个体的抗原决定部位。已知该抗原决定部位限于HLA-A2。因为这些个体是HLA-A2neg，且这两名个体之间的HLA-I类亚型完全不同，通过至少三种不同的MHC I类分子来递呈该抗原决定部位。这是用EPIMAX鉴定CD8+T细胞的抗原决定部位的另一个实例。
图19描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用#6至#15的单独MART-1 15-mer肽重复三份刺激从黑素瘤患者(与图10的相同)获得的PBMC 48h。显示了48小时时培养物上清液中的IL-2水平。MART-1肽#10和#11诱导了IL-2的上调。该结果证明了用EPIMAX鉴定抗原决定部位的另一个实例。
图20描绘了用图19中所示的鉴定的15-mer肽刺激时CD4+T细胞的IL-2产生。在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素存在下用MART-1 15-mer肽#10刺激相同个体的PBMC 8小时。通过特定mAb的染色来分析IL-2的产生。该图证明了CD4+T细胞群响应MART-1肽#10而产生IL-2。这些结果表明EPIMAX还可以鉴定CD4+T细胞的抗原决定部位。
图21A-B描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。首先用1μM CFSE将从相同黑素瘤患者(与图10的相同)获得的PBMC染色，并用编码MART-1的单个肽重复三份来刺激。在培养的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC将细胞染色，并分析响应肽刺激的T细胞增殖。图21A显示了CD4+T细胞群内CFSE稀释的CD4+T细胞群的％。MART-1肽#10和#11比没有肽诱导了更多CFSE稀释的CD4+T细胞群，证明了这些肽诱导了抗原特异性CD4+T细胞的增殖。图21B描绘了CD4+T细胞群内响应各个MART-1 15-mer肽的CFSE稀释的CD4+T细胞群。MART-1肽#10和#11诱导了比其他15-mer肽显著多的CD4+T细胞增殖。这些结果强烈地表明了EPIMAX允许鉴定CD4+T细胞的抗原决定部位，并通过结合CFSE技术允许测定特异性CD4+T细胞的增殖能力。
图22 A-C描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。首先用1μM CFSE将从接受DC接种的HLA-A2neg黑素瘤患者获得的PBMC染色，并用编码NY-ESO1的肽簇刺激。在培养的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC将细胞染色，并分析响应肽刺激的T细胞增殖，用流式细胞计数器基于CFSE稀释来分析。图22A显示了CD4+T细胞群内CFSE稀释的CD4+T细胞群的百分比(％)。NY-ESO1簇#8比其他簇诱导了更多的CFSE稀释的CD4+T细胞群，证明了这些肽诱导了抗原特异性CD4+T细胞的增殖。图22B描绘了培养48小时时培养物上清液中的IL-2水平。在含有NY-ESO1簇#8的培养物中产生了IL-2。为了鉴定CD4+T细胞的抗原决定部位，用NY-ESO1簇#8内的单个肽刺激CFSE染色的PBMC。在第8天使用流式细胞计数器基于CFSE稀释来分析CD4+T细胞增殖。如图22C所示的，NY-ESO1149-167和NY-ESO1165-180诱导了更多的CD4+T细胞增殖，证明了这些是抗原决定部位。该结果表明鉴定黑素瘤抗原中CD4+T细胞抗原决定部位的另一个实例。
图23描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用#6至#15的单个MART-1 15-mer肽重复三份刺激从相同个体(与图10的相同)获得的PBMC。显示了48小时时培养物上清液中的IL-5水平。MART-1肽#10和#11诱导了IL-5的上调。该结果证明了用EPIMAX鉴定抗原决定部位的另一个实例。
图24描绘了用图23所示的鉴定的15-mer肽刺激时CD4+T细胞的IL-5产生。在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素的存在下，用MART-115-mer肽#11刺激相同个体的PBMC 8小时。通过特定的mAb染色来分析IL-5的产生。该图证明了CD4+T细胞群响应MART-1肽#11而产生IL-5。这些结果表明EPIMAX可以鉴定抗原决定部位以及特异性CD4+T细胞产生的细胞因子类型。
图25描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者的免疫应答。用TRP-1簇#25或gp100簇#15的单个15-mer肽刺激从两名黑素瘤患者获得的CFSE染色的PBMC。在48h时测量培养物上清液中的细胞因子，并在培养的第8天基于CFSE稀释测试来分析T细胞的增殖。结果表明TRP-1肽#124和gp100肽#152是CD4+T细胞的抗原决定部位，两个都是CD4+T细胞的新抗原决定部位。肽刺激诱导了各种效应物细胞因子产生，如IL-2，IL-5，IL-13和IP-10(IFN-γ)，和特异性CD4+T细胞的增殖。这些结果表明鉴定黑素瘤抗原中CD4+T细胞抗原决定部位的另一个实例，并表明EPIMAX可以用于鉴定不同类型的T细胞应答。
图26描绘了根据本发明评价的三名黑素瘤患者的免疫应答。EPIMAX允许鉴定不同的T细胞子集，如1型(Th1和Tc1)，2型(Th2和Tc2)细胞。用新鉴定的黑素瘤肽(15-mer)刺激从转移性黑素瘤患者获得的PBMC 48h，并用基于珠子的多元测试来测量培养上清液中的细胞因子。有色柱表示使用所示肽的细胞因子水平(下图)，和空心柱表示使用稀释剂的那些。显示了三种不同T细胞子集，1型，2型和IL-10型的代表性细胞因子产生。通过IL-1a和IP-10的上调来鉴定1型应答，而通过2型细胞因子如IL-4，IL-5和IL-13的上调而没有IP-10的上调来鉴定2型应答。将EPIMAX用于鉴定特征在于IL-10上调(IL-10型)的新T细胞应答。
图27描绘了使用EPIMAX方法鉴定的4个黑素瘤抗原，即gp100，MART-1，NY-ESO1和TRP-1内的CD4+和CD8+T细胞的新抗原决定部位的概述。通过用EPIMAX筛选13名个体的PBMC来鉴定这些新的抗原决定部位。
表1描述了用EPIMAX鉴定的CD8+T细胞的抗原决定部位的概述。显示了鉴定的15-mer肽及其氨基酸序列编号。一些15-mer肽用9-mer或10-mer重叠肽来集中，并显示于表中。

表2描绘了用EPIMAX鉴定的Th0，Th1和Th2细胞的抗原决定部位的概述。显示了鉴定的15-mer肽及其氨基酸序列编号。

表3描绘了用EPIMAX鉴定的IL-10型CD4+T细胞的抗原决定部位的概述。显示了鉴定的15-mer肽及其氨基酸序列编号。

图28是描绘了根据本发明评价的三名黑素瘤患者免疫应答的图。用MART-1，gp100，NY-ESO1和TRP-1重叠肽的转移性黑素瘤患者(13名个体)获得的PBMC的EPIMAX分析产生了16个诱导1型应答的肽，15个诱导0/2型应答的肽和9个诱导IL-10型的肽。在培养的第2天测量细胞因子。各自显示了各个T细胞子集中的IL-1α和IP-10水平。每个点表示用鉴定的单个肽刺激这些个体PBMC培养物的各个分开孔中的细胞因子水平。该结果清楚地表明了IL-1α和IP-10在1型应答中完全相关。
图29A-D是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。用编码NY-ESO1的肽簇或单个肽刺激从黑素瘤患者获得的PBMC。显示了培养48小时时培养物上清液中的IL-10水平(图29A)。NY-ESO1肽#39和#40是抗原决定部位。为了研究IL-10产生的来源，在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素存在下用肽#39刺激PBMC 8小时，并用IL-10特异性mAb染色。如图29B中所示的，约0.11％的CD4+T细胞响应NY-ESO1肽#39而产生了IL-10。该结果表明了EPIMAX允许在黑素瘤患者中产生IL-10的黑素瘤抗原特异性CD4+T细胞。接着，为了评价该产生IL-10的T细胞是否具有调节特性，将transwell中的肽#39或无关15-mer肽刺激的PBMC加入“第三方”MLR中来测试通过这些可溶性介质的释放对T细胞扩展的抑制。为了避免肽特异性T细胞应答的影响，MLR使用CFSE标记的CD4+T细胞和异源成熟DC，这两种细胞都来自健康志愿者。用NY-ESO1肽#39但没用对照肽刺激的个体PBMC显著抑制了MLR中的增殖(图29C，29D)。这些结果表明EPIMAX方法可以鉴定肿瘤抗原特异性调节T细胞。
图30是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。用编码NY-ESO1的单个肽刺激两个不同时间点即DC接种前和8次DC接种后的与图29A-D中相同黑素瘤患者获得的PBMC。显示了培养48h时培养物上清液中的细胞因子/趋化因子水平。该结果证明了在接种疫苗后IL-10型信号消失，表明在接种疫苗后CD4+T细胞产生IL-10的功能丢失。这些结果证明了用EPIMAX测试通过DC疫苗调节T细胞应答的另一个实例。
图31是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。我们已经在7名黑素瘤患者中鉴定了黑素瘤抗原中9个诱导IL-10型应答的不同抗原决定部位。用各个个体特异性鉴定的15-mer肽孵育从黑素瘤患者获得的PBMC 48h。该图显示了通过用鉴定的IL-10型肽孵育抑制了自发IP-10的产生。这是用EPIMAX鉴定产生IL-10的CD4+T细胞抑制功能的另一个证明。
图32是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。显示了用鉴定的诱导IL-10的15-mer肽的各个PBMC培养物中的IL-1β和IP-10水平。每个点表示用鉴定的唯一单个15-mer肽的PBMC培养物中各个分开孔中的细胞因子水平。该结果显示了在鉴定的IL-10型应答中IL-1β和IL-10相关，因此两种细胞因子在EPIMAX中是鉴定IL-10型细胞的良好标记。
图33是描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图。将从三名正常健康志愿者获得的新鲜PBMC分成3批。用编码流感病毒基质蛋白质(Flu-MP)的15-mer重叠肽簇刺激各批的PBMC，重复两份(2×105细胞/孔，每个肽10μM)，因此形成6褶样品。显示了培养48h时的IP-10水平。黑条和阴影表示没有用肽的培养物中的IP-10平均±3SD值。测定IP-10水平超过该背景的平均+3SD对响应肽簇诱导IP-10是阳性的。正常捐献者#1中，12个肽簇中的9个评价为阳性，高于6褶样品中的4个，表明该捐献者具有非常广泛的Flu-MP特异性T细胞所有组成部分。相反，正常捐献者#3，没有簇诱导IP-10的上调。EPIMAX允许鉴定对抗给定抗原蛋白的全部宽度T细胞应答。此外，该研究显示了EPIMAX是高度可再现的测试。
图34是根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图。显示了图33中所示相同研究中的IL-6和IP-10水平。惊人地，在正常捐献者#3中，没有鉴定出IP-10产生，但许多肽簇对于IL-6产生评分为阳性。该结果证明了显示在EPIMAX中不同系列细胞因子的测量可以鉴定不同T细胞子集的实例。
图35是根据本发明评价的正常健康捐献者免疫应答的图。显示了图33中所示研究中的IL-1a和IP-10水平。每个点表示用肽簇的PBMC培养物中各个分开孔中的细胞因子水平。在所有捐献者中，EPIMAX中的IL-1a和IP-10水平非常相关，证实了这些两个标记在1型应答中完全相关。
图36是描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图。将从捐献者#1获得的冷冻PBMC融化，并用编码Flu-MP的15-mer肽簇或单个肽刺激。显示了IL-1a和IP-10的水平。每个点表示用肽簇或单个肽的PBMC培养物中各个分开孔中的细胞因子水平。即使用冷冻的PBMC，IL-1a和IP-10的水平非常相关(P＜0.0001，r＝0.9121)，表明这两个标记可以用于鉴定EPIMAX中的1型应答，不管PBMC是新鲜或冷冻获得的。
图37是描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图。用编码Flu-MP的15-mer肽簇刺激从捐献者#1获得的新鲜或冷冻PBMC。显示了IL-1a和IP-10的水平。如图37中所示的，簇#6和#12都诱导了新鲜和冷冻PBMC中IL-1a和IP-10的上调。该研究证明了冷冻PBMC可以用于使用EPIMAX来监控抗原特异性T细胞应答。
图38A，38B是描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图。将从捐献者#1获得的冷冻PBMC融化并用编码Flu-MP的肽簇或单个肽在6-褶中刺激(2×105细胞/孔，10μM每个肽)。显示了培养48小时时的IP-10水平(图37A)。另一个研究中，用相同浓度的15-mer肽刺激较高数量的PBMC(2×106细胞/孔)，重复三份。如图37B中所示的，尽管在两个研究中，肽#58和#59启动了IP-10产生，样品和对照培养物之间的反差更高，其中EPIMAX中使用了更高的PBMC/孔。因此，每孔较高数量的PBMC有助于降低EPIMAX测试中的可变性和敏感性。鉴于PBMC中抗原特异性T细胞的低频率(通常105PBMC中1个)，似乎合理的是当少数细胞响应肽刺激时，用EPIMAX(或实际上任何种类的测试)不可以检测细胞应答。因此，常规EPIMAX测试中，我们使用5×105PBMC/孔。
图39A和39B是描绘了正常健康志愿者对抗EPIMAX测试中鉴定的肽的免疫应答的图。将PBMC以1×106细胞/ml重悬浮于CM中，并将1ml细胞悬浮液放入培养管中，并用Flu-MP文库的所示单个肽刺激7天。收集培养的PBMC并用所示肽脉冲的DC在莫能霉素的存在下再次刺激5h。细胞渗透后，用特异性mAb检测细胞质内的细胞因子。显示了CD3+CD4+T细胞群中产生细胞因子的细胞百分比(图39A)。用显性肽的刺激诱导了特异性CD4+T细胞的增殖。首先用1mMCFSE将捐献者的PBMC染色。将PBMC以1×106细胞/ml重悬浮于CM中，并将1ml细胞悬浮液放入培养管中，用Flu-MP文库的所示单个肽刺激6天。用抗CD3和CD4 mAb将刺激的细胞染色，并用流式细胞计数器基于CFSE稀释来分析CD4+T细胞增殖。显示了CD3+CD4+T细胞群中的CFSE-细胞百分比(图39B)。这些结果证明了EPIMAX允许鉴定功能Flu-MP特异性CD4+T细胞的抗原决定部位的证据。
图40是描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图。从图33中的捐献者#2获得PBMC。将冷冻的PBMC融化并用Flu-MP簇#11或簇#11内的单个15-mer肽刺激(5×105细胞/孔，20μM每个肽)。显示了培养48h时细胞因子的含量。这些结果表明肽#52和#53是Flu-MP特异性T细胞的抗原决定部位，显示了鉴定特异性CD4+T细胞的新抗原决定部位的另一个实例。
图41A，41B是描绘了正常健康个体对抗EPIMAX测试中鉴定的肽的免疫应答的图。用CFSE标记图40研究中所用的PBMC，并用Flu-Mp簇#11内的单个肽刺激。在培养第8天分析CFSE稀释的CD4+T细胞(图41A)。另一个研究中，在培养第6，7，8和10天分析CFSE-稀释的CD4+T细胞群(图41B)。这些研究证明了用EPIMAX鉴定的肽(Flu-MP肽#52和#53)诱导了肽特异性CD4+T细胞的增殖，且增殖的CD4+T细胞群在肽刺激的第7或8天达到峰值。该研究显示了鉴定特异性CD4+T细胞新抗原决定部位的另一个实例，并验证了在培养的第8天进行增殖CD4+T细胞群的分析是有效的。
图42是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图。从未经受DC接种的黑素瘤患者获得PBMC。个体接受装载杀灭的异源黑素瘤细胞系的自源DC疫苗。可能的是DC疫苗诱导了该个体中在用于DC疫苗的异源黑素瘤细胞系上表达的异源抗原特异性的T细胞。为了检测这种可能性，用编码HLA-B*4001的15-mer重叠肽刺激个体的PBMC，HLA-B*4001在黑素瘤细胞系上表达，但不在个体细胞上表达。如图42中所示的，簇#1内的肽#5和肽#7诱导了PBMC培养物中的IP-10产生。如所期待的，这两个抗原决定部位对于个体是抗原决定部位，因为两个肽都含有氨基酸错配。这些结果证明EPIMAX可以鉴定异源抗原特异性T细胞应答。因此该方法可以用于鉴定器官移植环境中的异源抗原特异性T细胞。
图43是描绘了根据本发明评价的1-型糖尿病个体免疫应答的图。从服用免疫抑制药物如骁悉(cellcept)和泼尼松龙(Predonisolone)的1型糖尿病个体获得PBMC。用编码IA-2的单个15-mer肽刺激新鲜的PBMC(5×105细胞/孔)，IA-2十一种在β-胰岛细胞上特异性表达的自体抗原。显示了培养48h时的IP-10水平。15-mer肽#47，60，61，62，64和66诱导了PBMC培养物中IP-10产生的上调。
该研究证明了该个体具有宽的IA-2特异性1型细胞的所有组成部分。此外，6个中的5个(肽#47，60，61，62和66，序列显示于表4中)是T细胞的新抗原决定部位。因此，该研究表明EPIMAX允许我们鉴定自身免疫性疾病模型中的抗原决定部位和T细胞应答类型，甚至在免疫抑制药物的药物治疗下。

图44A和44B是描绘根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定各种类型的免疫应答。用survivin肽文库的5个肽簇(7-8个肽/簇)孵育接种疫苗前黑素瘤患者获得的PBMC。Survivin簇#3诱导IP-10的下调和IL-10的上调。然后用簇#3的单个肽孵育PBMC来鉴定该负责的肽，肽#15。IL-10的上调与IL-1b相关。图44A和44C显示了关于IP-10的数据，图44B和44D显示了关于IL-10的数据，图44E和44G显示了关于IL-1α的数据，和图44F和44H显示了关于IL-1β的数据。
图45是描绘了根据本发明评价的正常健康志愿者免疫应答的图，其允许鉴定由非T细胞引起的各种类型的免疫应答。从5名健康志愿者新鲜血液中分离PBMC，用survivin肽#15孵育48小时并根据本发明的方法来评价。测量培养物上清液中产生的IP-10，并以相对于其中没有加入肽的培养物的值(％)给出了图45中的数据。Survivin肽#15显示出在全部五名志愿者中以非MHC限制方式抑制IP-10产生。
图46A和46B是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T细胞引起的各种类型的免疫应答。在survivin肽#15和/或活流感病毒(Charles River Laboratories，CT)存在或不存在下将黑素瘤患者的PBMC培养18小时。用Luminex测量IP-10(图46A)和IL-10(图46B)的浓度。显示出Survinin肽#15抑制活流感病毒刺激的PBMC的IP-10产生。
图47是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T细胞引起的各种类型的免疫应答。在survivin肽#15或肽#16(11个氨基酸与肽#15相同)的存在下用滴定浓度的TSST-1刺激黑素瘤患者的PBMC 5天。5天后，加入滴定的胸腺嘧啶核苷(1μCi/孔)。16小时后收集平板，并通过Wallac闪烁计数器来测量结合的放射性。显示出survivin肽#15抑制TSST-1刺激的T细胞增殖。
图48A-48D是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T细胞引起的各种类型的免疫应答。使用缀合各自mAb(Miltenyi)的微珠子来耗尽黑素瘤患者PBMC中的CD4+，CD8+，CD14+，CD56+，BDCA-4+，或BDCA-1或3+细胞。作为阴性对照，将PBMC通过没有任何珠子的柱子(没有消耗)。将耗尽的细胞以1M/ml重悬浮于CM中，并在survivin肽#15存在或不存在下用活流感病毒刺激。在48小时收集上清液，并用Luminex分析IL-10和IP-10水平。数据表明CD14+或CD56+细胞是肽#15诱导IL-10分泌必需的。
图49A和49B是描绘了根据本发明评价的黑素瘤患者免疫应答的图，其允许鉴定由非T细胞引起的各种类型的免疫应答。用5μM CFSE将黑素瘤患者的PBMC染色，并用10μM survivin肽#15(图49B)或对照肽#6(图49A)培养4天。用FACS分析NK群。那些CD56+细胞没有降低CFSE的强度，表明它们没有增殖(未显示)。因此，表明肽#15维持了CD3-CD56+NK细胞的存活。
可以理解通过说明而非限制本发明的方式显示了在此所述的特定实施方案。本发明的主要特征可以用于各种实施方案中而没有脱离本发明的范围。本领域技术人员使用不多于常规的实验将认识到或能够确定在此所述特定方法的各种等价物。认为这样的等价物在本发明范围内并由权利要求来涵盖。
说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请在此引入作为参考，达到好像各个单独的出版物或专利申请特意和单独表明来引入作为参考的相同程度。
根据本发明的公开内容不需要过度的实验就可以形成和实施在此所公开和要求的所有组合物和/或方法。尽管根据优选的实施方案已经描述了本发明的组合物和方法，本领域技术人员清楚可以将改变应用于组合物和/或方法以及在此所述方法的步骤或连续步骤中而没有脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，清楚的是化学和生理学都相关的特定试剂可以取代在此所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。认为所有这样本领域技术人员清楚的相似替代物和改变在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
权利要求
1.鉴定个体的一种或多种免疫调节肽的方法，所述方法包括下列步骤在取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的一种或多种肽的存在下培养个体的免疫细胞；和同时分析培养物的多个免疫反应性参数，如特异性和对肽上抗原决定部位的细胞因子应答，其中通过与个体HLA类型无关的肽的免疫反应性的存在来鉴定免疫调节肽。
2.权利要求1的方法，进一步包括鉴定免疫调节肽的反应性抗原决定部位。
3.权利要求1的方法，进一步包括鉴定肽特异性效应细胞。
4.鉴定一种或多种免疫调节片段的方法，所述方法包括下列步骤从个体分离免疫细胞；在处理过的肽文库的一个或多个片段存在下培养免疫细胞；和同时分析培养物的多个免疫特异性参数和对片段的细胞因子应答，其中通过片段的免疫反应性的存在来鉴定免疫调节片段。
5.权利要求4的方法，进一步包括鉴定多个肽片段特异性的效应细胞。
6.鉴定个体对抗原物质表达的免疫反应性类型的方法，包括步骤在一个或多个抗原片段的存在下分离并培养一种或多种个体的免疫细胞；鉴定免疫细胞产生的细胞因子；和基于响应抗原物质的协同细胞因子表达来测定免疫反应性的类型。
7.权利要求6的方法，其中抗原物质包括抗原、肽、微生物、细胞及其组合的混合物。
8.权利要求6的方法，其中抗原物质包括抗原蛋白，为此蛋白质的氨基酸序列可以是已知或未知的，以及片段取自蛋白重叠肽文库。
9.权利要求6的方法，其中抗原物质包括多种抗原物质。
10.测定个体免疫状态的诊断方法，所述方法包括下列步骤从个体中分离免疫细胞，在取自目标抗原蛋白重叠肽文库的系列肽存在下培养免疫细胞，同时分析培养物的多个免疫反应性参数来鉴定至少一种个体的免疫调节分子以基于所产生细胞因子的鉴定来测定免疫调节分子的免疫反应性类型，其中免疫反应性类型显示出个体的免疫状态。
11.权利要求10的方法，其中该方法测定个体免疫抑制的程度。
12.权利要求10的方法，其中该方法测定个体免疫系统超反应的程度。
13.权利要求10的方法，其中对于多种免疫调节分子测定个体的免疫状态来提供个体完整的T细胞所有组成部分。
14.权利要求10的方法，其中免疫调节分子和免疫反应性类型表现出个体免疫相关疾病的风险。
15.权利要求14的方法，其中免疫相关疾病选自传染病、自身免疫性疾病、自体炎症疾病、癌症、慢性炎症和过敏症。
16.预测个体治疗应答的方法，所述方法包括下列步骤在取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的存在下培养个体的免疫细胞；分析培养物的多个免疫反应性参数来鉴定至少一种个体的免疫调节分子；和分析培养物的细胞因子产生以基于所产生细胞因子的鉴定来测定免疫调节分子的免疫反应性类型以测定个体在治疗之前的抗原决定部位特异性的免疫状态，作为治疗结果的指示。
17.权利要求16的方法，其中治疗是免疫治疗如接种疫苗、被动免疫治疗和过继细胞转移。
18.预测个体疾病过程和临床结果的方法，所述方法包括下列步骤在取自目标抗原蛋白的重叠肽文库的一系列肽存在下培养一种或多种个体的免疫细胞；同时分析培养物的细胞增殖和细胞因子产生特征来测定免疫调节分子的免疫反应性类型；其中细胞因子产生特征是疾病严重程度和疾病进展或退化状态的标记。
19.权利要求18的方法，其中疾病选自癌症、肿瘤、自身免疫性疾病、自体炎症疾病、关节炎、糖尿病、过敏症、器官移植和骨髓移植。
20.制定个体治疗干预的方法，所述方法包括下列步骤基于免疫反应多个参数的分析来鉴定一种或多种个体的免疫调节分子，包括鉴定所产生的细胞因子；和制备含有一种或多种免疫调节分子的抗原决定部位特异性免疫疫苗。
21.权利要求20的方法，其中疫苗包括一种或多种提高个体特定类型免疫应答的抗原。
22.权利要求20的方法，其中疫苗包括给药一种或多种降低个体抗原决定部位特异性细胞因子产生的抗原。
23.权利要求20的方法，其中疫苗包括给药一种或多种提高个体抗原决定部位特异性细胞因子产生的抗原。
24.权利要求20的方法，其中疫苗包括给药一种或多种提高个体抗体产生的抗原。
25.权利要求20的方法，其中疫苗包括给药一种或多种提高个体中细胞介导的免疫性的抗原。
26.免疫调节个体的方法，所述方法包括下列步骤通过从个体分离免疫细胞并将它们暴露于一种或多种从肽文库鉴定的免疫调节肽来测定个体的抗原决定部位特异性免疫状态；用一种或多种从文库鉴定的免疫调节肽使个体免疫；通过在暴露于一种或多种免疫调节肽后从个体分离免疫细胞来测定个体的抗原决定部位特异性免疫状态；和比较免疫之前和之后的免疫应答类型来测定个体抗原决定部位特异性免疫状态的改变。
27.治疗需要免疫治疗的个体的方法，所述方法包括下列步骤将个体的免疫细胞暴露于一种或多种免疫调节肽来测定由这一种或多种免疫调节肽引发的免疫应答类型；用影响免疫应答类型的免疫调节肽来治疗个体；和评价用一种或多种免疫调节肽治疗个体后的免疫应答类型，如果需要，改变一种或多种免疫调节肽来改变免疫应答的类型。
28.权利要求27的方法，其中治疗效力的测定用于监控疫苗治疗、抗癌治疗、抗肿瘤治疗、器官移植、过敏症、自身免疫性疾病的治疗和传染病的治疗。
29.鉴定和表征用于免疫治疗的新治疗剂的方法，所述方法包括下列步骤在免疫调节剂和一种或多种取自目标抗原蛋白重叠肽文库的肽的存在和不存在下培养分离的免疫细胞；同时分析培养物的多个免疫反应性参数，如特异性和对肽上抗原决定部位的细胞因子应答；和将免疫调节剂存在时的免疫反应性和免疫调节剂不存在时的免疫反应性进行比较，其中免疫反应性的抑制表示是免疫抑制治疗剂和其中免疫反应性的提高表示是佐剂。
30.权利要求29的方法，其中治疗剂是驱动对Th1、Th2、Tc1、Tc2及其组合的免疫应答类型的免疫调节肽的组合。
31.通过以下方法鉴定的治疗剂，该方法包括下列步骤在免疫调节剂和一个或多个目标抗原剂的片段的存在和不存在下培养分离的免疫细胞；同时分析培养物的多个免疫反应性参数如特异性和对片段的细胞因子应答；和分离免疫反应性细胞。
32.权利要求31的方法，其中抗原剂选自传染病、癌症、肿瘤、自身免疫性疾病、自体炎症疾病、关节炎、糖尿病、过敏症、器官移植和骨髓移植。
33.鉴定疫苗抗原决定部位的方法，所述方法包括下列步骤在一种或多种取自目标抗原蛋白重叠肽文库的肽存在下培养分离的免疫细胞；分析培养物的多个免疫反应性参数和细胞因子产生以基于所产生细胞因子的鉴定来测定对肽的免疫反应性类型；和用一种或多种具有相同识别序列的肽来制备疫苗。
34.权利要求33的方法，其中在分离后测定一种或多种肽的序列。
35.表征疫苗抗原决定部位的方法，所述方法包括下列步骤在一系列取自抗原剂的重叠肽文库的肽存在下培养分离的免疫细胞；分析培养物的多个免疫反应性参数和培养物中的细胞因子产生来测定对一种或多种肽的免疫反应性类型，其中通过对抗原剂引发的免疫反应来表征疫苗抗原决定部位。
36.权利要求35的方法，其中抗原剂包括病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫。
37.权利要求35的方法，其中抗原剂是自体抗原。
38.权利要求35的方法，其中分析细胞培养物并测定一种或多种T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞和红血球的特征。
39.组合物，其中含有一种或多种从对于特定个体鉴定为免疫反应性的肽文库分离的选择来改变免疫应答类型的肽，在该特定个体中已经鉴定了对于Th1和Th2 T细胞都是反应性的肽。
40.组合物，其中含有一种或多种从对于特定个体鉴定为免疫反应性的肽文库分离的选择来改变免疫应答类型的肽，在该特定个体中已经鉴定了对于Tc1和Tc2 T细胞都是反应性的肽。
全文摘要
本发明包括用于鉴定与个体HLS类型无关的T细胞抗原决定部位的组合物和方法，通过同时分析培养物的多个免疫反应性参数来鉴定至少一种抗原决定部位，其中在子集中引发目标免疫反应性的抗原决定部位被鉴定为关于该子集的靶向剂。
文档编号C40B30/04GK1989410SQ200580025001
公开日2007年6月27日 申请日期2005年5月24日 优先权日2004年5月24日
发明者J·邦舍罗, J·E·康诺利, A·K·帕卢卡, H·厄诺 申请人:贝勒研究院