专利名称：一种基因治疗组织工程支架的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料与生物医学技术领域，更具体涉及一种基因治疗组织工程支架的制备方法，适用于通过转基因的方法来修复受损组织。
背景技术：
组织再生依赖于生长因子，更好地开发和利用生长因子是获得更多组织再生的关键。外源性生长因子半衰期短，局部使用很快被稀释和代谢，故需反复大剂量使用，而且价格昂贵。因此，现在多采用各种缓释系统来承载生长因子使之与周围组织均匀接触，从而诱导周围细胞的增殖分化，作为组织生长支架促进组织生长。
作为一种缓释系统，最为关键的性能就是携带足够的生长因子，并具有足够长的降解时间，同时尽可能延长生长因子的释放时间，提高生长因子的利用效率。从传统的生物活性磷酸钙[Larffargue P，Mildebrand HF.Bone，1999，2555-58.]，胶原，壳聚糖[陈富林，毛天球，马秦等。口腔医学，1999，19(1)4-6.]以及珊瑚材料[Sciadini MF，Dawson JM，Johson KD，et al.J Orthop Res，1997，15(6)844-847.]，到微球缓释系统，如人工合成的聚乳酸，聚羟基乙酸及其合成物[Saito N，Okata T，Moriuchi H，et al.J Bone Joint Surg Am，2001，83(suppl)92-98.]还有多糖基水凝胶[Bos JW，Jacbos JJ，Koten JW，et al.Eur J Pharm Sci，2004，21(4)561-567.]等，再到如今仍处于实验室研究阶段的纳米缓释系统[Constancis A，Meyrueix R，BrysonN，et al.J Colloid Junterface Sci，1999，217(2)357-368.]，学者们研究出多种不同的缓释系统。虽然载药量和包封率不断提高，缓释时间也不断提高，但是大部分系统携带的因子的初期释放仍然呈“爆发样”，而后期生长因子释放量过低；并且生长因子被加载于载体过程中，生长因子在数量和活性上仍存在一定的损失；而且，作为外源性生长因子，其价格仍比较昂贵。总体而言仍不能满足临床普遍应用的要求[Meinel L，Zoidis E，Zarf J，et al.Bone，2003，33(4)660-672.]。
目前对于组织工程支架的改性除了在支架上复合蛋白外，还有研究将基因整合到支架上，从而在体内感染细胞，使之分泌内源性蛋白，达到治疗的目的[Southwood LL，Frisbie DD，Kawcak CE，et al.Vet Surg.2004，33(6)565-78]。但目前多采用质粒携带基因，这种整合基因方式的最大问题就是转染效率低下，产生重组蛋白的量非常少，达不到治疗的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因治疗组织工程支架的制备方法，方法简单，操作方便，将携带治疗基因(如骨形成蛋白BMP，转化生长因子TGFβ，血小板衍生生长因子PDGF，胰岛素样生长因子IGF)的病毒整合到支架中，从而提高了转染效率，使细胞能够分泌足量的内源性蛋白，提高了治疗效果。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施将携带治疗基因的病毒与支架相结合，病毒载体可为反转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体。支架可为任何一种能够耐受真空干燥的高分子支架，包括胶原支架、聚乳酸支架、聚乙醇酸支架、明胶支架、壳聚糖支架以及他们的共聚物支架。
一种基因治疗组织工程支架的制备方法，其步骤如下①首先将高分子支架(如胶原支架、聚乳酸支架、聚乙醇酸支架、明胶支架、壳聚糖支架以及他们的共聚物支架)剪成所需形状，浸泡于纯水中，调节PH值为中性(6.5-7.5)，再用70％酒精浸泡6-12小时消毒，35-38℃自然烘干后待用。
②将携带治疗基因的病毒液(按各种病毒载体说明书制备相应的病毒液)倒入灭菌塑料小皿中，将支架浸泡于病毒液中，要求液面没过支架。
③将此小皿在4℃环境中放置8-12小时，然后置入-30℃冰箱预冻4-8小时，再转入-60℃--70℃中预冻8-12小时。
④将培养皿移入温度为-30℃--40℃的冷冻干燥机干燥室中，密闭干燥室开启抽气泵直至真空(真空度为0.1-0.15)。从而制成携带治疗基因的支架，用聚乙烯薄膜将多孔支架密封后并存于-80℃待用。
优点和效果
迄今为止，将病毒与支架复合的研究在国内外尚未见报道。本发明主要的优点在于能够显著提高转染效率，通过体内体外两方面试验发现这种方法能够使细胞高效的分泌内源性蛋白，从而再次作用于细胞发挥作用。通过将不同的治疗性基因整合到支架上，能够显著提高细胞的增殖及分化，从而达到治疗效果。同时本方法简单易行，降低了治疗性支架的成本，具有潜在的应用价值。
图1为一种绿色荧光代表被感染的细胞效果示意图。
从荧光角度看，可见整合病毒的支架转染效率相当高，能够满足科研及临床需要。
具体实施例方式
实施例1用于软骨再生的治疗性支架首先采用相分离法制备壳聚糖/明胶多孔支架材料[黄志海，董寅生，郭超等。化工时刊2004，1836-39]，同时构建带有转化生长因子1(TGF-betal)基因的腺病毒[K.Kawamura，C.R.Chu，S.Sobajima，et al.Exp Hematol 33(2005)865-872.]，测好滴度备用。将壳聚糖/明胶多孔支架材料消毒好后浸泡于携带TGF-betal基因的病毒液中，在4℃环境中放置12小时，然后置入-30℃冰箱预冻4小时，再转入-60或-62或-67或-68或-70℃中预冻8或9或10或11或12小时。将培养皿移入温度为(-30或-32或-34或-35或-37或-39或-40℃)的冷冻干燥机干燥室中，密闭干燥室开启抽气泵直至真空。制备好后用聚乙烯薄膜将多孔支架密封后冻存于-80℃待用。
实施例2用于骨组织再生的治疗性支架首先采用相分离法制备壳聚糖/磷酸钙多孔支架材料[Ge Z，Baguenard S，Lim LY，et al.Biomaterials 25(2004)1049-1058.]，同时构建带有骨形成蛋白2(BMP2)基因的腺相关病毒[Chen Y，Luk KD，Cheung KM，et al.Gene Ther.10(2003)1345-53.]，测好滴度备用。将壳聚糖/磷酸钙多孔支架材料消毒好后浸泡于携带BMP2[Chen Y，Luk KD，Cheung KM，et al.Gene Ther.10(2003)1345-53.]基因的病毒液中，在4℃环境中放置12小时，在4℃环境中放置12小时，然后置入-30℃冰箱预冻4小时，再转入-60或-61或-63或-65或-67或-70℃中预冻8到12小时。将培养皿移入温度为(-30或-31或-33或-35或-37或-40℃)的冷冻干燥机干燥室中，密闭干燥室开启抽气泵直至真空。制备好后用聚乙烯薄膜将多孔支架密封后冻存于-80℃待用。
实施例3用于牙周组织再生的治疗性支架首先采用相分离法制备壳聚糖/明胶多孔支架材料[Mao JS，Liu HF，Yin YJ，et al.Biomaterials.24(2003)1621-9]，同时构建带有血小板衍生生长因子B(PDGF-B)[Gu DL，Nguyen T，Gonzalez AM，et al.Mol Ther.9(2004)699-711]及骨形成蛋白7(BMP7)[Jin QM，Anusaksathien O，Webb SA，et al.J Periodontol.74(2003)202-13.]基因的腺病毒，测好滴度备用。将壳聚糖/明胶多孔支架材料消毒好后浸泡于PDGF-B和BMP7两种病毒的混合液中，按1∶1比例混合，在4℃环境中放置12小时，在4℃环境中放置12小时，然后置入-30℃冰箱预冻4小时，再转入-60或-64或-66或-69或-70℃中预冻8到12小时。将培养皿移入温度为(-30或-31或-33或-35或-37或-40℃)的冷冻干燥机干燥室中，密闭干燥室开启抽气泵直至真空。制备好后用聚乙烯薄膜将多孔支架密封后冻存于-80℃待用。
权利要求
1.一种基因治疗组织工程支架的制备方法，它包括下列步骤A、将高分子支架剪成所需形状，浸泡于纯水中，调节PH值为6.5-7.5，再用70％酒精浸泡6-12小时消毒，35-38℃烘干后待用；B、将携带治疗基因的病毒液倒入灭菌塑料小皿中，将支架浸泡于病毒液中，液面没过支架；C、将此小皿在4℃环境中放置12小时，然后置入-30℃冰箱预冷4小时，再转入-60℃——70℃中预冷8-12小时；D、将培养皿移入温度为-30℃——4℃0的冷冻干燥机干燥室中，温度平衡后密闭干燥室开启抽气泵直至真空，制成了携带治疗基因的支架，用聚乙烯薄膜将多孔支架密封后冻存于-80℃待用。
全文摘要
本发明公开了一种基因治疗组织工程支架的制备方法，其步骤是首先将高分子支架剪成所需形状，浸泡于纯水中，用酒精浸泡消毒，烘干后待用；其次是将携带治疗基因的病毒液倒入灭菌塑料小皿中，将支架浸泡于病毒液中；第三是将小皿放置一定时间，然后置入冰箱预冷；第四是将培养皿移入冷冻干燥机干燥室中，温度平衡后密闭干燥室开启抽气泵直至真空，制成了携带治疗基因的支架。本发明方法简单，操作方便，降低了治疗性支架的成本。
文档编号A61K48/00GK1814295SQ20051001997
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者程祥荣, 张玉峰, 王贻宁, 施斌, 李四群, 黄翠, 夏海滨 申请人:武汉大学