凝血酶结合抗体分子及其用途
【专利摘要】本发明涉及分离的抗体，其识别凝血酶的exosite1表位，并选择性抑制凝血酶，而不促进出血。这些抗体分子可用于治疗和预防血栓形成、栓塞及其他由凝血酶介导的病症。
【专利说明】凝血酶结合抗体分子及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及抑制凝血酶的抗体分子。
【背景技术】
[0002]血液凝固是防止受损血管出血(止血)的重要过程。然而，阻塞血液流经血管(血栓形成)或脱落后沉积在身体内别处的血管(血栓栓塞)的血凝块对健康是严重的威胁。
[0003]有很多抗凝血疗法可供治疗病理性血液凝固。这些疗法的通病是增加的出血风险(Mackman (2008)Nature451 (7181):914-918)。许多抗凝剂治疗窗口狭窄，介于阻止血栓形成和引起出血的剂量之间。该窗口经常进一步受限于个体病人中的反应差异。
【发明内容】
[0004]本发明涉及预料不到的发现，即识别凝血酶exositel表位的抗体分子选择性抑制凝血酶，而不促进出血。这些抗体分子可用于治疗和预防血栓形成、栓塞及其他由凝血酶介导的病症。
[0005]本发明一方面提供了分离的抗体分子，其特异性结合凝血酶的exositel。
[0006]分离的抗exositel抗体分子可在体内抑制凝血酶，而不促进或大幅促进出血(bleeding)或溢血(haemorrhage),即该抗体分子不抑制或大幅抑制对血管损伤的正常生理反应(即止血)。例如，止血不会被抗体分子抑制或会被其最低程度地抑制(即微小程度地抑制，不会影响病人的健康或需要进一步干预)。出血不会被抗体分子增加或会被其最低程度地增加。
[0007]exositel (又名“阴离子结合exositel”和“纤维蛋白原识别exosite”)是凝血酶分子上典型的次级结合位点(参见例如James A.Huntington, 2008, StructuralInsights into the Life History of Thrombin,in Recent Advances in Thrombosisand Hemostas i s2008, editors ； K.Tanaka and E.W.Davi e, Springer JapanKK, Tokyo, pp.80-106)。exositel形成于成熟凝血酶中，但不形成于凝血酶原中(参见例如Anderson et al (2000)JBC277516428-16434)。
[0008]exositel参与识别凝血酶底物，例如纤维蛋白原，但远离催化活性位点。多种凝血酶结合因子结合exositel,包括抗凝十二肽水蛭原(hirugen) (Naski et al1990JBC26513484-13489)、因子V、因子VII1、血栓调解蛋白(蛋白C和TAFI激活的辅因子)、纤维蛋白原、PARl和纤维蛋白(因子XIII激活的辅因子)。
[0009]抗exositel抗体可与成熟的人凝血酶exositel结合。人前凝血酶原(preprothrombin)的序列如SEQ ID NO:1所示。人凝血酶原具有SEQ ID NO:1的44-622残基的序列。成熟的人凝血酶原具有314-363残基(轻链)和364-622残基(重链)的序列。
[0010]在一些实施方案中，抗exositel抗体也可结合来自其他物种的成熟凝血酶的exositel。来自其他物种的凝血酶序列是本领域已知的,并可在公共数据库如Genbank中获得。来自其他物种的凝血酶序列中的对应残基可利用序列比对工具很容易地鉴别。
[0011]本文所示凝血酶残基的编号方案是本领域常规的，基于糜蛋白酶模板(Bode W etal EMBO J.1989Nov ；8(11):3467-75)。凝血酶具有相对于糜蛋白酶的插入环，用小写字母顺序标出。
[0012]成熟的人凝血酶exositel在SEQ ID NO:1中以下划线标出，可包括如下残基:M32、F34、R35、K36、S36a、P37、Q38、E39、L40、L65、R67、S72、R73、T74、R75、Y76、R77a、N78、E80、K81、I82、S83、M84、K109、K110、K149e、G150、Q151、S153 和 V154。在一些实施方案中，位于这些残基中任一个附近(即0.5nm或Inm内)的其他凝血酶残基也可被认为是exositel的部分。
[0013]抗exositel 抗体可结合表位，其包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20或多于20个exositel残基。优选地，抗exositel抗体结合全部由exositel残基组成的表位。
[0014]例如，抗exositel抗体可结合表位，其包含选自人凝血酶的M32、F34、S36a、P37、Q38、E39、L40、L65、R67、R73、T74、R75、Y76、R77a、182 和 Q151 的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15或全部16个残基，或来自其他物种的凝血酶的等价残基。在一些优选实施方案中，表位可以包含凝血酶残基Q38、R73、T74、Y76和R77a以及任选地一个或多个其他残基。
[0015]本文所述的抗exositel抗体分子特异性针对凝血酶exositel,并且相对于其他表位，例如来自成熟凝血酶之外的哺乳动物蛋白的表位，该抗体与该表位以高亲和力结合。例如，抗exositel抗体分子对凝血酶exositel的亲和力比对其他表位高至少500倍,至少1000倍或至少2000倍。
[0016]优选地,本文所述的特异性针对exositel的抗体分子可以结合成熟凝血酶,但与凝血酶原不结合或基本不结合。
[0017]不受任何理论约束,抗exositel抗体可能无法接近止血性血块核心内的凝血酶，因此无法通过破坏血管损伤位点的正常凝血酶功能影响止血。然而，由于抗exositel抗体仍然结合血块表面上和外壳里的凝血酶，血栓形成被阻止，即非止血性血块蔓延被阻止。
[0018]抗exositel抗体分子对exositel的解离常数可小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于1nM或小于InM。例如，抗体分子对exositel的亲和力可以是0.1_50ηΜ,例如0.5-10nM。适合的抗exositel抗体分子对凝血酶exositel的亲和力可以是例如约InM。
[0019]抗exositel抗体分子的结合动力学和亲和力(以平衡解离常数Kd表示)可以使用标准技术例如表面离子共振，如使用BIAcore分析来确定。
[0020]本文所述的抗exositel抗体分子可以是免疫球蛋白或其片段，并且可以是天然或者部分或全部合成产生的例如重组分子。
[0021]抗exositel抗体分子可以包括包含抗体的抗原结合位点的任意多肽或蛋白，其包括Fab、Fab2, Fab3>双链抗体、三链抗体、四链抗体、微小抗体和单域抗体，包括纳米抗体，以及任意亚型或子类的全抗体。抗体分子及其构建和使用的方法在例如Ho 11 i ger&Hudson, Nature B1technology23 (9): 1126-1136 (2005)中有记载。
[0022]在一些优选实施方案中,抗exositel抗体分子可以是全抗体。例如,抗exositel抗体分子可以是IgG、IgA、IgE或IgM或任意亚型子类,尤其是IgGl和IgG4。抗exositel抗体分子可以是单克隆抗体。在其他优选实施方案中，抗exositel抗体分子可以是抗体片段。
[0023]抗exositel抗体分子可以是嵌合的、人源化的或人抗体。
[0024]本文所述的抗exositel抗体分子可以是分离的，即不含污染物，例如能够结合其他多肽的抗体和/或血清成分。尽管多克隆抗体也可使用，但出于某些目的，优选单克隆抗体。
[0025]抗exositel抗体分子可以使用本领域中的标准技术获得。生产抗体的方法包括用蛋白或其片段免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子、马、山羊、绵羊或猴子)。抗体可用任意的本领域已知的多种方法从免疫动物获得，并进行筛选，优选通过抗体与感兴趣的抗原的结合。例如，可用免疫印迹技术(Western blotting techinques)或免疫沉淀法(Armitage et al., 1992, Nature357:80-82)。从动物中分离抗体和/或抗体产生细胞后可伴随处死动物的步骤。
[0026]作为用肽免疫哺乳动物的替代或补充，特异性针对蛋白的抗体可由重组产生的表达免疫球蛋白可变区的文库获得，例如使用λ噬菌体或丝状噬菌体，其在表面展示功能性免疫球蛋白结合域，例如参见W092/01047。该文库可以是天然的，即由获自未经任何蛋白(或片段)免疫的有机体的序列构建，或可以是使用获自已经接触感兴趣的抗原的有机体的序列构建的文库。
[0027]其他抗exositel抗体分子可以通过筛查病人血清中结合exositel的抗体来鉴定。
[0028]在一些实施方案中，抗凝血酶抗体分子可通过任意便捷的方式生产，例如上述方法，继而筛选与成熟凝血酶的差异结合(相对于带有exositel突变的凝血酶、Y凝血酶(R75和R77a处的自溶导致exositel缺陷)或凝血酶原)。适合的筛选方法是本领域熟知的。
[0029]抗体，其相对于非凝血酶蛋白、带有exositel突变的凝血酶、Y凝血酶或凝血酶原，显示出对成熟凝血酶的增强结合，例如抗体，其结合成熟凝血酶，但不结合带有exositel突变的凝血酶、Y凝血酶或凝血酶原，可被鉴定为抗exositel抗体分子。
[0030]产生和/或分离后，可检测抗exositel抗体分子的生物活性。例如，可确定抗体分子抑制凝血酶底物、辅因子或抑制剂结合和/或凝血酶切割的能力，和/或可确定抗体分子抑制血栓形成、而不促进出血的能力。
[0031]适合的抗体分子的活性可使用纤维蛋白原凝结或凝血酶时间分析进行检测。适合的分析是本领域熟知的。
[0032]抗体分子对凝固和出血的效果可用标准技术确定。例如，抗体分子对血栓形成的效果可在动物模型，例如血管中带有氯化铁诱导的血块的小鼠模型中确定。对止血的效果也可在动物模型中确定，例如通过测量小鼠尾巴出血。
[0033]抗体分子通常包含抗原结合区，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，尽管也有仅包含重链可变区(VH)的抗原结合区(例如骆驼或鲨鱼抗体)。
[0034]每个VH和VL区通常包含三个由框架区间隔的互补决定区(OTR)，负责抗原结合。
[0035]在一些实施方案中，与exositel的结合可完全或大体通过抗exositel抗体分子的VHCDR3进行。
[0036]例如，抗exositel抗体分子可包含VH区，其包含具有SEQ ID NO:5序列或带有I或多个，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:5序列的HCDR3。取代可以是保守取代。在一些实施方案中，HCDR3可以包含SEQ ID NO:5位点4_9的氨基酸残基(SEFEPF)，或更优选地，SEQ ID NO: 5位点2和4_10的氨基酸残基(D和SEFEPF)，SEQID NO:5中一个或多个其他位点具有取代、缺失或插入。HCDR3可以是抗体分子与凝血酶exositel相互作用的唯一区域,或大体上的唯一区域。因此HCDR3可决定抗体分子对凝血酶exositel区的特异性和/或亲和力。
[0037]抗exositel抗体分子的VH区可另外包含具有SEQ ID NO: 4序列或带有I或多个，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID N0:4序列的HCDR2。在一些实施方案中，HCDR2可以包含SEQ ID N0:4位点3-7的氨基酸残基(DPQDG)，或SEQ ID N0:4位点2和4-7的氨基酸残基(L和PQDG)，SEQ ID NO:4中一个或多个其他位点具有取代、缺失或插入。
[0038]抗exositel抗体分子的VH区可进一步包含具有SEQ ID NO:3序列或带有I或多个，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:3序列的HCDRl。在一些实施方案中，HCDRl可以包含SEQ ID N0:3位点5的氨基酸残基T，SEQ ID NO:3中一个或多个其他位点具有取代、缺失或插入。
[0039]在一些实施方案中，抗体分子可包含VH区，其包含分别具有序列SEQ IDN0:3、4和5的HCDRl、HCDR2和HCDR3。例如，抗体分子可包含VH区，其具有序列SEQ ID NO: 2或在SEQ10勵:2中具有一或多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代、缺失或插入的序列 SEQ ID NO: 2。
[0040]抗exositel抗体分子可进一步包含VL区，例如包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL区，所述LCDRl、LCDR2和LCDR3分别具有序列SEQ ID N0:7、8和9，或分别各自具有一个或多个，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的序列SEQ IDN0:7、8和9。取代可以是保守取代。例如，抗体分子可包含VL区，其具有序列SEQ ID NO:6或在SEQ ID NO:6中具有一个或多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代、缺失或插入的序列SEQ IDN0:6。
[0041]在一些实施方案中，VL区可包含Tyr49。
[0042]抗exositel抗体分子可例如包含一或多个氨基酸取代、缺失或插入,其改善该抗体的一或多个性能，例如亲和力、功能半衰期、结合和解离速率。
[0043]用于在⑶R、抗体VH或VL区和抗体的氨基酸序列中弓丨入取代、缺失或插入的技术是本领域常用的。可制备变体序列，其具有可能或不能预期对活性具有最低或有益效果的取代、缺失或插入，并检测其结合凝血酶exositel的能力和/或任何其他期望的性能。
[0044]在一些实施方案中，抗exositel抗体分子可包含VH区,其包含分别具有序列SEQID N0:3、4和5的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及VL区，其包含分别具有序列SEQ ID N0:7、8和 9 的 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3。
[0045]例如，VH和VL区可分别具有序列SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:6 ;或者可具有各自包含一或多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:2SEQ ID NO:6的氨基酸序列。取代可以是保守取代。
[0046]在一些实施方案中，抗体可包含一或多个去除糖基化位点的取代、缺失或插入。例如，SEQ ID NO:6VL区内的糖基化位点可经在N28或S30引入取代而突变掉。
[0047]抗exositel抗体分子可为如上所述的任意形式。在一些优选实施方案中，抗exositel抗体分子可以是全抗体,例如IgG(如IgGl或IgG4)、IgA、IgE或IgM0
[0048]本发明的抗exositel抗体分子可以是与上述抗体分子竞争结合exositel的抗体分子，例如抗体分子，其
[0049](i)结合凝血酶exositel且
[0050](ii)包含 SEQ ID NO: 2 的 VH 区和 / 或 SEQ ID NO: 6 的 VL 区;SEQ ID NO: 5 的 HCDR3 ；分别为 SEQ ID N0:3、4、7、8 或 9 的 HCDRU HCDR2、LCDRU LCDR2 或 LCDR3 ;包含分别为序列SEQ IDN0:3、4和5的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH区;和/或包含分别为序列SEQ ID NO: 3、4和5的HCDRUHCDR2和HCDR3的VH区以及包含分别为序列SEQ ID N0:7、8和9的LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 的 VL 区。
[0051]抗体分子间的竞争可以很容易地在体外分析，例如使用ELISA和/或用特异性报告分子标记一个抗体分子，其可在一或多个其他未标记的抗体分子存在时被检测，从而能够鉴定结合相同或交叉表位的抗体分子。此类方法是本领域技术人员熟知的。因此，本发明另一方面提供了抗体分子，其包含与抗体分子竞争结合的抗体的抗原结合位点，例如抗体分子，其包含VH和/或VL区，结合凝血酶exositel的上述亲本抗体的⑶R如HCDR3或CDR组。适合的抗体分子可包含抗体的抗原结合位点，其与抗体的抗原结合位点竞争结合exositel，其中所述抗体的抗原结合位点由VH区和VL区组成，并且其中VH和VL区包含分别为SEQ ID N0:3、4和5的HCDRl、HCDR2和HCDR3序列以及分别为SEQ ID N0:7、8和9的LCDRl、LCDR2 和 LCDR3 序列，例如 SEQ ID NO: 2 和 6 的 VH 和 VL 区。
[0052]本文所述的抗exositel抗体分子可抑制凝血酶结合因子的结合，包括结合exositel的因子。例如，抗体分子可竞争性或非竞争性抑制fV、fVII1、血栓调节蛋白、纤维蛋白原或纤维蛋白、PARl和/或水蛭原和水蛭素类似物中的一或多个与凝血酶结合。
[0053]本文所述的抗exositel抗体分子可以抑制凝血酶的一种或多种活性。例如，抗exositel抗体分子可抑制一种或多种凝血酶底物，例如纤维蛋白原、血小板受体PAR-1和凝血因子FVIII的水解切割。例如，抗体分子与凝血酶的结合会导致在纤维蛋白以及血栓调节蛋白蛋白C和/或TAFI存在时，纤维蛋白原、PAR-1、凝血因子FVIII和/或其他凝血酶底物例如因子V、因子XIIII的水解降低至少5倍、至少10倍或至少15倍。在一些实施方案中，抗exositel抗体分子与凝血酶的结合会导致检测不到凝血酶对凝血酶底物的切割。
[0054]测量凝血酶活性的技术，例如测量凝血酶底物在体外的水解是本领域的标准技术，并在本文中记载。
[0055]抗exositel抗体分子可进一步被化学修饰,如聚乙二醇化,或整合入脂质体所改性，从而改善其药物性能，例如增加体内半衰期。
[0056]抗exositel抗体分子对凝固和出血的效果可用标准技术确定。例如,可测定抗体对血栓形成模型的效果。适合的模型包括小鼠模型血管中的氯化铁血块诱导，接着通过尾巴出血检测正常的止血。其他适合的血栓形成模型是本领域熟知的(参见例如Westricket al ATVB (2007)27:2079-2093)。
[0057]抗exositel抗体分子可包含在具有药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
[0058]药学上可接受的赋形剂可以是融入药物组合物的化合物或化合物的组合，其不激发次级反应，并例如有助于抗exositel抗体分子的施用，增加其在体内的有效期和/或效力，或增加其在溶液中的溶解度。这些药学上可接受的载体是众所周知，并会被本领域技术人员根据抗exositel抗体分子的施用方式使用。
[0059]在一些实施方案中，抗exositel抗体分子可以冻干形式提供，在施用前重溶。例如，冻干的抗体分子在向个体施用前，可在无菌水中重溶并与生理盐水混合。
[0060]抗exositel抗体分子通常以药物组合物的方式施用，其可包含除抗体分子外的至少一种成分。因此，除抗抗体分子外，药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其他本领域技术人员熟知的材料。此类材料应当是无毒的，并且不应干扰抗exositel抗体分子的效力。载体或其他材料的准确性质将取决于给药途径,其可以经丸剂、输液、注射或任何其他适合的途径，如下文所讨论。
[0061]对于不经肠道，例如皮下或静脉给药，例如通过注射，包含抗exositel抗体分子的药物组合物可以是不经肠道可接受的水溶液的形式，其不含热原，并具有适合的pH、等渗性和稳定性。具有本领域相关技术的人员完全能够用例如等渗载体，如氯化钠注射液、林格注射液O、乳酸化林格注射液制备适合的溶液。防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂可根据需要使用，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵(Octadecyldimethylbenzylammonium chloride);六甲氯铵(hexamethonium chloride);氯化苯甲经铵(benzalkoniumchloride);节索氯铵(benzethonium chloride);苯酹、丁醇或节醇；对轻苯甲酸烷基酯(alkyl paraben),如对轻苯甲酸甲基或丙基酯；邻苯二酹；间苯二酹；环己醇；3’ _戍醇和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯眺咯烧酮(polyvinylpyrrolidone);氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA ;糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子如钠离子；金属复合物(如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇(PEG)。
[0062]包含抗exositel抗体分子的药物组合物可单独给药,或与其他治疗联合,根据待治疗的病症同时或顺序给药。
[0063]本文所述的抗exositel抗体分子可用于治疗人或动物体的方法，包括预防性(prophylactic or preventative)治疗(如在个体中病症发作前治疗，以降低个体发病的风险；推迟其发作；或减小其发作后的严重性)。治疗方法可包括向有需要的个体施用抗exositel抗体分子。
[0064]给药通常是“治疗有效量”的，其足以使病人受益。此益处可以至少改善至少一种症状。给药的实际用量，以及给药的速率和时间进程将取决于接受治疗的性质和严重性、接受治疗的具体哺乳动物、个体病人的临床状况、病因、组合物递送位点、给药方法、给药安排及其他医师所知的因素。治疗处方，例如剂量等的确定由全科医师和其他医生负责，并且可取决于接受治疗的症状的严重性和/或疾病的发展。抗体分子的适当剂量是本领域熟知的(Ledermann J.A.et al.(1991) Int.J.Cancer47:659-664 ；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody, Immunoconjugates and Rad1pharmaceuticals4:915-922).具体用量可在本文或Physician’s Desk Reference (2003)中指定,其适于特定类型的药物的施用。抗体分子的治疗有效量或适合剂量可通过比较其体外活性和动物模型中的体内活性来确定。由小鼠和其他测试动物推断人的有效剂量的方法是已知的。准确剂量将取决于多种因素，包括该抗体用于预防还是治疗，接受治疗的区域的尺寸和位置，抗体的准确性质(如全抗体、片段)和与抗体连接的任意可检测标签或其他分子的性质。
[0065]用于全身施用的典型的抗体剂量为100μ g至lg，用于局部施用的典型的抗体剂量为Iyg至lmg。也可以最初施用较高负荷剂量，接着施用一或多个较低剂量。通常抗体是全抗体，如IgGl或IgG4亚型。这是用于成年病人一次治疗的剂量，其可针对儿童和婴儿成比例地调整，也可按照分子量的比例对其他抗体形式进行调整。治疗可以按照医师的决定，以每天、每周两次、每周或每月的间隔重复。个体的治疗日程表可取决于抗体组合物的药代动力学和药效动力学性能、给药途径和接受治疗的病症性质。
[0066]治疗可以是周期性的，给药间隔周期可以是约两周或更久，如约三周或更久、约四周或更久、约一个月或更久、约五周或更久、或约六周或更久。例如，治疗可以是每2-4周或每4-8周一次。可以在手术前和/或后进行治疗，和/或在手术治疗或侵入性操作的解剖部位直接给药或实施。适合的剂型和给药途径如上所述。
[0067]在一些实施方案中，本文所述的抗exositel抗体分子可以由皮下注射给药。皮下注射可以使用自动注射器给药，例如用于长期预防/治疗。
[0068]在一些优选实施方案中,抗exositel抗体分子的治疗效果可持续几个半衰期,这取决于剂量。例如，单剂量抗exositel抗体分子的治疗效果可在个体中持续I个月或更久、2个月或更久、3个月或更久、4个月或更久、5个月或更久、或6个月或更久。
[0069]本文所述的抗exositel抗体分子抑制凝血酶，并可用于治疗凝血酶介导的病症。
[0070]止血是正常的凝固反应，即阻止例如受损血管的出血或溢血。止血使体内血管的出血和溢血停止。
[0071]抗exositel抗体分子可以对止血无效果，或基本无效果，即它们不促进出血或溢血。
[0072]本发明的方面提供了:本文所述的抗exositel抗体分子用于人或动物体治疗的方法；本文所述的抗exositel抗体分子用于治疗凝血酶介导的疾病的方法；本文所述的抗exositel抗体分子在制备用于治疗凝血酶介导的病症的药物中的用途；以及治疗凝血酶介导的病症的方法，包括向有需要的个体施用本文所述的抗exositel抗体分子。
[0073]本文所述的抗exositel抗体分子对凝血酶的抑制可以在对任意凝血酶介导的病症的治疗中具有临床获益。凝血酶介导的病症可以包括与凝血酶形成或活性相关的疾病。
[0074]凝血酶在止血、凝固和血栓形成中起重要作用。凝血酶介导的病症包括血栓形成病症,例如血栓形成和栓塞。
[0075]血栓形成是超出止血所需的凝固(即过度凝固)，或止血所不需的凝固(即额外止血或非止血凝固)。
[0076]血栓形成是血管腔内的血液凝固。其特征在于超出止血所需或止血不需的血块(血栓)形成。血块会阻碍血液在血管内的流通，导致医疗并发症。血块会从其形成位点脱离，在循环系统中的其他位置形成栓塞。在动脉系统中，血栓形成通常是动脉粥样硬化斑块破裂的结果。
[0077]在一些实施方案中，血栓形成可在最初的生理学止血反应，如血管内皮细胞损伤后发生。在其他实施方案中，血栓形成可在不存在任何生理学止血反应时发生。
[0078]血栓形成可在具有血栓形成内在倾向(即血栓形成倾向)的个体中发生，或在不具有血栓形成内在倾向的“正常”个体中例如应对外部刺激时发生。
[0079]血栓形成和栓塞可在循环系统内的任意血管、动脉或其他血管中发生，并可包括微血管血栓形成。
[0080]血栓形成和栓塞可与手术(术中或术后)或向病人插入外物，如冠脉支架相关。
[0081]例如，本文所述的抗exositel抗体可用于手术和其他血管接触人造表面的过程中，例如开心手术和透析。
[0082]血栓形成病症可包括血栓形成倾向、血栓性中风和冠状动脉闭塞。
[0083]适于本文所述的治疗的病人包括具有病症的病人，其中血栓形成是症状或治疗的副作用，或其呈现增加的血栓形成风险，或者相对于普通人群具有血栓形成倾向或风险增加的病人。例如，本文所述的抗exositel抗体分子也可用于治疗或预防癌症病人的静脉血栓形成，以及治疗或预防医院获得性血栓形成，其导致了 50%的静脉血栓栓塞病例。
[0084]本文所述的抗exositel抗体分子可对凝血酶介导的病症，例如血栓性病症发挥治疗或其他有益效果，而不会显著抑制或妨碍止血。例如，相对于未经治疗的个体，经抗exositel抗体分子治疗的病人中溢血的风险不会增加或显著增加。
[0085]经常规抗凝血剂，如天然及合成肝素、华法令、直接丝氨酸蛋白酶抑制剂(如阿加曲班、达比加群、阿哌沙班和利伐沙班)、水蛭素及其衍生物(如来匹卢定和比伐卢定)以及抗血小板药物(如氯吡格雷、噻氯匹定和阿昔单抗)治疗的个体会造成出血。相对于经常规抗凝血剂治疗的个体，经本文所述的抗exositel抗体分子治疗的病人出血的风险降低。
[0086]凝血酶介导的病症包括与凝血酶活性相关的非血栓形成病症，包括炎症、感染、肿瘤生长和转移、器官排斥和痴呆(血管性和非血管性的，例如阿尔茨海默病MLicari etal J Vet Emerg Crit Care (San Anton1).2009Feb ； 19 (I):11-22 ；Tsopanoglou et al EurCytokine Netw.2009Decl ；20(4):171-9)。
[0087]本文所述的抗exositel抗体分子也可用于体外检测，例如凝固分析和表征，例如在犾自病人的样品中。
[0088]抗exositel抗体分子可用于测量凝血酶产生。凝血酶产生的分析存在技术问题，因为纤维蛋白原向纤维蛋白的转化造成浑浊，从而无法使用简单的显色终点法
[0089]向血液样品中添加本文所述的抗exositel抗体分子阻止或抑制纤维蛋白的形成及浑浊，并使得凝血酶生成可用显色底物进行测量，无需脱纤维步骤。
[0090]例如，测量凝血酶生成的方法可包含在本文所述的抗exositel抗体分子存在下，使血液样品与显色凝血酶底物接触，并测量来自底物的显色信号；其中，显色信号指示样品中的凝血酶产生。
[0091]显色信号可直接测量，无需对样品进行脱纤维。
[0092]适合的底物是本领域熟知的，包括S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa)、β -Ala-Gly-Arg-对硝基苯胺双醋酸酯(β-Ala-Gly-Arg-p-nitroanilidediacetate) (Prasa,D.et al.(1997)Thromb.Haemost.78, 1215 ；Sigma Aldrich Inc)和Tos-Gly-Pro-Arg-pNa.AcOH (B1phen CS-01 (81) ；Aniara Inc OH USA)。
[0093]抗exositel抗体分子也可用于在体外循环，例如血液透析和体外膜式氧合中抑制或阻止上述血液凝固。
[0094]例如，体外或离体抑制或阻止血液凝固的方法可包含将本文所述的抗exositel抗体分子引入血液样品。血液样品可在引入抗exositel抗体之前、同时或之后引入体外循环系统，并任选地接受诸如血液透析或氧合的处理。在一些实施方案中，经处理的血液随后可被注入个体。其他实施方案提供了本文所述的抗exositel抗体分子用于抑制或阻止离体血液样品中的血液凝固的方法，以及本文所述的抗exositel抗体分子在制备用于抑制或阻止离体血液样品中的血液凝固的药物中的用途。
[0095]发明的其他方面涉及抗体分子的生产，其结合凝血酶的exositel表位，并可用于例如病理性血液凝固或血栓形成的治疗。
[0096]生产针对凝血酶的exositel表位的抗体的抗原结合域的方法，可包括:
[0097]通过在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH区的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多个氨基酸，提供作为亲本VH区的氨基酸序列变体的VH区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3、4和5 ;以及
[0098]任选地，将由此提供的VH区域与一或多个VL区组合，以提供一或多个VH/VL组合；以及
[0099]检测作为亲本VH区的氨基酸序列变体的所述VH区或VH/VL组合或它们二者的结合，以鉴定针对凝血酶的exositel表位的抗体的抗原结合域。
[0100]作为亲本VH区的氨基酸序列变体的VH区可以具有SEQ ID NO: 5的HCDR3序列或添加、缺失、取代或插入1、2、3或更多氨基酸的变体。
[0101]作为亲本VH区的氨基酸序列变体的VH区可以具有分别为SEQ IDN0:3和4的HCDRl和HCDR2序列，或添加、缺失、取代或插入1、2、3或更多氨基酸的这些序列的变体。
[0102]生产特异性结合凝血酶的exositel表位的抗体分子的方法，可包括:
[0103]提供编码VH区的起始核酸或各自编码VH区的起始核酸集合，其中一个或者多个VH区或者包含将被取代的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3，或者缺少HCDRl、HCDR2和/或HCDR3编码区；
[0104]将所述起始核酸或起始核酸集合与供体核酸组合，所述供体核酸编码分别具有氨基酸序列SEQ ID N0:3、4和5的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列或其突变氨基酸序列，这样，所述供体核酸被插入起始核酸或起始核酸集合的CDR1、CDR2和/或CDR3区中，以提供编码VH区的核酸产物集合；
[0105]表达所述产物集合的核酸以生产产物VH区；
[0106]可选地，将所述产物VH区与一或多个VL区组合；
[0107]选择结合凝血酶exositel的抗体分子，该抗体分子包含产物VH区和任选地VL区；以及
[0108]回收所述抗体分子或编码它的核酸。
[0109]适合的抗体分子成熟和优化技术是本领域熟知的。
[0110]针对凝血酶exositel表位的抗体的抗原结合域和抗体分子可如上所述进行检测。例如可确定结合凝血酶和/或抑制凝血酶底物切割的能力。
[0111]抗体分子对凝固和出血的效果可用标准技术确定。例如，可使用小鼠血管，例如股静脉或颈动脉中的氯化铁血块诱导的血栓形成模型，接着通过尾巴出血检测正常的止血。
[0112]基于本文，本发明各种进一步的方面和实施方案对本领域技术人员是显而易见的。
[0113]在说明书中提及的所有文献均通过引用而整体并入本文。
[0114]除非另有说明，本文的抗体残基按照kabat编码制编号。
[0115]本文使用的“和/或”应被理解为两个指明特征或要素中每个的明确公开，无论是否有另一特征或要素。例如“A和/或B”应变理解为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B，如同每一种在本文单独记载。除非文中另有规定，上述特征的描述和定义不限于发明的任何具体方面或实施方案，并可同等用于所述的所有方面和实施方案。因此，上述特征以所有排列组合的方式公开。
【专利附图】
【附图说明】
[0116]现在通过实施例，并参考下述附图和表格对发明的某些方面和实施方案进行说明。
[0117]图1示出IgA在人凝血酶-琼脂糖凝胶(Sepharose,商品名)柱子上的结合和洗脱。图1A示出利用pH梯度(中性到低pH，如向上的倾斜线所示)使IgA(窄峰)从凝血酶-琼脂糖凝胶柱子上洗脱的图谱。图1B示出蓝绿温和胶O显示的总IgA上样、从人凝血酶柱子上的流过物和低PH洗脱后的洗脱物。
[0118]图2示出非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)胶(SDS-PAGE),其表明 IgA 与凝血酶、但不与凝血酶原结合。在该下拉(pul l-down)分析中，在凝血酶或凝血酶原存在下，凝集素琼脂糖被用于结合IgA。继而将上清跑SDS胶。I道是大小标准,2道示出凝血酶从上清中清除,3道示出该清除依赖于IgA的存在，3道和4道示出凝血酶原不被清除，因此其不与IgA结合。
[0119]图3示出IgA存在或不存在下凝血酶对S2238切割的相对速率(即S2238水解的405nm吸光值O对时间的单斜率)。这表明IgA不结合于凝血酶的活性位点。
[0120]图4示出结合研究的结果，其表明IgA与荧光标记的十二肽水蛭原竞争结合凝血酶。
[0121]图5示出IgA对凝血酶切割S2238的影响。该分析可以评价Kd为12nM的IgA-凝血酶相互作用。
[0122]图6示出还原和非还原(ox)条件下完整IgA和Fab片段的SDS-PAGE胶。非还原IgA显示具有100-200kDa的分子量，非还原Fab具有约50kDa的分子量。
[0123]图7示出凝血酶-Fab复合物的晶体结构,其表明凝血酶exositel和Fab片段的HCDR3间的相互作用。
[0124]图8示出晶体结构的细节，其表明凝血酶exositel和Fab片段的HCDR3的特定残基之间的相互作用。
[0125]图9示出在C57BL/6小鼠股静脉损伤中FeCl3诱导的血凝块的荧光显微图像，小鼠注射FITC标记的纤维蛋白原，于2-30分钟之间拍照。施用10ul的PBS(溶剂对照)。
[0126]图10示出在C57BL/6小鼠股静脉损伤中FeCl3诱导的血凝块的荧光显微图像，小鼠注射FITC标记的纤维蛋白原和40nM (小鼠血液中的终浓度，相当于约0.6mg/Kg的剂量)抗 exositellgA(100 μ 1，溶于 PBS)。
[0127]图11示出在C57BL/6小鼠股静脉损伤中FeCl3诱导的血凝块的荧光显微图像，小鼠注射FITC标记的纤维蛋白原和80nM(小鼠血液中的终浓度，相当于约1.2mg/Kg的剂量)抗exositelIgA(100 μ I,溶于PBS),损伤位点外的区域用作对照。
[0128]图12示出在C57BL/6小鼠股静脉损伤中FeCl3诱导的血凝块的荧光显微图像，小鼠注射FITC标记的纤维蛋白原和200nM(小鼠血液中的终浓度，相当于约3mg/Kg的剂量)抗exositelIgA(100 μ I,溶于PBS),损伤位点外的区域用作对照。
[0129]图13示出在C57BL/6小鼠股静脉损伤中FeCl3诱导的血凝块的荧光显微图像，小鼠注射FITC标记的纤维蛋白原和400nM(小鼠血液中的终浓度，相当于约6mg/Kg的剂量)抗 exositellgA(100 μ 1，溶于 PBS)。
[0130]图14示出在C57BL/6小鼠股静脉损伤中FeCl3诱导的血凝块的荧光显微图像，小鼠注射FITC标记的纤维蛋白原和4μ M(小鼠血液中的终浓度，相当于约60mg/Kg的剂量)抗 exositellgA(100 μ 1，溶于 PBS)。
[0131]图15示出图9-13的荧光图像中对抗exositellgA的剂量反应的定量。
[0132]图16示出对照C57BL/6小鼠和以增加剂量的抗exositellgA处理的小鼠中尾巴出血的时间。二次平均排除异常值。
[0133]图17示出野生型雄性C57BL/6小鼠(η = 5)经尾静脉注射IgA或PBS后的尾夹分析结果。注射后15分钟，在直径3mm处剪掉尾巴，监视失血10分钟。
[0134]图18A至18D示出9周大野生型C57BL/6小鼠在以5% FeCl3损伤2分钟之前，如前注射400nM抗凝血酶IgA (血液中的终浓度，相当于约6mg/Kg的剂量)或PBS的FeCl3颈动脉闭塞模型的结果。图18A示出典型的注射PBS的小鼠的结果(20分钟内闭塞)，图18B、18C和18D示出以400nM抗凝血酶IgA处理的小鼠的结果示例(无闭塞)。
[0135]图19示出在添加20nM人凝血酶时，随着增加浓度的本发明的IgG和IgA的凝血酶时间(即混合血浆凝结)。
[0136]图20示出合成IgG与固定凝血酶(ForteB1 Octet Red仪器上)的结合。
[0137]图21示出24nMS195A凝血酶与固定IgG结合的典型Octet迹线，其示出结合相，随后是解离相。黑线是拟定(fit)。
[0138]图22示出500nM凝血酶原与载有固定IgG的表面的Octet迹线。使用图21中与凝血酶实验相同的条件。即便是在高浓度，也无结合的迹象。
【具体实施方式】
[0139]实验
[0140]1.杭体分离和表征
[0141]对来自病人的血浆样品进行凝固筛选。对头部损伤后患有硬膜下血肿的病人进行凝固检测。血肿未经干预自发溶解。之前没有出血病史，并且自该病人就诊的过去4年内，没有进一步的出血发作。结果如下表1所示。
[0142]与对照相比,病人的前凝血酶时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)均延长，但蛇毒凝血酶时间正常。
[0143]凝血酶时间并未被肝素酶修正，表明肝素治疗或污染并非其原因。根据ELISA和蛇毒凝血酶分析，病人的纤维蛋白原水平正常。克劳斯法(Clauss assay)产生人为的低纤维蛋白原水平，这缘于凝血酶抑制剂的存在。在用50:50与来自正常个体的混合血浆的混合物进行混合检测后，PT和APTT凝血时间仍保持延长。这表明病人样品中存在抑制剂。
[0144]病人的血浆被发现具有高滴度的IgA。该IgA分子被发现与人凝血酶柱子结合(图1)。在该IgA存在时，结合IgA的凝集素琼脂糖将凝血酶拉下，在该IgA不存在时则不然。该IgA存在时凝血酶原并未被凝集素琼脂糖拉下，表明该IgA与凝血酶，而非凝血酶原特异性结合(图2)。
[0145]接着对该IgA在凝血酶分子上的结合位点进行分析。
[0146]该IgA存在时测量到凝血酶对S2238稍微更高的切割速率，表明该IgA并不封闭凝血酶的活性位点(图3)。
[0147]700nM的IgA存在时，荧光标记的水蛭原与凝血酶的结合被抑制，表明凝血酶针对抗体的表位与水蛭原在凝血酶上的结合位点，即凝血酶的exositel重叠(图4)。
[0148]检测IgA对某些凝血酶的促凝血底物的水解的效果。结果示于表2。这些结果表明，分离自病人的IgA分子抑制凝血酶的多种促凝血活性。
[0149]IgA存在时抗凝血酶(AT)对凝血酶的抑制在肝素存在和不存在时仅受到轻微影响(表3)。
[0150]基于S2238的水解速率，IgA对凝血酶的解离常数(Kd)最初估计为约12nM(图5)。IgA与S195A凝血酶(因催化丝氨酸突变而失活)结合的Kd经ForteB1 Octet Red仪器确定为2nM(表4) ο
[0151]纯化IgA被木瓜蛋白酶切割(图6)，分离Fab片段，与人PPACK-凝血酶(PPACK是共价活性位点抑制剂)组合。人PPACK-凝血酶-FAB复合物经结晶并用于结构分析。获得的结构统计结果如下:分辨率为1.9A, Rfactor = 19.43%,Rfree = 23.42%,不对称单元内的一个复合物，Ramachandran:favoured = 97.0%,异常值=0%。晶体结构显示IgAFab的HCDR3与凝血酶exositel之间的紧密结合(图7)。
[0152]特别地，exositel的 M32、F34、Q38、E39、L40、L65、R67、R73、T74、R75、Y76、R77a和182残基均与IgA Fab的HCDR3环直接相互作用(图8)。
[0153]对抗体-凝血酶连接的PISA分析表明，复合物中总的隐藏表面积是1075 A2。
IgA 重链中的接触残基是(Kabat 编码):30、51、52a、53_55、96、98、99、100、100a、100b、100c、100d。其均在 CDR 中。CDRH1-GYTLTEAAIH、CDRH2-GLDPQDGETVYAQQFKG、CDRH3-GDFSEFEPFSMDYFHF(下划线的残基接触)。CDRH3被发现最为重要，其提供抗体上85%的隐藏表面积。轻链与Tyr49发生轻微接触，就在⑶RL2之前(与凝血酶的Ser36a)。
对隐藏表面积的某些独立贡献有:G1u99 54A2、PhelOO 134.8 A2、GlulOOa 80.6 A2,PhelOOc 141.7 A2。
[0154]凝血酶中的接触残基为(糜蛋白酶编号):32、34、36a-40、65、67、73_76、77a、82和151。对隐藏表面积最重要的独立贡献为:Gln38 86.4 A2、Arg73 44.5 A2、Thr74 60.1 A2、Tyr76 78.4 A2、Arg77a 86.9 A2。
[0155]尽管该IgA的流通水平达3g/l，但病人并未显示出增加或异常的出血或溢血，这表明抗体抑制凝血酶，但不影响正常止血。
[0156]2.1gA对动物血栓形成的效果
[0157]C57BL/6小鼠接受麻醉。在颈动脉中插入导管(用于化合物注射)。FITC标记的纤维蛋白原(2mg/ml)经颈动脉注射。PBS(对照)或IgA也经颈动脉注射。暴露股静脉，并用10% FeCl3 (长3mm的饱和吸墨纸)敷3分钟引发凝血。
[0158]使用荧光显微技术在FeCl3损伤后的0、5、10和20min，沿损伤位点的长度拍摄荧光显微图像。
[0159]股静脉中的血块(纤维蛋白沉积)在亮视野下清晰可见(图9)。最低剂量的抗体经观察能造成对凝血的显著抑制，但随着剂量增加，凝血消失(图10-15)。
[0160]对小鼠出血时间也进行了测量。出血时间以剪尾后血流停止的时间来评估。尽管存在单个异常样品，但出血时间被发现不受抗exositellgA处理的影响(图16)。
[0161]这些结果表明，抗exositellgA抗体是血栓形成的有效抑制剂,但不影响出血时间。
[0162]3.尾夹分析
[0163]野生型雄性C57BL/6小鼠注射400nM IgA(血液中的终浓度，相当于约6mg/Kg的剂量)或PBS后的进行尾夹分析。注射后15分钟，在直径3mm处剪掉尾巴，监视失血10分钟。总失血量经发现不受抗exositellgA抗体处理的影响(图17)。
[0164]4.FeCl2损伤颈动脉闭塞
[0165]对9周大野生型C57BL/6小鼠进行FeClj^伤颈动脉闭塞研究。小鼠在以5%FeCl3损伤2分钟之前,注射400nM抗exositellgA(血液中的终浓度,相当于约6mg/Kg的剂量)或PBS。继而用Doppler监测血流，并测量闭塞时间。“血块”定义为稳定的闭塞血栓，该处血流量通常降低至小于0.lml/min，并保持降低。在对照小鼠中，损伤后约20分钟观察到稳定血块的形成(图18A)。然而,大多数经400nM抗IIa IgA处理的小鼠无法形成稳定血块，并产生血块迅速溶解、反复溶解或根本不会形成的迹线。三个有代表性的迹线如图18B-18D所示。
[0166]5.抗.exositellgG
[0167]使用标准技术将上述在病人中鉴定的IgA分子重构为IgG。
[0168]在添加20nM人凝血酶时，随着加入增加浓度的原始IgA和新IgG，对混合人血浆的凝固时间进行检测(图19)。亲本IgA和合成IgG均以相同的浓度依赖方式增加血块形成的时间，暗示对凝血酶相同的亲和力。
[0169]通过使用ForteB1? Octet Red仪器测量合成IgG与固定S195A凝血酶的结合，对该结果进行了确认。凝血酶与探针连接，对抗体结合(不同浓度)进行监测。确定结合和解离速率。两种抗体均产生相似的约的结合速率和约δχΙΟΛ—1的解离速率，解离常数(Kd)约2ηΜ。对IgA和IgG的平衡状态分析也获得了约2ηΜ的Kd。有代表性的平衡状态曲线如图20所示。IgA的性能在IgG框架上得到重现。
[0170]使用固定IgG的Octet系统对凝血酶原与IgG抗体的结合进行检测。凝血酶与固定IgG结合，并具有与用固定凝血酶所得到的相似的速率和亲和力(表4);凝血酶原不与IgG结合。图21是24nM凝血酶与固定IgG结合和解离的迹线。图22是使用500nM凝血酶原的相同实验，并未显示结合迹象。
[0171]
【权利要求】
1.分离的抗体分子，其特异性结合凝血酶的exositel区。
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其抑制凝血酶活性。
3.根据权利要求2所述的抗体分子，其对止血和/或出血造成最低程度的抑制。
4.根据权利要求2或3所述的抗体分子，其不抑制止血和/或造成出血。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中，抗体分子包含HCDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 5或带有一或多个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO: 5。
6.根据权利要求5所述的抗体分子，其中，抗体分子包含HCDR2，其具有氨基酸序列SEQID NO:4或带有一或多个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:4。
7.根据权利要求5或6所述的抗体分子，其中，抗体分子包含HCDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或带有一或多个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:3。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体分子，其中，抗体分子包含VH区，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或带有一或多个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体分子，其中，抗体分子包含IXDR1、IXDR2和IXDR3，其分别具有序列SEQ ID N0:7、8和9，或分别带有一或多个氨基酸取代、缺失或插入的序列 SEQ ID N0:7、8 和 9。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子，其中，抗体分子包含VL区，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或带 有一或多个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:6。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体分子，其包含VH区，所述VH区包含分别具有序列SEQ ID N0:3、4和5的HCDRU HCDR2和HCDR3，以及VL区，所述VL区包含分别具有序歹Ij SEQ ID N0:7、8 和 9 的 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3。
12.根据权利要求11所述的抗体分子，其包含具有氨基酸序列SEQID NO:2的VH区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的VL区。
13.抗体分子，其与权利要求5-12中任一项所述的抗体分子竞争结合exositel。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体分子，其是全抗体。
15.根据权利要求14所述的抗体分子，其是IgA或IgG。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体分子，其是抗体片段。
17.药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项所述的抗体分子和药学上可接受的赋形剂。
18.根据权利要求1-16中任一项的所述抗体分子，用于治疗人或动物体的方法。
19.根据权利要求1-16中任一项的抗体分子，用于治疗凝血酶介导的病症的方法。
20.根据权利要求1-16中任一项的抗体分子在制备用于治疗凝血酶介导的病症的药物中的用途。
21.治疗凝血酶介导的病症的方法，包含向有需要的个体施用权利要求1-16中任一项所述的抗体分子。
22.权利要求19的抗体分子、权利要求20的用途或权利要求21的方法，其中凝血酶介导的病症是血栓形成病症。
23.权利要求22的抗体分子、用途或方法，其中，血栓形成病症是血栓形成或栓塞。
24.权利要求19的抗体分子、权利要求20的用途或权利要求21的方法，其中，凝血酶介导的病症是炎症、感染、肿瘤生长、肿瘤转移或痴呆。
25.生产针对凝血酶的exositel表位的抗体的抗原结合域的方法，所述方法包括: (i)通过在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH区的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多个氨基酸，提供作为亲本VH区的氨基酸序列变体的VH区，其中亲本VH区的HCDRl、HCDR2和HCDR3分别具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3、4和5 ; (ii)任选地，将由此提供的VH区与一或多个VL区组合，以提供一或多个VH/VL组合；以及 (iii)检测作为亲本VH区的氨基酸序列变体的所述VH区或VH/VL组合或它们的组合，以鉴定针对凝血酶的exositel表位的抗体的抗原结合域。
26.生产特异性结合凝血酶的exositel表位的抗体分子的方法，所述方法包括: 提供编码VH区的起始核酸或各自编码VH区的起始核酸集合，其中，VH区或者包含将被取代的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3，或者缺少HCDRl、HCDR2和/或HCDR3编码区； 将所述起始核酸或起始核酸集合与供体核酸组合，所述供体核酸编码分别具有序列SEQ ID NO: 3、4和5的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列或其突变氨基酸序列，这样，所述供体核酸被插入起始核酸或起始核酸集合的CDR1、CDR2和/或CDR3区中，以提供编码VH区的核酸产物集合； 表达所述产物集合的核酸以生产产物VH区； 可选地，将所述产物VH区与一或多个VL区组合； 选择结合凝血酶exositel的抗体分子,该抗体分子包含产物VH区和任选地VL区；以及 回收所述抗体分子或编码它的核酸。
【文档编号】C07K16/36GK104053673SQ201280061294
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月14日
【发明者】詹姆斯·安德鲁·亨廷顿, 特雷弗·巴格兰, 乔纳森·兰当 申请人:剑桥企业有限公司