用于增强免疫应答的组合物和方法

用于增强免疫应答的组合物和方法
【专利摘要】本发明公开的是用于治疗或预防微生物感染的方法和组合物。
【专利说明】用于增强免疫应答的组合物和方法
[0001]相关申请
本申请要求于2011年4月20日提交的USSN61/477，353 ;于2011年4月20日提交的USSN 6161/477，369 ;于 2011 年 4 月 20 日提交的 USSN 61/477，369 ;于 2011 年 4 月 20 日提交的 USSN 61/477, 385 ;于2011 年4月 20 日提交的 USSN 61/477, 284 ;于 2011 年4 月 20日提交的USSN 61/477，306 ;和于2011年4月20日提交的USSN 61/488，530的优先权。这些申请的内容整体引入本文作为参考。
发明领域
[0002]本发明涉及用于增强免疫应答的方法和更具体地使用灭活的分枝杆菌属(Mycobacterium)物种的疫苗。
[0003]发明背景
结核分枝杆菌(IcoAacteria? tuberculosis') (M.tb)感染全世界三分之一的人口[1]。称为卡介苗(BCG)疫苗的普通肺结核(TB)疫苗在发展中国家给予新生儿。虽然这种疫苗在儿童中保护免于脑膜和播散性TB，但它未能足够在成人生活中保护潜伏TB的建立或肺疾病的复活[2]。此外，BCG有效性据报道经过10-15年的时期下降[3]。最常见类型的肺结核疾病是肺的，并且经由在咳嗽过程中挤出的悬浮小滴发生传播。因此，尽管BCG疫苗接种的高流行性，疾病负荷仍未降低。目前存在M.tb微细菌谱系可能已适应M.tb和BCG共同的抗原中的突变的证据[4’5]。此外，近期研究暗示肠胃外递送的BCG可能未能在肺粘膜中诱导T细胞免疫应答，其对于免于肺疾病的保护可能是关键的&7]。由于至少这些原因，需要新疫苗以降低遍及全世界的TB流行。
[0004]发明概沭
本发明基于制备增加所需免疫应答的组合物的新方法的发现。
[0005]在一个方面，本发明提供了使用被照射的M.tb群体的疫苗，所述M.tb群体包括高百分比的处于预定生物状态的细胞。M.tb的状态可以意指例如处于起于营养剥夺、极端温度、铁耗尽、好氧生长、厌氧生长、氧化胁迫或这些状态中的两种或更多种的组合的代谢状态的细胞。在一些实施方案中，多于90%、95%、98%、99%或99.9%的M.tb细胞处于预定状态。
[0006]疫苗可以连同许多其他疫苗接种策略一起使用，以预防或消除由肺结核的感染和/或预防复活。它可以在已经接受BCG或另一种亚基TB免疫刺激剂的患者中用于替换BCG和/或用作BCG的加强剂。疫苗可以在预防或治疗策略中使用。
[0007]用于诱导特异性代谢状态的合适刺激包括但不限于多种氧浓度、一氧化碳、营养可用性、一氧化氮的存在、抗生素的存在、铁的可用性、PH变化、Toll样受体激动剂、群体密度和/或物理刺激例如摇动。
[0008] 合适的刺激可以在照射前对杆菌在体外或体内提供。
[0009]在一些实施方案中，100%的分枝杆菌属物种细胞是灭活的。当受试者是人时，100%的分枝杆菌属物种细胞优选是灭活的。
[0010]在一些实施方案中，分枝杆菌属物种使用照射灭活。优选地,照射使用Y照射,但可以使用其他类型的辐射包括X射线和微波。
[0011]在一些实施方案中，分枝杆菌属物种是经由盐或干燥处理用渗透压灭活的。
[0012]药物组合物可以任选包括佐剂以增强宿主中的免疫应答。
[0013]药物组合物可以任选包括药学可接受的载体，或是冻干提供的。
[0014]在一些实施方案中，药物组合物配制用于鼻内递送至宿主。
[0015]此外，药物组合物作为气溶胶或喷雾剂包装提供。
[0016]在一个实施方案中，本发明提供了包括Y照射的分枝杆菌属物种的药物组合物，其配制用于鼻内或肺内递送至哺乳动物宿主，并且当递送至宿主例如人时，赋予免疫保护剂量。
[0017]在另一个方面，本发明提供了针对TB给哺乳动物接种疫苗的方法。该方法包括给哺乳动物施用包含灭活的分枝杆菌属物种的组合物。优选的疫苗接种是鼻内或肺内的。优选地，当递送至宿主时，该组合物包括免疫保护剂量。
[0018]在另一个方面，本发明提供了促进另一种抗原递送的免疫刺激剂。
[0019]在一个方面，本发明提供了包含灭活的分枝杆菌属物种的药物组合物，其中该组合物配制用于鼻内、粘膜或肺内递送至哺乳动物宿主，并且其中当递送至宿主时，该组合物包含免疫保护剂量。
[0020]用于在该方法中使用的合适分枝杆菌属物种包括例如结核分枝杆菌、海洋分枝杆菌(M.marinum)、牛分枝杆菌(M bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、或田鼠分枝杆菌(M.microtti)。在一些实施方案中，灭`活的分枝杆菌属物种细胞是被杀死的细胞或细胞裂解产物。当受试者是人时，100%的分枝杆菌属物种细胞优选是灭活的。
[0021]用于在该方法中使用的药物组合物可以任选包括佐剂以增强宿主中的保护性免疫应答。
[0022]用于在该方法中使用的药物组合物可以任选包括药学可接受的载体，或是冻干提供的。
[0023]在一些实施方案中，用于在该方法中使用的药物组合物配制用于鼻内递送至宿主。
[0024]此外，用于在该方法中使用的药物组合物作为气溶胶或喷雾剂包装提供。
[0025]在一些实施方案中，药物组合物通过配制用于鼻或肺递送的装置递送。
[0026]在再进一步的方面，本发明提供了用于制备用于预防由分枝杆菌感染或治疗分枝杆菌感染的疫苗的方法，其包括配制灭活的分枝杆菌属物种的免疫保护剂量用于鼻内或肺递送至哺乳动物宿主。
[0027]在一些实施方案中，该方法包括在肺结核的非人动物模型中测试疫苗。动物模型可以是例如小鼠、豚鼠、兔、牛或非人灵长类动物。
[0028]在本发明的优点中有本文公开的疫苗模仿在杆菌生命周期自始至终在宿主内天然发现的异质状态，并且为免疫系统提供多个状态的灭活杆菌。
[0029]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了合适的方法和材料，但与本文描述那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献都整体引入作为参考。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和例子仅是举例说明性的并且不预期是限制性的。
[0030]本发明的其他特征和优点由于下述详述和权利要求将是显而易见的。
[0031]发明详沭
本文提供的是尤其作为预防或治疗疫苗有用的多种组合物。
[0032]基于处于一种或多种限定状态的分枝杆菌的疫苗
根据本发明的疫苗使用处于一种或多种限定代谢状态的一种或多种灭活的分枝杆菌属物种进行制备。分枝杆菌属物种随后可以配制用于递送至受试者。虽然不希望受理论束缚，但以限定状态制备的分枝杆菌属物种被认为对异质全细胞制剂提供优点。相比之下，根据本发明的灭活分枝杆菌的异质群体提供了大量分枝杆菌抗原，以帮助免疫系统引起强记忆性免疫应答。当递送至受试者的肺实质或气道/鼻粘膜时，灭活的异质分枝杆菌假定引起比用先前描述的TB疫苗观察到的强得多的免疫应答。
[0033]限定的分枝杆菌状态
一般而言，分枝杆菌的特异性代谢状态可以通过环境触发剂、抗生素、分枝杆菌浓度、营养素的可用性或氧的存在进行诱导。物种或菌株的状态也可以通过一氧化氮、一氧化碳和pH的逐步变化进行诱导。分枝杆菌的特异性代谢状态可以定义为由于外部刺激的感知和特定基因转录。存在基因转录由于不同外部刺激而发生的充分证据。许多研究者已表征根据基因组数据M.tb的顺应机制经过过去十年自然增长。静止期和休眠基因表达已早在1996年使用占优势的静止期蛋白质的表征进行表征[8]。关于16-kDaa晶状体蛋白样小热休克蛋白质的基因显示主要在缓慢生长的M.tb群体中表达。可替代地，探究M.tb的营养素饥饿的工作显示基因例如Rv2557和Rv2558被诱导。[9]更近期的工作也确证M.tb在巨噬细胞感染过程中感知一氧化碳(CO)的能力且认识到该细菌可能依赖于CO以便适应[1°]。
[0034]M.tb已进化出允许持续性感染且平衡宿主免疫系统的复杂动态的生存机制。M.tb作为病原体的反弹性很大程度上是由于它适应环境因素且感知外部刺激的能力。例如，M.tb可以伴随最低限度(如果存在的话)的复制位于人组织中数年，并且随后在合适条件下恢复生长状态。研究支持该细菌的不同状态是敏感的且由外部刺激、不同环境、化学制品和抗生素触发的概念[11][12]]13]。
[0035]M.tb的不同代谢状态被认为通过生物传感机制触发，所述生物传感机制改变基因表达以引起细胞内和细胞外状态变化。处于特定状态的分枝杆菌属物种对失活是敏感的，并且假定与处于未知状态或异质状态的细胞群体相比较，在引起免疫应答中是更有效的。本发明提供了处于特定代谢状态的分枝杆菌。
[0036]M.tb在宿主内的成功发病机制需要适应且习惯显著攻击的能力。在感染到宿主内之后，该杆菌能够在肺内的巨噬细胞和树突状细胞内存活且随后繁殖。巨噬细胞将吞噬杆菌且释放溶酶体组分(例如诱导型一氧化氮合酶和N0X2)。随后，巨噬细胞将氧和氮中间产物分泌到吞噬体内，以杀死且消化该组分。[14][15]。M.tb阻止吞噬体内pH的大量降低。因此，该杆菌避免在其中它将不能复制的不利的低PH环境[16]。事实上，在吞噬溶酶体内的M.tb被认为通过压制巨噬细胞使pH降低至低于5的尝试而帮助维持约6.4的更高pH[17]。
[0037]其次，为了控制且 阻止散布，尽管宿主尝试将该杆菌装入肉芽肿内，M.tb必须能够持续。肉芽肿是围绕受感染组织的免疫细胞层。肉芽肿的中心通常由融合在一起的濒死组织和巨噬细胞组成。肉芽肿的外层包括活化的巨噬细胞、CD4和CD8细胞。在肉芽肿内发现的杆菌通常处于低氧伴随高二氧化碳水平、水解酶和抗微生物化合物的环境中。因此，该杆菌的状态赋予在肉芽肿内存活的能力且给细菌提供数月或甚至数年后复活的机会。
[0038]第三，M.tb还可以在其中条件和营养素可能贫乏的受感染个体的其他器官和组织中发现。虽然这个杆菌群体的作用仍未充分了解，但认为这些杆菌可能帮助促成杆菌持续且使数年后杆菌能够复活。
[0039]M.tb的传感器和生物力学目前受到越来越多的关注，并且更多研究目前突出杆菌的复杂机制。事实上，M.tb的基因组编码约190种转录调节物，其中几种已发现响应困境条件，例如营养素剥夺、极端温度、铁耗尽和氧化胁迫。_为了在哺乳动物宿主中存活延长时期，M.tb根据其周围环境适应多种环境条件表达或抑制转录[19]。
[0040]特别地，已存在致力于M.tb经得住厌氧和好氧条件的能力的许多观察。肺结核杆菌需要氧用于复制，但该杆菌可以伴随极低浓度的氧持续数年。从好氧到厌氧条件的快速变化将导致细菌死亡；然而，O2的逐步减少允许该杆菌逐步适应不含O2的环境。
[0041]M.tb还可以适应低铁的体内条件。[12] 22种M.tb基因的检查显不whiB3基因在M.tb感染的早期部分过程中被诱导。该基因可能通过与低细菌密度组合的氧化和/或还原胁迫触发。[2°]研究确证氧化还原响应的4Fe-4S簇蛋白质与O2特异性反应，并且NO诱导M.tb WhiB3基因的表达。[21]该复合物响应被认为涉及持续和潜伏的生理学相关的宿主信号。[21]此外，whiB3的诱导与细胞内氧化还原环境中的变化关联，并且怀疑依赖于需氧呼吸和碳利用。
[0042]虽然whiB3的调节看起来是复杂的,但在体内和体外的whiB3阻遏模式与通过群体密度的调节最一致。[2°] [21]进一步地，发现whiB3的表达与小鼠肺和培养物中的细菌密度反相关。[2°]还认为分枝杆菌具有经由细菌的细胞间通讯感知分枝杆菌群体密度的能力。最后，该能力允许细菌作为群体适应或获得群体信息。因此，提供不同群体的体内或体外条件可以帮助诱导分枝杆菌的不同状态。
[0043]另一种对于分枝杆菌改变的状态在氧耗尽过程中发生，这允许该细菌进入两种非复制状态[22]。当氧浓度达到1%的正常饱和时，非复制持续的第一阶段(NRPl)发生。这个时期也称为微量需氧期，特征在于在培养物内增加的光密度。细胞扩大可能是细胞壁增厚的结果，其通常仅在低氧条件下观察到[11]。这个时期进一步特征在于RNA合成降低、细胞分裂暂停和DNA合成停止，伴随分枝杆菌酶促活性的许多变化。酶包括但不限于异柠檬酸裂合酶、4甘氨酸脱氢酶4和硝酸盐还原酶。[13]这个时期还可以被称为静止期，并且通常指通过氧限制、营养素限制、次级代谢产物生产和PH变化引起的在分批培养物中的细胞密度相关的生长停止。[23]大部分人认为这个时期模拟由M.tb在多个持续感染阶段过程中显示出的生理学状态。
[0044]当细胞的代谢状态处于最低且仅必需功能是活性时，第二种更多氧剥夺的状态，称为非复制持续2 (NRP2)发生。当氧水平达到0.06%的正常饱和(厌氧)时，这个第二种非复制期或状态发生。该状态特征在于光密度中的无进一步增加和细胞扩大的停止。有趣的是，细胞变得对抗生素例如异烟肼抗性并且对治疗厌氧菌的抗生素例如甲硝唑敏感。另外，处于这个状态的细菌可以持续长时间段。如果转移至适当条件，则该细菌以同步方式重新开始生长，RNA合成首先开始，随后为细胞分裂，并且随后最后DNA复制重新开始。
[0045]诱导NRP2的一种方法是引起封闭系统例如搅拌的封闭培养管内氧的缓慢耗尽。最初，培养物是好氧的，但随着可用的氧消耗，环境转变成微需氧期，并且随后转变成厌氧期。缓慢进展允许杆菌适应且存活缺氧条件，即使它们不能厌氧生长。
[0046]Rosenkrands等人指示许多蛋白质例如Rv0569显示在5%氧时增加的水平,但在1%氧时则不。[24]使用肽分析研究的独特蛋白质的相对丰度可能比使用NRP模型预测的大得多。此外，使用肽分析研究的独特蛋白质的相对丰度可能比NRP模型中预测的大得多。因此，明确的是基于蛋白质浓度发现适当稳定状态帮助提供被照射的分枝杆菌属物种的合适混合物。
[0047]根据本发明的TB疫苗优选在粘膜和呼吸粘膜系统中引发保护性免疫应答，并且优选用处于多个状态的多个分枝杆菌物种直接刺激在呼吸上皮中的抗原呈递细胞。
[0048]M.tb 的失活
一般而言，可以使用任何类型的失活程序，只要处理留下不能在宿主中产生生产性感染的细菌群体，同时保存引起针对相应引起疾病的分枝杆菌的生产性应答所需的抗原结构。分枝杆菌制剂一般是无能力的。在根据本发明产生的无能力的细菌细胞背景下的“无能力的”意指细菌细胞处于不可逆抑菌的状态中。虽然该细菌保留其结构，并且因此保留例如与野生型细菌相关的免疫原性、抗原性和/或受体-配体相互作用，但它不能复制。在一些实施方案中，由于在细菌细胞内感染性噬菌体的存在，它不能复制。
[0049]优选类型的失活是Y照射。本领域已知的其他类型的失活包括例如其他类型的照射(包括紫外线照射)、福尔马林处理和热处理。在用于人使用的实施方案中，100%的细胞被杀死。
[0050]虽然不希望受理论束缚，但假定Y照射的分枝杆菌尤其适合于在本发明的组合物和方法中使用。Y照射的细菌通常用于实验室中，因为它们视为安全的且不复制。然而，在许多试验中，它们已显示引起免疫保护性应答，包括通过杆菌壁上的抗原引起的应答
[25]，[26]，[27]。此外，Y照射的分枝杆菌经历细胞凋亡，并且变得由树突状细胞吞食。树突状细胞将分枝杆菌抗原呈递给T细胞，这激活⑶4 Thl和⑶8细胞毒性细胞。Y照射的M.tb还可以诱导一氧化氮释放[25]，并且可以引发与活M.tb相似的Th2应答[26]。在1963年，Nishihara等人将Y照射的M.tb皮内注射到小鼠内，并且发现它与皮内注射的BCG针对用M.tb的气溶胶攻击同样是保护性的[28]。
[0051]与其他感染相比较，针对活M.tb感染的适应性免疫应答是延迟的，并且这允许肺中的杆菌群体在感染的免疫前期过程中显著增加[29]。通过使用在雾化或粘膜疫苗制剂中的死杆菌，不存在繁殖的分枝杆菌，并且免疫应答将具有足够的时间响应该细菌的细胞壁上的抗原。此外，经过通过适合性攻击的数千年，M.tb已发现许多方式逃避在最初抗原呈递过程中的先天性免疫应答[3°]，[31]，[32，33]。死分枝杆菌不具有产生酶的能力，所述酶引发逃避人免疫系统的方式且避免成功的抗原呈递。
[0052]疫苗雾化或粘膜递送至肺组织
优选地，处于所需状态的分枝杆菌将用于引起肺中的局部免疫应答。因为肺是TB感染的最初部位，所以集中于局限于肺 系统的疫苗看起来是合逻辑的。在呼吸免疫系统中存在区室化程度。近期证据暗示肺淋巴细胞在设定最初免疫应答时保持局部的，并且仅有限数目的B和T细胞全身迁移[34，35]。人肺淋巴解剖学是独特的，因为在从局部肺结节进入胸导管的细胞在到达其他组织前在肺动脉血液中行进回到肺。一些淋巴细胞可能经过大循环，但活化T细胞趋于附着至血管内皮，并且移动回到肺内，从而保持T细胞接近感染灶[36]。在豚鼠TB模型中，观察到肺淋巴管是除了肺和局部淋巴结外的最初感染部位[37] [38’39]。因此，靶向气道腔和粘膜免疫细胞对于开发有效的疫苗接种策略保持重要含义。另外，气道腔/粘膜递送的疫苗将具有显著优点，例如消除针的需要且允许在大范围流行面前的快速疫苗接种应答。
[0053]使用气溶胶或气管内BCG递送的几项研究在效力中从在灵长类动物[4°]、牛[41]、豚鼠[42]和小鼠[43] [44’45’46]中比肠胃外接种更好的保护到没有超过皮下途径的明显优点不等
[47]。其他研究显示免疫应答依赖于最初BCG剂量[48][49]。鼻内递送的基于重组腺病毒的疫苗提供免于用M.tb攻击的保护[39’5°’51’52]。小鼠用表达Ag85A的基于腺病毒的疫苗[53’54]、表达Ag85B-ESAT-6 的重组格氏链球菌(Sirepiococcw1S gordonii) [55]或微粒封装的 ESAT_6[56]的鼻内免疫接种引起能够产生IFN-Y的大量抗原特异性⑶4+和⑶8+ T细胞。最近以来，肝素结合血凝素的鼻内递送增强接种BCG疫苗的新生小鼠的保护[57]。
[0054]鉬合物
对于其需要增强的免疫应答的任何分枝杆菌属物种或菌株可以用于本发明的组合物和方法中。具有处于预定状态的分枝杆菌的组合物可以使用例如中所述的程序进行制备？。合适的物种包括例如其为M tb复合物成员的分枝杆菌，包括例如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和结核分枝杆菌。遗传上相似的分枝杆菌包括卡内蒂分枝杆菌(Mycobacterium canettii)和海洋分枝杆菌。对于待治疗的相应宿主物种和分枝杆菌类型相关疾病选择特定物种或物种组合。在人中引起疾病的其他分枝杆菌包括例如鸟胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分支杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、副结核分枝杆菌(Mycobacteria paratuberculosis)、溃瘍分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei )、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、产鼻疽分枝杆菌(Mycobacterium farcinogenes)、黄色分枝杆菌(Mycobacterium flavum)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophitum)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、療病分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、塞内加尔分枝杆菌(Mycobacterium senegalense)、猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、抗热分支杆菌(Mycobacterium thermoresistible)、和蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)。
[0055]待用于药物组合物中的分枝杆菌可以包括全细胞或细胞的部分，例如细胞裂解产物。例如，合适的组分包括Y照射的全细胞裂解产物、Y照射的培养物滤液蛋白质、Y照射的细胞壁级分、Y照射的细胞膜级分、Y照射的细胞溶质级分、Y照射的可溶性细胞壁蛋白质和Y照射的可溶蛋白质库。
[0056]待用于药物组合物中的分枝杆菌可以包括无论是在全细胞中还是在细胞的部分例如细胞裂解产物中的一种或多种分枝杆菌状态。
[0057]制备药物组合物
通过将处于一种或多种所需状态的灭活细胞或细胞裂解产物与药学可接受的载体组合以形成药物组合物，制备被杀死的细胞用于施用于宿主。载体可以是例如，如生理盐水、矿物油、植物油、含水羧甲基纤维素钠、或含水聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，载体足够纯以治疗上施用于人受试者。使用例如等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液，本领域技术人员完全能够制备合适的溶液。需要时，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0058]熟悉与例如牛分枝杆菌BCG施用相关的方案、制剂、剂量和临床实践的本领域技术人员另外可以容易地采用这些方案用于与本发明的药物组合物一起使用。疫苗以与剂量制剂相容的方式和以将是治疗有效和免疫原性的此类量施用。待施用的数量依赖于待治疗的受试者，包括例如个体的免疫系统设定免疫应答的能力，和所需保护程度。合适的剂量范围是数百微克活性成分/疫苗接种的级别，其中优选范围为约0.1 Ug - 1000 mg。用于最初施用和加强注射的合适方案也是可变的，但通过最初施用随后为后续接种或其他施用代表。因此，疫苗可以在单一剂量或多个剂量中施用。在一个实施方案中，疫苗可以在相隔约1-12个月的两个剂量中施用。受试者可以在任何时间进行疫苗接种，尽管优选在预料胁迫时期前不久(最佳地约10天-两周)例如在运送或其他处理过程中施用疫苗。
[0059]组合物可以单独或者同时或顺次与其他处理或标准BCG疫苗一起施用，取决于待治疗的状况。组合物可以在用BCG接种疫苗后施用，并且因此充当加强肺结核疫苗。此外，它可以在完全杀死的杆菌的最初皮下接种后给予，随后为雾化、鼻内或粘膜加强。
[0060]被杀死的细胞可以掺入微粒或微胶囊内，以延长抗原材料对受试者动物的暴露并且因此保护动物长时间段免于感染。微粒和胶囊可以使用本领域常规技术由多种众所周知的惰性、生物相容性基质材料形成。合适的基质材料包括例如天然或合成聚合物例如海藻酸盐、聚(乳酸)、聚(乳酸/乙醇酸)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、乙烯-乙酸乙酯共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯且特别是琼脂和聚丙烯酸酯。可以在本文中使用的用于将材料掺入微粒内或封装的技术的例子由Sparks[58]、Kydonius[59]和El-Nokalyteci]描述,所述参考文献各自的内容引入本文作为参考。
[0061]灭活的分枝杆菌可以包含在水或盐水中悬浮的小颗粒中。疫苗制剂还可以含有任选的本领域常规的佐剂、抗菌剂或其他药学活性剂。佐剂可以包括但不限于盐、乳状液(包括油/水组成)、皂苷、脂质体制剂、病毒`颗粒、多肽、病原体相关分子模式(PAMPS)、基于核酸的化合物或利用特定抗原的其他制剂。合适的佐剂包括例如植物油、白矾、弗氏不完全佐剂或弗氏不完全佐剂，其中油和弗氏不完全佐剂是特别优选的。其他佐剂包括试剂例如氢氧化铝或磷酸盐(白矾)、免疫刺激复合物(ISCOMs)、合成糖聚合物(CARB0P0L?)、通过热处理在疫苗中的蛋白质聚集、通过用胃蛋白酶处理的针对白蛋白的(Fab)抗体复活的聚集、具有细菌细胞例如小隐孢子虫(C.parvum)或者革兰氏阴性菌的内毒素或脂多糖组分的混合物、在生理学可接受的油媒介物例如二缩甘露醇一油酸(Aracel A)中的乳状液或还可以采用具有用作嵌段替代物的20%的全氟化碳(Fluosol-DA)溶液的乳状液。
[0062]灭活的分枝杆菌可以包含在粘膜细菌毒素佐剂或CpG寡脱氧核苷酸(CpG 0DN)中，所述粘膜细菌毒素佐剂例如大肠杆菌iEscherichia coli )不耐热毒素(LT)和霍乱毒素(CT)[61]。另一种可能的粘膜佐剂单磷酰脂质A (MPL)，LPS的衍生和毒性更少的形式，当与脂质体组合时，发现诱导粘膜免疫保护性应答_。设计用于鼻疫苗接种的一种新佐剂Eurocine L3 ?已显示，在鼻内施用后在实验动物模型中诱导针对TB的长效免疫[63’64’65]。佐剂技术由基于内源和药学可接受脂质的组合的无毒药物制剂组成。疫苗可以任选包括单独或与上述佐剂组合的另外的免疫调节物质，例如细胞因子或合成IFN-Y诱导剂例如聚1:C。
[0063]另外其他佐剂包括生物相容性基质材料的微粒或珠。微粒可以由本领域常规的任何生物相容性基质材料组成，所述基质材料包括但不限于琼脂和聚丙烯酸酯。本领域技术人员将认识到同样可以使用其他载体或佐剂。例如，可以使用的壳聚糖或任何生物粘附递送系统由Webb和Winkelstein[66]描述,所述参考文献的内容引入本文作为参考。
[0064]组合物任选包括维生素DjP /或其代谢产物、类似物或其衍生物作为雾化剂量的部分。本领域技术人员将认识到维生素D可以帮助toll样受体的触发。
[0065]含有灭活的分枝杆菌的药物组合物优选使用本领域已知的方法配制用于鼻内或肺内递送。优选选择与佐剂组合的被照射的分枝杆菌的制剂，以使与疫苗接种相关的副作用例如炎症降到最低，或可以改善制剂的稳定性。佐剂还可以具有作为免疫刺激剂或作为贮库(depot)的作用。为了使深肺渗透，粒子大小优选在1-4微米之间。
[0066]在一些实施方案中，灭活的分枝杆菌通过喷雾器的精制或经由三类紧凑的便携式装置、计量剂量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)进行递送。鼻内递送可以经由鼻喷雾、滴管或鼻计量药物递送装置发生。失活的分枝杆菌可以经由计量剂量吸入器递送。一般地，仅10 - 20%发出的剂量沉积在肺中。喷雾器的高速度和大粒子大小引起约50 - 80%的药物气溶胶在口咽区中撞击。
[0067]分枝杆菌可以包含在干粉制剂例如但不限于糖载体系统中。糖载体系统可以包括乳糖、甘露醇和/或葡萄糖。乳糖、甘露醇和葡萄糖都由FDA批准作为载体。还存在较大的糖颗粒例如一般直径50-100微米的乳糖一水合物，其保留在鼻咽中，但允许灭活的杆菌行进通过呼吸树进入肺泡内_。
[0068]需要时，分枝杆菌可以包含在脂质体制剂中。脂质体如同到达肺泡的其他吸入颗粒通过巨噬细胞清除。脂质体磷脂的加工、摄取和再循环通过与内源表面活性剂相同的机制经由肺泡II型细胞发生。
[0069]术语
含有上文描述的被照射的分枝杆菌的药物组合物施用于合适个体用于预防或治疗肺结核。本文提及“肺结核”包括提及肺和肺外杆菌。术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且指具有细菌感染并且需要治疗或疗法任何受试者，所述细菌感染顺应使用本发明的治疗疫苗治疗。药物组合物可以制备用于对通过分枝杆菌的感染敏感的任何哺乳动物宿主。合适的哺乳动物宿主包括例如农场动物例如猪和牛。
[0070]术语“治疗”、“处理”等在本文中一般用于指获得所需药理学和/或生理学效应。效应可以在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防的，和/或可以在部分或完全稳定或治愈疾病和/或可归于疾病的不良作用方面是治疗的。如本文使用的“治疗”涵盖受试者特别是哺乳动物受试者更特别是人中的疾病的任何治疗，并且包括:(a)预防疾病或症状在受试者中发生，所述受试者可以倾向于该疾病或症状，但仍未诊断为具有该疾病或症状；(b)抑制疾病症状，即停止其发展；或缓解疾病症状，即引起疾病或症状消退；(c)预防在潜伏TB中的疾病复活，即预防杆菌从休眠转变为生长期。因此，施用优选以“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防可以视为治疗)，这足以显示对个体的利益。施用的实际量、以及施用速率和时间-过程，将依赖于待治疗的性质和严重性。治疗的开处方例如关于剂量等的决定在普通医生和其他医生或兽医的职责内。
[0071]用疫苗治疗的受试者一般具有或将发展针对传染性细菌的保护性免疫。术语“保护性免疫”意指施用于哺乳动物的疫苗、免疫原性组合物或免疫接种方案诱导免疫应答，所述免疫应答预防疾病、延迟疾病的发展、或减少疾病的严重性，所述疾病由致病菌引起，或减少或完全消除疾病的症状。“传染性细菌”意指已在宿主中建立感染，并且因此可以与疾病或不希望的症状相关的细菌。一般地，传染性细菌是致病菌。
[0072]短语“以引发免疫应答的足够量”意指在特定疫苗制剂或免疫原性组合物施用前和后测量的免疫应答指示剂之间的可检测差异。给予疫苗试验的动物将针对给予皮内BCG的动物进行测试。末次疫苗接种后几周，动物将用气溶胶有毒力的M tb进行攻击。临床和分子免疫应答在用有毒力的M.tb攻击后几周进行评估。
[0073]术语“状态”、“代谢状态”、“改变的状态”或“不同状态”可以互换使用，并且指其
中在蛋白质组成或基因表达中存在可检测差异的分枝杆菌的不同代谢状态。定义由此细菌已响应外部刺激的状态，并且因此细菌呈递不同抗原或可以表达且开始特定基因的转录。
[0074]筛选且开发肺结核疫苗
测试疫苗可以通过下述进行筛选或最佳化:对分枝杆菌细胞群体或其级分(如上所述)实施多种失活方案，制备含有处理的细胞或细胞级分的候选药物组合物，并且测试使用上文所述方法处理的组合物在宿主中引起免疫应答和/或设定对分枝杆菌感染的有效攻击的能力。
[0075]术语“免疫原性细菌组合物”、“免疫原性组合物”和“疫苗”在本文中可互换使用，以意指当以足够量施用以引起针对所述制剂中存在的表位的免疫应答时，能够在受试者中引起细胞和/或体液免疫应答的制剂。
[0076]术语“状态”或“时期”在本文中可互换使用，并且指分枝杆菌响应外部刺激或环境的代谢状态。
[0077]由分枝杆菌细胞或提取物制剂表达的抗原分子的免疫效力可以通过监控在用表达重组抗原的细菌免疫接种后测试动物的免疫应答进行测定。测试动物可以包括小鼠、豚鼠、兔、牛、非人灵长类动物和最终人受试者。
[0078]测试受试者的免疫应答可以另外通过多种方法进行分析，例如:(a) T细胞相关细胞因子产生，(b)血浆细胞因子产生，(c) T细胞增殖、细胞毒性、细胞因子概况，(d) T细胞抗原储库，(e) T细胞调节概况，(f) mRNA概况，(g)先天性免疫概况，(h)抗体概况，(i)遗传学和(j)在免疫接种的动物中免于疾病的保护和/或传染性症状的缓和。
[0079]细菌组合物及其使用方法
在另一个方面，本发明涉及配制用于经口、直肠或阴道递送至受试者的针对肺结核的疫苗和更特别地使用灭活的分枝杆菌属物种的疫苗。
[0080]粘膜疫苗接种和治疗代表免疫学中的下一个新领域。肠相关淋巴样组织及其免疫系统代表用于针对分枝杆菌属物种和或其他细菌例如布鲁杆菌属物种治疗或接种疫苗的显著挑战。分枝杆菌属物种和布鲁杆菌属物种是反弹性的细胞内细菌，其已与人共进化且继续影响人和家畜。同样在牛中，布鲁杆菌病和约内氏病代表对家畜健康的显著问题，并且代表对农业的显著经济负荷。目前用于这两种疾病的疫苗提供可疑的效力并且提高安全关注。另外，克罗恩氏病仍没有疫苗替代物。需要用于在肠相关淋巴样组织内诱导免疫应答且减少由这些细胞内病原体引起的疾病流行的新方法。
[0081]本发明提供了用于预防和/或治疗细菌性传播疾病，例如通过灭活的分枝杆菌物种和灭活的细菌引起的疾病的疫苗的组合物。
[0082]组合物可以与许多疫苗接种策略一起使用:预防上，在感染前给予以预防由细菌的感染，和治疗上，当它在暴露后施用以消除或含有潜伏且预防复活时。组合物还可以用作用于细菌、病毒或真菌感染或自身免疫疾病的治疗。使用本发明的组合物的疫苗可以用于替换目前疫苗和/或用作受试者中的其他疫苗的辅助剂。
[0083]组合物可以配制用于经口、直肠或尿道递送。还在本发明内的是渗透递送系统和其他制剂递送系统用于控制抗原材料的递送速率，以便使对粘膜组织例如肠粘膜淋巴样组织的暴露达到最大。
[0084]制剂可以作为含有细菌或病毒组分的组合物的部分，作为整个实体或部分组分使用。被照射的分枝杆菌对肠或生殖系统的粘膜表面的局部递送可以充当佐剂和/或治疗剂。
[0085]在一个方面，本发明提供了包含一个或多个分枝杆菌物种的药物组合物，其中该组合物配制用于阴道、直肠或经口递送至哺乳动物宿主，并且其中当递送至宿主时，该组合物包含免疫保护剂量。
[0086]在一个方面，本发明提供了用于在牛中的自身免疫疾病例如约内氏病、炎性肠病或克罗恩病对哺乳动物的疫苗接种或治疗。
[0087]组合物可以包括被照射和/或灭活的分枝杆菌属物种。合适的分枝杆菌属物种包括例如鸟分枝杆菌副结核亚种、结核分枝杆菌、海洋分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌或田鼠分枝杆菌。在一些实施方案中，灭活的分枝杆菌属细胞是被杀死的细胞或细胞裂解产物。
[0088]一般而言，其为结核分枝杆菌复合物成员的任何分枝杆菌属物种都可以用于本发明的组合物和方法中。对于待治疗的相应宿主物种和分枝杆菌类型相关疾病选择特定物种或物种组合。因此，在人中引起疾病的分枝杆菌包括例如鸟胞内分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鼠麻风分支杆菌、副结核分枝杆菌、溃瘍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、蟾分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、产鼻疽分枝杆菌、黄色分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、草分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌、猿分枝杆菌、抗热分支杆菌、和蟾分枝杆菌。分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、白喉分枝杆菌、细胞内分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鼠麻风分支杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌，其为M tb复合物成员的合适的分枝杆菌属物种包括:牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和结核分枝杆菌。遗传上相似的分枝杆菌包括卡内蒂分枝杆菌和海洋分枝杆菌。
[0089]另外的合适细菌包括例如橙黄弗拉托菌(Acetobacter aurantius)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii )、衣氏放线菌(Actinomyces israelii )、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、^瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium c aulinodans)、维捏兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、无形体属(Anaplasma)、吞卩遼细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthracis)、短芽抱杆菌(Bacillus brevis)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆
【权利要求】
1.包含被照射的微生物物种的药物组合物，其中所述微生物物种包括处于预定代谢状态的细胞。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述预定代谢状态通过营养剥夺、极端温度、铁可用性、好氧生长、厌氧生长、微量需氧、氧化胁迫、暴露于一氧化碳、改变的pH、营养素的可用性、操纵的细胞群体密度、抗生素存在或这些状态中的两种或更多种的组合触发。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述分枝杆菌属物种使用照射例如Y照射灭活。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物含有被照射的细菌或其细胞裂解产物，其中施用是肠胃外、静脉内、皮下、真皮内或肌内的，作为疫苗接种或治疗方案的部分。
5.权利要求1的药物组合物，其中多于90%的所述分枝杆菌细胞处于所述预定状态。
6.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物是雾化的且配制用于鼻内、粘膜或肺内递送至哺乳动物宿主，由此用于深肺穿透的粒子大小小于7微米。
7.权利要求1的药物组合物，其进一步包含佐剂、toll样受体或模式识别受体激动剂、铝盐或皂苷。
8.权利要求1的药物组合物，其进一步包含治疗有效量的卡介苗(BCG)。
9.增强受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1的组合物。
10.权利要求9的方法，其中所述微生物物种是以IO2-1O12分枝杆菌属物种的剂量施用的分枝杆菌。`
11.权利要求9的方法，其中所述灭活的分枝杆菌属物种包括分枝杆菌细胞或细胞裂解产物。
12.包含被照射的布鲁杆菌属微生物物种的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于使用渗透递送装置或组合物基质经阴道、直肠或胃肠道粘膜递送至哺乳动物宿主，并且其中当递送至所述宿主时，所述组合物包含免疫刺激剂量。
13.权利要求12的药物组合物，其包含用于胃肠道递送的药学可接受的载体。
14.权利要求12的药物组合物，其中所述灭活的物种细胞作为饲料方案的部分递送，或与基于专门植物的疫苗或种子作物例如稻、玉蜀黍或大豆结合递送。
15.权利要求12的药物组合物，其中所述灭活的物种细胞以适合于胃递送的形式提供，使用增强胃释放的PH敏感性聚合物、用于胃潴留和释放的粘膜粘着剂聚合物、或胃潴留系统。
16.权利要求12的药物组合物，其中所述灭活的物种细胞以适合于肠递送的形式提供，使用抵抗胃溶出的PH敏感性聚合物、用于控制释放的膨胀/胶凝HG、或作为渗透压驱动的片剂或装置。
17.权利要求12的药物组合物，其中所述灭活的物种细胞以适合于结肠递送的形式提供。
18.权利要求12的药物组合物，其进一步包含可通过结肠细菌降解的组合物。
19.权利要求12的药物组合物，其中结肠细菌包括一种或多种活性偶氮还原酶、酯酶、酰胺酶、葡糖苷酶或葡糖苷酸酶。
20.权利要求12的药物组合物，其中所述灭活的物种细胞以适合于结肠递送的形式提供，使用以大大超过胃和肠过渡时间的时间释放的渗透或膨胀系统。
21.权利要求12的药物组合物，其中所述灭活的物种细胞用优先在结肠中降解的合适聚合物进行包被。
22.权利要求12的药物组合物，其中所述组合物用pH敏感性聚合物进行包被。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述pH敏感性聚合物是尤特奇L100、尤特奇S100、尤特奇L 30 D、尤特奇FS 30 D、尤特奇L 100-55、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基乙基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基乙基纤维素邻苯二甲酸酯50、羟丙基乙基纤维素邻苯二甲酸酯55、偏苯三酸乙酸纤维素或邻苯二甲酸乙酸纤维素。
24.权利要求12的药物组合物，其中所述渗透递送使用RoseNelson泵、HiguchiLeeper泵、Higuchi Theeuwes泵、初级渗透泵、多室渗透泵、0R0S-CT、多微粒延迟释放系统、液体口腔渗透系统、夹心渗透片剂、单片渗透系统、渗透爆炸渗透泵、或用于延迟释放的伸缩胶囊。
25.权利要求12的药物组合物，其进一步包含治疗有效量的卡介苗。
26.权利要求9的方法，其进一步包括就在治疗或预防克罗恩氏病中的有效性测试所述组合物。
27.权利要求9的方法，其进一步包括就在治疗或预防布鲁杆菌病中的有效性测试所述组合物。
28.权利要求9的方法，其进一步包括就治疗或预防约内氏病测试所述组合物。
29.药物组合物，其包含配制用于鼻内、粘膜或肺内递送至哺乳动物宿主的免疫有效剂量的被照射的产脓链球菌。
30.权利要求29的药物组合物，其包含一个或多个产脓链球菌血清型。
31.治疗或预防链球菌属感染的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效剂量的权利要求33的组合物。
32.权利要求29的方法，其中所述组合物与灭活的分枝杆菌属物种或另一种佐剂一起施用。
33.药物组合物，其包含维生素D、维甲酸或没食子儿茶素-3-没食子酸酯与分枝杆菌、非传染性微生物、灭活的分枝杆菌(例如经由照射)或微生物颗粒，其中所述组合物配制用于鼻内、阴道、直肠、粘膜或肺内递送至哺乳动物宿主，并且其中当递送至所述宿主时，所述组合物包含免疫刺激剂量。
34.权利要求33的药物组合物，其包含骨化二醇和酶25-羟基维生素D31- α -羟基化酶、维甲酸和/或没食子儿茶素-3-没食子酸酯，其中所述组合物配制用于鼻内、阴道、直肠、粘膜或肺内递送至哺乳动物宿主，并且其中当递送至所述宿主时，所述组合物包含免疫刺激剂量。
35.权利要求33的药物组合物，其中所述维生素D、维甲酸和/或没食子儿茶素-3-没食子酸酯与葡萄糖、山梨糖醇或乳糖一起施用。
36.权利要求33的药物组合物，其进一步包含合成形式的维生素D、维甲酸和/或没食子儿茶素-3-没食子酸酯， 其中所述组合物配制用于鼻内、阴道、直肠、粘膜或肺内递送至哺乳动物宿主，和 其中当递送至所述宿主时，所述组合物包含免疫刺激剂量。
37.权利要求1的药物组合物，其进一步包含药学可接受的载体且配制用于粘膜递送。
38.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物是冻干的。
39.一种气溶胶或喷雾剂包装，其包含配置用于鼻或肺递送的权利要求1的药物组合物。
40.权利要求29的药物组合物，其进一步包含葡萄糖、山梨糖醇或乳糖。
41.权利要求9的方法，其中所述组合物预防或治疗上施用于动物模型。
42.权利要求37的方法，其中所述动物模型是小鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、牛、非人灵长类动物或人。
43.使用权利要求1的组合物作为佐剂或免疫刺激剂的方法，所述方法包括给没有明显分枝杆菌感染的哺乳动物受试者施用雾化的分枝杆菌属物种的剂量，其足以增强所述受试者中针对抗原的免疫应答。
44.权利要求书缺44.
45.治疗或预防动物受试者中的哮喘的方法，其包括给有此需要的受试者施用权利要求I的组合物。
46.治疗或预防受试者中的癌症的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的权利要求I的组合物。
47.权利要求1 的药物组合物，其中所述微生物物种是雾化的。
【文档编号】A61K31/59GK103781487SQ201280030127
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年4月19日 优先权日:2011年4月20日
【发明者】J.费希尔 申请人:米科生物公司