0201转基因小鼠、HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠购自美 国Jackson Laboratory和Taconic公司。编码串联表位的核苷酸由北京六合华大基因科技 股份有限公司合成。限制性核酸内切酶Xba I、Hind III，T4DNA连接酶和LDH杀伤试剂盒购 自promega公司，质粒提取试剂盒购自北京艾德来生物科技有限公司，小鼠IFN- Y ELISP0T 试剂盒购自荷兰U-CyTech公司，CTL表位由上海强耀生物公司合成。
[0020] 本发明的CTL表位DNA疫苗的用途：直接作为药物预防或治疗登革病毒感染相关 疾病，所述疾病包括（但不限于）：登革热、登革出血热/登革休克综合症；或制备诱导发生 CTL反应的药物组合物。
[0021] 本发明还提供了包含本发明的CTL表位DNA疫苗的组合物，特别是药物组合物。该 组合物可用于诱导发生CTL反应，也即诱导产生CTL表位特异性的CTL。
[0022] 可将本发明的组合物制备成各种剂型，如注射剂、喷雾剂、透皮药物等。
[0023] 当用作疫苗时，所述的疫苗可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种 方法，用合适的药用载体和/或运载体（vehicle)配制本发明的疫苗或药物。
[0024] 另外，本发明的疫苗的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂等。这些成分 是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括（但不限于）铝盐佐剂。
[0025] 当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的DNA疫苗施用于对象。通常采用与常 规疫苗相同的施用途径。采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外， 这种疫苗组合物还可包括佐剂或稳定剂等。
[0026] 给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途径包括（但不限于）：肌肉、皮下、 皮内、静脉。疫苗可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免 疫力。
[0027] 应以"有效量"给予本发明的DNA疫苗，即DNA疫苗的量在所选用的给药途径中足 以诱导免疫反应，能有效保护机体抵抗登革病毒感染或因感染导致的并发症。
[0028] 如本文所用，"有效量"是指以单剂或连续剂给予个体的量对治疗或预防是有效 的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、个体免疫状态、疫苗的配制、及其它相 关因素而定。该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
[0029] 在各疫苗组合物中所选用的DNA疫苗的量，是按照可诱导免疫保护效应而无明 显的副作用的量而定。通常，给予约0.01Ug-IOmgCTL表位DNA疫苗/ kg体重，优选 0.Iyg-lmgCTL表位DNA疫苗/ kg体重，更优选10iig-lmgCTL表位DNA疫苗/ kg体重。 可用包括检测对象中CTL表位特异性CTL的水平和其它反应的实验方法来确定具体疫苗的 最佳用量。
[0030] 本发明的主要优点在于：
[0031] 本发明的CTL表位DNA疫苗编码的是DENV-I中高度保守的15条受HLA-A*0201、 HLA-A*1101、HLA-A*2402限制的CTL表位，因而具有广泛的人群覆盖率。该DNA疫苗不但 可诱导表位特异性CTL反应，而且后者可杀伤负载CTL表位的细胞和DENV-I感染的细胞。 因此，该DNA疫苗在登革病毒感染性疾病的预防和免疫治疗方面具有广阔的应用前景。
[0032] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段多为本领域技术人员所熟知的常规手 段。实施例中大肠杆菌的感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA 片段的回收及与质粒的连接、重组质粒的筛选和鉴定等参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆 实验指南》第二版相关章节进行。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应 用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0033] 实施例1、登革病毒多表位基因的设计
[0034] 本发明所涉及的15个表位均是我们已鉴定的DENV-I特异性优势表位，各表位间 以Ig K链信号序列、柔性小分子连接桥（Linker)和PADRE表位连接，使15个CTL表位在空 间上独立并各自发挥作用，最终设计合成了登革病毒多表位基因（经过小鼠密码子优化， 并且两端分别为限制性核酸内切酶XbaI和HandIII的酶切位点）。
[0035] 结果：下表为15个DENV-I来源的CTL表位序列。核苷酸序列及其编码的CTL表 位的顺序如图 1 所示。受 HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402 限制的 15 个 DENV-I 的 CTL 表位序列之间由Ig K链信号序列、Linker (K、N、KA、YN、FL、NA、GAA或GAAA)和PADRE表位 (AKFVAAWTLKAAA)串联而成。图1清楚的显示了合成序列的组成串联情况和合成序列在载 体中的插入位点。
[0036]
表中所示表位按照表位在CTL表位DNA疫苗中的先后顺序排列。
[0037] 实施例2、真核重组表达载体pcDNA3. 1 (_)的构建及质粒纯化
[0038] 将上述合成的核苷酸序列采用Xba I和Hind III双酶切，与经Xba I和Hind III 双酶切的pcDNA3. 1(_)在T4DNA连接酶的作用下进行连接。将连接产物转化至感受态的大 肠杆菌DH5 a中，氨苄青霉素筛选转化菌落，提取质粒，经测序、双酶切后琼脂糖电泳鉴定 登革病毒多表位重组表达质粒。将含有该重组质粒的大肠杆菌经LB液体培养基振荡培养 15h，收集菌体，用质粒提取试剂盒提取纯化的重组质粒，即登革病毒通用型CTL表位DNA疫 苗。
[0039] 结果：重组pcDNA3. 1 (_)质粒中插入的核苷酸序列测序图如图2所示，测序的序列 与图1中的核苷酸序列完全一致，无突变、无插入或缺失。重组质粒的双酶切琼脂糖电泳结 果如图3所示，图中共有四个泳道。"1"为重组pcDNA3. 1(_)质粒的双酶切产物，包括1条 约600bp大小的条带（与合成的核苷酸序列长度582bp吻合）和1条大小介于5000-6000 之间的条带【与pcDNA3. 1(_)质粒的大小一致】;"2"为重组pcDNA3. 1(_)质粒的电泳条带； "M-1"和"M-2"为Marker条带。由上可知重组pcDNA3. 1 (-)质粒构建成功。
[0040] 实施例3、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫转基因小鼠
[0041] 将实施例2中获得的重组pcDNA3. 1(_)质粒溶解于无菌的PBS缓冲液中，至 终浓度为2 ii g/ ill。6-8周龄雌性HLA-A*0201转基因小鼠、HLA-A* 1101转基因小鼠和 HLA-A*2402小鼠各6只，采用后胫骨前肌肉注射法以50 ii g重组pcDNA3. 1 (-)质粒免疫每 只小鼠，一周后加强免疫2次（间隔一周）。
[0042] 实施例4、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫的转基因小鼠中表位特异性分泌 IFN-Y的CTL的检测。
[0043] 采用小鼠IFN-YELISP0T试剂盒（预包被的PVDF膜96孔板），参照说明书进行。 过程如下：
[0044] 在第3次免疫一周后处死上述重组质粒免疫的HLA_A*0201转基因小鼠、 HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠，制备脾细胞悬液（5 X IO6脾细胞/ ml培 养基）并加入ELISP0T板中，每孔100 yl。设置无表位刺激孔和表位刺激孔（加入相应的 20 y g/ml的CTL表位刺激），均设置双复孔。于37°C / 5% CO2的细胞培养箱中培养18h， 弃去每孔液体,洗涤液洗板5次。每孔加入生物素化的检测抗体，于37°C / 5% CO2的细胞 培养箱中孵育lh。弃去每孔液体，洗涤液洗板5次，加入链霉亲合素耦联的HRP，于37°C / 5% CO2的细胞培养箱中孵育lh。弃去每孔液体，洗涤液洗板5次，最后加入显色液，于37°C 反应20min，弃去每孔液体，用无菌水洗涤3-5遍以终止显色过程。待板中每孔膜自然干燥 后，采用ELISP0T读板仪计数每孔斑点数。一个斑点代表一个斑点形成细胞（SFC)，斑点数 表示为IFN-Y SFCs / 5X IO5脾细胞。表位刺激孔与无表位刺激孔之间的统计学比较采用 t检验。
[0045] 结果：图4中上，中，下的柱形图分别表示重组质粒免疫的HLA_A*0201转基因 小鼠、HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠。处死小鼠后，采用ELISP0T实 验检测脾细胞中CTL表位特异性分泌IFN-Y的CTL的水平。由图可知，在重组质粒免疫 的 HLA-A*0