DNA构建物 转化或转染入宿主细胞中，每种载体编码不同的衣壳蛋白。或者，可以使用具有在共享启动 子或多个单独启动子控制下的多个衣壳基因的单一载体。在适宜的情况中，还可以将IRES 元件掺入载体。使用此类表达策略，可以共纯化共表达的衣壳蛋白，用于后续VLP形成，或 者可以自发形成多价VLP，然后可以纯化它们。
[0060] 一种用于生成多价VLP的优选工艺包括制备来自不同诺如病毒基因型的VLP衣壳 蛋白或衍生物，诸如VPl蛋白，混合所述蛋白质，并组装所述蛋白质以生成多价VLP。在混合 之前，VPl蛋白可以是粗制提取物的形式，部分纯化的或纯化的。可以将不同基因小组的组 装好的单价VLP解组装，混合到一起，并再组装成多价VLP。优选的是，在组合之前，所述蛋 白质或VLP是至少部分纯化的。任选的是，可以在组装之后进一步纯化多价VLP。
[0061] 合适的是，本发明的VLP是通过VLP的解组装和再组装而制备的，以提供同质的和 纯的VLP。在一个实施方案中，可以通过将两种或更多种VLP解组装，接着在再组装之前的 任何合适点组合解组装的VLP成分来制备多价VLP。当VLP自所表达的VPl蛋白自发形成 时，如例如一些酵母菌株中发生的，这种办法是合适的。在VPl蛋白的表达不引起自发VLP 形成的情况中，可以在组装成VLP之前组合VPl蛋白或衣壳体的制备物。
[0062] 在使用多价VLP的情况中，优选的是，将VLP的各成分以它们在最终混合VLP中的 期望比例混合。例如，相同量的自诺沃克和休斯顿病毒（或其它诺如病毒株）部分纯化的 VPl蛋白的混合物提供含大致相等量的每种蛋白质的多价VLP。
[0063] 包含多价VLP的组合物可以通过本领域已知的解决方案来稳定，诸如WO 98/44944 ;W0 00/45841，通过述及收入本文。
[0064] 在VPl和VP2蛋白或衍生物之外，本发明的组合物可包含其它蛋白质或蛋白质片 段。其它蛋白质或肽也可以与本发明的组合物共施用。任选的是，组合物也可以与非诺如 病毒抗原一起配制或共施用。合适的是，这些抗原能提供针对其它疾病的保护。
[0065] VPl蛋白或功能性蛋白质衍生物合适地能够形成VLP，而且VLP形成可通过标准技 术来评估，诸如例如电子显微术和动态激光散射。
[0066] 抗原制备
[0067] 本发明的抗原性分子可以通过自它们天然存在于其中的生物体分离和纯化来制 备，或者它们可以通过重组技术来制备。优选的是，自昆虫细胞诸如Sf9或H5细胞制备诺 如病毒VLP抗原，尽管也可以使用任何合适的细胞，诸如大肠杆菌（E. coli)或酵母细胞，例 如酿酒酵母/啤酒糖酵母（S. cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母（S. pombe)、巴斯德毕赤氏酵母 (Pichia pastori)或其它毕赤氏酵母表达系统，哺乳动物细胞表达诸如CHO或HEK系统。 当通过重组方法或通过合成来制备时，可以对构成肽的氨基酸进行一处或多处插入、缺失、 倒位或取代。优选以基本上纯的状态使用上述每一种抗原。
[0068] 在昆虫细胞培养物中生成诺如病毒VLP的规程先前已经披露于美国专利 No. 6, 942, 865,通过述及完整收入本文。简言之，克隆含有病毒衣壳基因（0RF2)和次要结 构基因（0RF3)的来自基因组3'端的cDNA。自所克隆的cDNA构建携带病毒衣壳基因的重 组杆状病毒。在Sf9或H5昆虫细胞培养物中生成诺如病毒VLP。
[0069] 佐剂
[0070] 本发明进一步提供了包含供与诺如病毒抗原一起使用的佐剂的组合物。大多 数佐剂含有设计用于保护抗原免于快速代谢的物质（诸如氢氧化铝或矿物油）和免 疫应答的刺激物（诸如百日咳博德特氏菌（Bordatella pertussis)或结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质）。合适的佐剂可通过商业途径获得，例如 弗氏不完全佐剂和完全佐剂（Pifco Laboratories，Detroit，Mich.) ;Merck 佐剂 65 (Merck and Company, Inc.，Rahway, N. J.);错盐，诸如氢氧化错凝胶（明巩）或磷酸错；妈、铁或锌 的盐；酰化酪氨酸酰化糖的不溶性悬浮液；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降 解微球体；和Quil A。
[0071] 合适的佐剂还包括但不限于toll样受体（TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、 合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽（MDP)衍生物、CpG 寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、Cochleates、聚（丙交 酯-共-乙交酯）（PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、和脂质体。优选的是，佐剂是细菌衍生 的外毒素。刺激Thl型应答的佐剂也是优选的，诸如3DMPL或QS21。
[0072] 单磷酰基脂质A(MPL)，一种来自沙门氏菌（Salmonella)的脂质A无毒衍生物， 是已经开发成疫苗佐剂的一种有力的TLR-4激动剂（Evans et al. 2003)。在临床前鼠研 宄中，鼻内MPL显示出增强分泌性以及系统性体液应答（Baldridge et al. 2000 ;Yang et al. 2002)。还在超过120, 000名患者的临床研宄中证明了它作为疫苗佐剂是安全且有效 的（Baldrick et al.，2002 ;2004)。MPL经由TLR-4受体刺激对先天免疫的诱导，并因此能 够引发针对多种感染性病原体的非特异性免疫应答，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌二 者、病毒、和寄生物（Baldrick et al. 2004 ;Persing et al. 2002)。在鼻内配制剂中包括 MPL应当提供对先天应答的快速诱导，自病毒挑战（challenge)引发非特异性免疫应答，同 时增强由疫苗的抗原性成分产生的特异性应答。
[0073] 因而，在一个实施方案中，本发明提供了包含单磷酰基脂质A (MPL?)或3 De-O-酰化单磷酰基脂质A (3D-MPL? )(作为适应性和先天性免疫的增强剂）的组合物。 在化学上，3D-MPL?.是具有4、5或6条酰化链的3 De-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。 3 De-O-酰化单磷酰基脂质A的一种优选形式披露于欧洲专利0 689 454 Bl(SmithKline Beecham Biologicals SA)，通过述及收入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了包含 合成脂质A、脂质A模拟物或类似物诸如BioMira的PET脂质A、或设计用于像TLR-4激动 剂那样发挥功能的合成衍生物的组合物。
[0074] 本领域技术人员会很好地理解术语"有效佐剂量"或"佐剂的有效量"，而且包括一 种或多种佐剂能够刺激针对所施用抗原的免疫应答的量，即提高针对所施用抗原组合物的 免疫应答的量，如就洗鼻液中的IgA水平、血清IgG或IgM水平、或B和T细胞增殖所测量 的。免疫球蛋白水平的合适有效升高包括超过5 %、优选超过25 %、特别是超过50 %，如与 没有任何佐剂的相同抗原组合物相比。
[0075] 投递剂
[0076] 本发明还提供了包含功能为增强抗原摄取、提供贮存效应、或延长抗原在投递部 位的保留时间（例如延迟抗原的排出）的投递剂的组合物。这样的投递剂可以是生物粘着 剂。具体而言，生物粘着剂可以是粘膜粘着剂，诸如壳聚糖、壳聚糖盐、或壳聚糖碱（例如谷 氨酸壳聚糖）。
[0077] 壳聚糖，一种自甲壳类的壳中的几丁质衍生的带正电荷的线性多糖，是用于上皮 细胞和它们的覆盖粘液层的生物粘着剂。用壳聚糖配制抗原延长它们与鼻膜接触的时 间，由此依靠IC存效应提高摄取（Iliumetal.2001 ;2003;Davisetal.1999;Baconet al.2000;vanderLubbenetal.2001 ;2001;Limetal.2001)。已经在动物模型和人体二 者中，作为用于数种疫苗的鼻投递系统测试了壳聚糖，包括流感、百日咳和白喉（Iliumet al.2001 ；2003；Baconetal.2000；Jabbal-Gilletal.1998；Millsetal.2003；McNeela etal.2004)。在这些试验中，壳聚糖显示出增强系统性免疫应答至与胃肠外疫苗接种等同 的水平。另外，还在粘膜分泌中测量到显著的抗原特异性IgA水平。如此，壳聚糖能大大增 强鼻疫苗的效力。此外，由于它的物理特征，壳聚糖特别适合于配制成粉末的鼻内疫苗（van derLubbenetal.2001;Miksztaetal.2005;Huangetal.2004)〇
[0078] 因而，在一个实施方案中，本发明提供了适应鼻内施用的抗原性组合物或疫苗组 合物，其中所述组合物包括抗原和有效量的佐剂。在优选的实施方案中，本发明提供了 包含与至少一种投递剂（诸如壳聚糖）和至少一种佐剂（诸如MPL?、CPG、咪喹莫特 (imiquimod)、gardiquimod、或合成脂质A或脂质A模拟物或类似物）组合的诺如病毒抗原 (诸如诺如病毒VLP)的抗原性组合物或疫苗组合物。
[0079] 壳聚糖的分子量可以介于IOkDa和800kDa之间，优选介于IOOkDa和700kDa之 间且更优选介于200kDa和600kDa之间。壳聚糖在组合物中的浓度通常会高至约80 % (界/￥)，例如5%、10%、30%、50%、70%或80%。壳聚糖优选是至少75%脱乙酰化的，例如 80-90 %，更优选82-88 %脱乙酰化的，具体的例子是83 %、84%、85 %、86 %和87 %脱乙酰 化。
[0080] 疫苗和抗原性配制剂
[0081] 本发明的组合物可配制成供作为疫苗或抗原性配制剂来施用。如本文中所使用 的，术语"疫苗"指如下的配制剂，其含