201 转基因小鼠脾细胞中，NS4a14Q_148、NS5183_191、NS4b 4Q_48、NS2a144_152 特异性分泌 IFN-Y 的 CTL(分别为 46±11IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、33±7IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、42±9IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、29±8IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞）与无 表位刺激组（2±1IFN-ySFCs/ 5X105脾细胞）比较有显著性差异；在重组质粒免疫的 HLA-A*1101 转基因小鼠脾细胞中，NS2b15_23、NS4b159_167、NS5 561_569、NS399-107'NS55〇5_513> E39_47 特异性分泌正^丫的(：11(125±63正^丫5卩〇8/5\105脾细胞、84±29正^丫5卩〇8/ 5X10 5 脾细胞、23±5IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、70±26IFN-ySFCs/ 5X105 脾细 胞、81±25IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、94±35IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞）与无 表位刺激组（1±1IFN-ySFCs/ 5X105脾细胞）比较有显著性差异；在重组质粒免疫 的 HLA-A*2402 转基因小鼠脾细胞中，NS588Q_888、NS3472_48Q、NS3 548_556、NS4a4Q_48、NS322_ 3。特 异性分泌 IFN-Y 的 CTL(30±6IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、47±19IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、25±7IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、55±16IFN-ySFCs/ 5X105 脾细胞、 7± IIFN-Y SFCs / 5X IO5脾细胞）与无表位刺激组（1±0IFN-ySFCs / 5X IO5脾细胞） 比较有显著性差异。由此证明此通用型CTL表位DNA疫苗可以在上述转基因小鼠细胞内表 达，并被其蛋白酶体加工释放出单个CTL表位，后者诱导产生了 CTL表位特异性分泌IFN- Y 的 CTL。
[0046]实施例5、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫的转基因小鼠的脾细胞杀伤负载 CTL表位的脾细胞。
[0047] 上述重组质粒免疫的的转基因小鼠脾细胞作为效应细胞。分别取未经免疫的 HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402转基因小鼠的脾细胞，分别加入各自对应的CTL表 位，37°C共孵育2h，此即为负载CTL表位的脾细胞。未负载CTL表位及负载CTL表位的脾细 胞用作靶细胞，采用CTL杀伤实验（LDH释放法）检测效应细胞对靶细胞的杀伤活性。简述 如下：将效应细胞和不同的靶细胞按不同的比例（10 : 1，5 : 1，1 : 1)加入到96孔板中， 即为实验孔。同时设置靶细胞最大释放孔、靶细胞自发释放孔、效应细胞自发释放孔、培养 基孔、体积校正孔。96孔板于37°C / 5% CO2细胞培养箱中培养9h。离心5min，吸取50 ill 上清至96孔酶标板中，加入检测LDH含量的反应液，室温避光反应20min。立即加入终止 液，测各孔492nm波长的OD值，按下述公式计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分比：
[0048]
[0049] 结果：由图5可知，重组质粒免疫的HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402转基因 小鼠的脾细胞均可以杀伤负载相应的CTL表位的脾细胞，而对未负载CTL表位的脾细胞杀 伤率非常低，二者比较有显著性差异。而且，免疫的小鼠的脾细胞杀伤负载CTL表位的脾细 胞的百分比与效应细胞/靶细胞比率成正比。由此可知，重组质粒免疫的小鼠脾细胞中存 在CTL表位特异性CTL，其可特异性杀伤负载CTL表位的脾细胞而对未负载表位的正常细胞 无杀伤效应。
[0050] 实施例6、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫的转基因小鼠脾细胞杀伤 DENV-I感染的脾单核细胞。
[0051] 上述重组质粒免疫的的转基因小鼠的脾细胞作为效应细胞。分别取未经免疫的 HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402转基因小鼠的脾细胞，分离脾单核细胞（脾细胞加入 培养板于37°C孵育2h，弃上清，贴壁细胞即为脾单核细胞），DENV-I于37°C感染脾单核细胞 24h。未感染的脾单核细胞和DENV-I感染的脾单核细胞用作靶细胞，采用CTL杀伤实验（LDH 释放法）检测效应细胞对靶细胞的杀伤活性。简述如下：将效应细胞和不同的靶细胞按不 同的比例（10 : 1，5 : 1，1 : 1)加入到96孔板中，即为实验孔。同时设置靶细胞最大释 放孔、靶细胞自发释放孔、效应细胞自发释放孔、培养基孔、体积校正孔。96孔板于37°C / 5% CO2细胞培养箱中培养9h。离心5min，吸取50 ill上清至96孔酶标板中，加入检测LDH 含量的反应液，室温避光反应20min。立即加入终止液，测各孔492nm波长的OD值，按下述 公式计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分比：
[0052]
[0053] 结果：由图6可知，重组质粒免疫的HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402转基因 小鼠的脾细胞均可以杀伤DENV-I感染的脾单核细胞，而对未感染的脾单核细胞杀伤率非 常低，二者比较有显著性差异。而且，免疫的小鼠的脾细胞杀伤DENV-I感染的脾单核细胞 的百分比与效应细胞/靶细胞比率成正比。由此可知，重组质粒免疫的小鼠脾细胞中存在 CTL表位特异性CTL，其可特异性杀伤DENV-I感染的脾单核细胞而对未感染的正常细胞无 杀伤效应。
[0054] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之做一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做一些 修改或改进，均属于本发明要求保护范围。
【主权项】
1. 一种登革病毒（DENV)通用型CTL表位DNA疫苗，其特征在于，该DNA疫苗是在真核 表达质粒pcDNA3.1(_)中插入一段外源基因片段，编码的蛋白是以IgK链信号序列为引导 序列，包含有登革病毒1型（DENV-I)中15个高度保守的免疫优势CTL表位和1个通用型 辅助性T细胞表位，各表位间由1-4个氨基酸组成的Linker连接。2. 如权利要求1所述的CTL表位DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗编码的蛋白包含 的15个DENV-I的CTL表位和1个通用型辅助性T细胞表位如下表所示：表中所示表位通过1-4个氨基酸组成的连接桥（Linker)连接，表中所示表位按照表位 在CTL表位DNA疫苗中的先后顺序排列。3. 如权利要求2所述的DNA疫苗，其特征在于，其具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸 序列，或该序列经过改变但具有相同功能的核苷酸序列。4. 一种多肽，其特征在于，所述的多肽由权利1-3所述的DNA疫苗编码产生。5. 如权利要求1-3所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗具有免疫原性。6. 如权利要求1-3所述的CTL表位DNA疫苗的用途，其特征在于，所述疫苗可以诱导机 体产生特异性的CTL反应，后者可释放IFN- γ并能杀伤负载CTL表位的细胞和DENV-I感 染的细胞。7. -种药物组合物，其特征在于，含有有效量的如权利要求1-3所述的DNA疫苗，以及 药学上可以接受的载体或者赋形剂。8. 如权利要求1-3所述的DNA疫苗在预防和治疗DENV感染的药物中的应用。9. 如权利要求5-7所述的应用，所述疫苗为注射剂、喷雾剂或透皮药物。
【专利摘要】本发明公开了一种登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗，其是以真核表达质粒pcDNA3.1(-)为载体骨架，以Igκ链信号肽为引导序列，包含有登革病毒1型中15个高度保守的免疫优势CTL表位和1个通用型辅助性T细胞表位，各表位间由1-4个氨基酸组成的Linker连接。该DNA疫苗免疫HLA-A*0201转基因小鼠、HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠后，可诱导产生CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL，后者可以杀伤负载CTL表位的小鼠脾细胞和登革病毒1型感染的小鼠脾单核细胞。该DNA疫苗具有广泛人群覆盖率(通用型)，在登革病毒的免疫治疗和预防方面具有巨大的潜在价值。
【IPC分类】A61K48/00, A61P31/14, A61K39/12, C12N15/79, C07K14/18, C12N15/40
【公开号】CN104971362
【申请号】CN201410133578
【发明人】文金生, 段志良, 王思娜, 黄曦, 李静, 刘慧芳, 杨金霖
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月3日