专利名称：基因治疗的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉湖于基因治疗，特别是^顿PEG化腺病毒的基因治疗，的改进 方法。
背景技术：
齐糧娜性的不利效应已与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关联。 与其他类型的治疗一起，对基于腺病毒的基因治疗的需要是减轻不利效应，同 时最大化治疗效果。
, 发明
本发明提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利 效应的方法，所述方,括将PEG化的重组腺病毒病毒体乡^受试者，其中腺 病毒病毒体的PEG化程度是在大约每病毒体400PEG分子到大约每病毒体 薩PEG肝之间。
本发明还提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不 利效应的方法，所述方^^括将PEG化的重组腺病毒病毒体乡^受试者，其中 腺病毒病毒体的PEG化程度是在大约每病毒体400PEG分子到大约 毒体 1250PEG好之间，例如，比如说，在大约繊毒体600PEG舒到大约顿 毒体1000PEG^T之间。
本发明还提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不 利效应的方法，所述方、M括将PEG化的重组腺病毒病毒体纟^f受试者，其中 腺病毒病毒体的PEG 4tf呈度高于大约^毒体1250PEG分子，最高达大约每 病毒体1600PEG分子。
在一个实施方式中，本发明提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的心血管效应的方法，所述方、M括将PEG化的腺病毒病毒体给 予受i式者，其中腺病毒病毒体的PEG ^f呈度是在大约每病毒体400PEG分子到 大约鄉毒体1250PEG分子之间，例如，比如说，在大约每病毒体600PEG分 子到大约每病毒体1000PEG ^之间。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全 身给药相关的心血管效应的方法，所述方法包括将PEG化腺病毒病毒体纟^受 试者，其中腺病毒病毒体的PEG ^|號高于大约 毒体1250PEG分子，最 高达大约,毒体1600PEG ^。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全 身给药相关的凝血紊乱的方法，所述方、M括将PEG化的J3W毒病毒体给予受 试者，其中腺病毒病毒体的PEG4^呈度是在大约每病毒体400PEG好，至U大 约鶴毒体1250PEG好之间，例如，比如说，在大约繊毒体600PEG好 到大约每病毒体1000PEG ^之间。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全 身给药相关的凝血紊乱的方法，所述方,括将PEG化的腺病毒病毒体纟^受 试者，其中腺病毒病毒体的PEG 4^呈度高于大约每病毒体1250PEG分子，最 高达大约輔毒体廳PEG舒。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒载 体全身给药相关的^1敏反应的方法，所述方,括将PEG化的腺病毒病毒体 会^，者，其中腺病毒病毒体的PEG ^W號是在大约每病毒体400PEG M 到大约每病毒体1250PEG舒之间，例如，比如说，在大约輔毒体600PEG 分子到大约,毒体1000PEG分子之间。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒载 体全身给药相关的微敏反应的方法，所述方飽括将PEG化的腺病毒病毒体 ^"^受试者，其中腺病毒病毒体的PEG 4^，高于大约每病毒体1250PEG分 子，最高达大约每病毒体1600PEG分子。
本发明的又一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全 身给药相关的不利效应的方法，戶做方'跑括将PEG化的腺病毒病毒体舒受 试者，其中腺病毒病毒体的PEG化程度在大约每病毒体400PEG ^到大约每 病毒体1250PEG舒之间，例如，比如说，在大约繊毒体600PEG肝到大约繊毒体脂0PEG針之间，其中PEG化重1& 毒的转导效率等于駄于没有PEG化的重组腺病毒的转导效率。
发明详述
本发明提供了一定程度PEG化的PEG化重纟 病毒，其會,轻与重组腺病毒的全身给药相关的不利效应。不限于理论，据认为，腺病毒衣壳蛋白的PEG化抑制细胞受体结合，所鄉胞受体育M1腺病毒蛋白与各自的受体的位阻诱导释放即时炎症介质，如绷安和细胞因子。还认为，PEG化可抑制与血液成分的相互作用，所M液成分可在受试者中诱导被重组腺病毒载体诱导的弥散性mi&L病。
本发明提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利效应的方法，所述方^括将PEG化的重组腺病毒病毒体乡^受试者，其中腺病毒病毒体的PEG化程度是在大约每病毒体400PEG分子到大约每病毒体薩PEG肝之间。
本发明的一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利效应的方法，所述方法包括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中腺病毒病毒体的PEG ^f呈度是在大约^毒体400PEG分子到大约輔毒体1250PEG好之间，例如，比如说，在大约彌毒体600PEG肝到大约 毒体1000PEG M之间。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利效应的方法，所述方、M括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受^#，其中腺病毒病毒体的PEG 4hf呈度高于大约,毒体1250PEG M，最高达大约,毒体1600PEG W。
本发明的一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的心血管效应的方法，所述方》跑摘每PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中腺病毒病毒体的PEG化程度是在大约每病毒体400PEG分子到大约舗毒体1250PEG肝之间，例如，比如说，在大约每病毒体600PEG分子到大约,毒体1000PEG ^之间。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的心血管效应的方法，所述方法包括将PEG化的重组H^毒病毒体会^数式者，其中腺病毒病毒体的PEG 4tf號高于大约每病毒体1250PEG分子，最高达大约每病毒体1600PEG分子。
本发明的一个实 式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的MifiL凝L的方法，所述方法包括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中腺病毒病毒体的PEG ^f呈度是在大约每病毒体400PEG分子到大约每病毒体1250PEG分子之间，例如，比如说，在大约彌毒体600PEG肝到大约每病毒体1000PEG ^之间。
本发明的另一实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的ll!fiL紊乱的方法，所述方法包括将PEG化的重乡1H病毒病毒体给予受试者，其中腺病毒病毒体的PEG似號高于大约,毒体1250PEG ^，最高达大约,毒体1600PEG M。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的微te应的方法，包括但不限于受试者易患炎性状况和/或具有炎性状况，所述方法包括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中腺病毒病毒体的PEG化程度是在大约每病毒体400PEG分子到大约每病毒体1250PEG^f之间，例如，比如说，在大约每病毒体600PEG分子到大约,毒体1000PEGW之间。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的类过敏反应的方法，包括但不限于受试者易患炎性状况和/或具有炎性状况，所述方、M括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中腺病毒病毒体的PEG化程度高于大约每病毒体1250PEG M ，最高达大约,毒体函PEG針。
本发明的另一个实施方式提供了一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利效应的方法，所述方、M摘每PEG化的J^毒病毒体^f受试者，其中腺病毒病毒体的PEG化程度是在大约每病毒体400PEG分子到大约輔毒体1250PEG好之间，例如，在大约繊毒体600PEG舒到大约繊毒体1000PEG ^之间，其中PEG化的重组腺病毒的转导效率等于或大于没有PEG化的重组腺病毒的转导效率。例如，而不是限制，当中和抗，在于血清中时，转导效率可高于非PEG化重组腺病毒。
一I5^说，大于大约^毒体1250PEG^，最高达大约每病毒体1600PEG分子的给药，与更低的转导效率但与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利^她的更高離相关。PEG化的重组腺病毒(例如，PEG化复制缺陷重组腺病毒，其包括编码治疗性蛋白的多核苷,列)全身给药有用的受试者的状况的例賴括但不限于慢性炎性状况。这些状况的例雅括但不限于COPD，类HS关节炎和癌症。
测量转导效率的方法是现有技术公知的。
本发明还提供了包含PEG化腺病毒的组合物。
鹏
根据本发明可利用本领域技术之内的常规分子生物学，微生物学，和重组DNA技术。这些技术在文献中有解释。参见例如,Sambrook^Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yoik (本文中"Sambrook等，1989");DNA Cloning: A Practical Approach Volumes I and n p.N. Glover ed. 1985);Oligonucleotide Synthesis (MX Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J. Higgins eds. (1985》；Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J.Higgjns， eds. (1984》；AaimM...CMLCM;tH^ (R丄Freshney, ed (1986》；Jta mQ加i ^Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); BPerbal, A Practical Guide To MolecularCloning (1984): FM Ausubel,等(eds.), Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
B^毒PEG化
腺病毒可以被任意现有S^PEG化。PEG <斷布在治疗'鹏太和蛋白质的修饰方面是一种发展成熟的,。对蛋白和肽的PEG化的最主要的优点包括降低了抗原性和免疫原性。制备PEG-蛋白结合物要求，一l^fe说，用合适的试剂活化PEG的羟基，所述合适的试剂在偶联反应中可完全被蛋白中的亲核基团(主要飄氨酸￡ -氨錢团)取f^OTliordan等,Hum. Gene Ther. 10:1349-1358 (1999》.已经发展了很多种方法以生产出活化的PEG连擬U(Francis等，J. Drug Target.3:321 -340(1996》。
同样，可获得用于将多种聚乙二醇结合到腺病毒的衣壳蛋白的多种方法((JRiordan等，Hum. Gene Ther. 10: 1349-1358 (1999》.Croyle等(Hum. GeneTher. 11:1713-1722(2000》描述了 3种用更短的鹏时间的结合方法，可以充分修饰病毒衣壳和在极限存储条件中腺病毒的物理稳定性。在本领域可获得其他
7方法。例如，但是不限于，聚^I可被共价结^(参见例如，美国专利号:5,711,944和5,951,974)或者非-共价结合(参见例如,W02005/012407)。
各种各样的活化的聚乙二醇连接剂可用于蛋白质和rAds的PEG化中。PEG-SPA (SPA:PEG丙酸的琥珀 胺酯)，其为在一个末端被N -羟,珀M胺(NHS)活化并且在另一个末端包覆着甲縫的聚乙二醇，可以lfei^择以PEG化腺病毒。
具有在NHS酯的相g端上在PEG上的荧光素部分的PEG-SPA也可利用。荧光素标记的聚乙二醇连接剂(这里简称荧光-PEG-SPA)的好处是它具有和PEG-SPA相同的反应性。在一个雌实施例具有5kDA的PEG肝量的PEG陽SPA连接剂被鹏。
其他的PEG连接剂也可以使用。例如，tresyl-MPEG(TM-PEG)已经在PEG化腺病毒中成功4顿(((7Riordan等,Hum. Gene Ther. 10:1349-1358 (1999); SigmaChemical (St. Louis, MO); Shearwater Polymers (Huntsville， AL); PoIyMASCPharmaceuticals (London^ UK))。其他商业可以获得的连歸U包括琥珀SfeM胺琥珀酸酯MPEG(SS-PEG),聚邻苯二,安(PPA)以及,酰氯MPEG (CC-PEG)(Sigma Chemical Co. (St. Louis， MO)。
例如，但是不限于，通常在大约1%w/vPEG到大约4%w/vPEG会产生大约,毒体400 PEG分子到大约每病毒体1250 PEG分子。还例如，但是不限于，通常大约5%w/vPEG到大约8%w/vPEG会产生高于大约每病毒体400PEG肝到大约繊毒体1600 PEG舒(参见例如,WO/2007/062207)
腺病毒的PEG化
腺病毒可以用本领域已知的任意方法被PEG化。例如，但是不限于，聚合物可以被被共价结^(参见例如，美国专利号.5,711,944和5,951,974)或者一^共价结^t参见例如，WO2005/012407)(参见U.S.S,N.: 60/739,739，其于2006年11月23日申请，其全^ffiil援引并A^文)。也可以参见U.S.S.N.: 60/739,739,于2006年11月23日申请，其全^31援引并A^文。
确定PEG化禾，的方法
任何本领域已知方法都可以用来确定病毒体的PEG化相)^呈度。在一个优选实施方式中，确定腺病毒病毒体的平均PEG ^f呈度的方法利用在CsCl梯度上分析性超离心法(AUC)(参见U.S. S.N. : 60/739,739，其于2006年11月23日申请，现在为国际公开号:W02007/062207,其全顿鄉弓I并A^文)。其他本领域已知的方法也可以用作标准用于测定聚^)-粒子结合制剂的PEG化相)(^呈度。郸ij来说，^f顿生物素断己的PEG连擬啲现有技术方法可用作标准，所述生物素硫己的PEG连擬啲DP Bil过利用抗生物素蛋白-辣鹏氧化物酶的ELISA分析生物素^i己的PEG化rAd而确定(OTRiordan等,Hum. GeneTher. 10:1349-1358(1999》。或者，PEG化病毒制剂可以{柳荧光胺雌，以定量相对于没有PEG化的对照的赖氨酸基团损失(Croyle等,Hum. GeneTher. 11:1713-1722)，从而确定标准制剂的平均PEG tt^呈度。
重,病毒(rAd)
重组腺病毒(rAd)广泛用于为疫苗或基因治疗而将基因递送入细胞(Alemany等,J. Gen. Virol. 81(11):2605-2609 (2000); Vorberger & H賊Oncologist7(1):46誦59 (2002); Mizuguchi & Hayaka， Hum. Gene Ther. 15(11):1034-1044(2004); Basak等，Viral Immunol. 172:182-96 (2004)。术i吾"重组"是指已M51常规重组DNA技术修饰的基因组。
术语"腺病泰'与术语"腺病毒载体"同义，指腺病毒科(adenoviridae)属病毒。术语"重组腺病毒'与术语"重组腺病毒载体"的同义，指肯,感染细胞的腺病毒科属病毒，其病毒基因组己经M常规的重组DNA技术修饰。术语重乡M
病毒还包括嵌合(或甚至多聚)载体，即使用来自一个以上的病毒亚型的互补编码序列构建的载体。
术语腺病毒科统指乳腺病毒属的动物腺病毒，包括但不限于人类，牛，羊，马，犬，猪，鼠和^H病毒亚属。特别是，人鄉病毒包A-F亚属以及其於血清型。例如，任何的腺病毒鄉1， 2， 3,4,4a^ 5,6,7， 7a^ 7《8,9,10,11 (AdllA和AdllP), 12,13,14,15,16,17， 18,19,20,21,22， 23,24,25,26,27,28,29,30, 31,32， 33, 34, 34a^ 35, 35p, 36, 37, 38, 39,40,41， 42, 43, 44, 45, 46,47,48,以及91都可以在本发明的细胞培养物中制备出。本发明的 实施中，腺病毒是或者衍生自人类腺病毒血清型2或者5 。
重组腺病毒是重组的腺病毒或者重组的腺病毒载体，其包含了突变的基因组；例如，突变的基因组可能是缺少片段或者包括一个或更多个另外的异源基因。在一个实施方式中，重组腺病毒载体是腺病毒载体递送系统，其具有蛋白IX基因的缺失(参见国际专利申请W095/11984,其全M鄉弓I并A^文)。在另一个实施方式中，腺病毒是一种选择性复制重组腺病毒或有^^牛地复制的腺病毒，即在正常细胞中减弱而在肿瘤细胞中保持病毒复制的腺病毒，参
见例如，Kirn^ D.等，Nat. Med 7:781 -787 (2001); Alemany, R.等NatureBiotechnology 18: 723-727 (2000); Ramachandra^ M等，Replicating Adenoviral
NewYork^pp. 321-343 (2003).
本发明的一个实施方式中，选择性复制重组腺病毒或腺病毒载体例如下面文献所述的那些已公开的国际申请号WO 00/22136和WO 00/22137;Ramachandra^ M.等,Nature Biotechnol. 19:1035-1041 (2001); Howe等，Mol. Then2(5):485-95(2000);和Demers,G等Cancer Research 63:40034008 (2003)。
选择性复制重组腺病毒还可以被描述为，但是不限于，"纖腺病毒"，"溶瘤复制腺病毒"，"复制腺病毒载体"，"有条件地复制的腺病毒载体"或"CRAV"。本发明的另一个实施方式中，如上所述，PEG化可以用于，由其他类醜毒载体弓胞的不利^她。例预括，但是不限于逆转录病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒(leniviral)载体和SV40病毒载体。
本发明一个实施方案中的重组腺病毒包括异源的核苷酸序列，例如但是不限于，具有期望的生物学特性或活性的部分，肽，多肽或者蛋白质。
在某些实施方式中，异源核苷酸序列编码生物反应调节剂，如细胞因子，细胞因子受体，激素，生长因子或生长因子受体。所述生物反应调节剂的非限制性例子包括干扰素(IFN)-a , IFN-IFNy,白介素(IL-l), IL"2,11^3, IL-4,E^5,11^6, IL-7, IL-9, LIO, IL"12， IL-15, IL-18, IL-23,红细胞生成素(EPO )，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF )，酸性成纤纟繊胞生长因子(aFGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，胸腺^M^淋巴细胞生成素(TSLP)， G]VK:SF， TNFR和TNFR配体^g^族成员，包括TNFRSF 18和TNFSF 18。在一4^ 实 式中，核苷,列编码干扰素，例如干扰素a-2b。(参见例如美国专利号:6,835,557,其全M31援引并入本文)。
在其他实施方式中，异源的核苷酸序列编码抗体。又一些实施方式中，异源的核苷,列编码嵌合或者融合蛋白。
在某些实施方式中，，的核苷酸序列编码属于重组腺病毒载体来源的种，亚组 体之外的不同种，亚组或腺病毒变体的病毒的抗原蛋白，多肽或肽。 在某些实施方式中，鄉的核苷,列编码获自和域源自病原微生物的抗原蛋 白，多月太或汰。
在另一本发明的实施方式中，鄉核苷,列是癌症治疗基因。这些基因 包括提高淋巴细胞抗肿瘤活性的那些，其表达产物提高肿瘤细胞的免疫原性的 基因，肿瘤抑制基因，毒素基因，自杀基因，多药耐受基因，反义序列，等等。 因此， 睐说，这项发明的腺病毒载体可以包含外源基因，所游卜源基因用
于表达有效地调节细胞周期的蛋白质，如p53， Rb，或分裂 ，或表达有效 诱导细胞死亡的蛋白质，如^j牛自杀基因胸苷激酶。
如本文中所j柳的术语，"rAd生产细胞'，"生产细胞邻"鹏细胞"是同 义词，意歸肖,M:提供病毒有效生长所需产品而增殖重组腺病毒的细胞。 对于重组腺病毒的培养可公开获得多种哺乳动物细胞系。例如，293细胞系 (Graham & Smiley, J. Gen Virol. 36:59- 72 (1977))已经被工程化从而弥补E1功能 的缺陷。
rAd生产细胞或细胞系可使用标准的细胞培养技术增殖(参见例如，R.I. Freshney, Culture of Animal CeIIs國A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Wiley-Liss， Inc. New YorK N.Y, 1987).
细胞可以在含血清或无血清^f牛下生长。悬浮培养可以被摇动，振动，搅
拌，滚动或搅动，以维持细胞在悬浮液中。
"A549"劍市癌细胞系，这是本领域公知的技术。在一个实船式中，A549 细胞是ATCC株CCL185。
重组腺病毒生产细胞或者生产细胞系可以通 领域任意已知哺乳动物细 胞培养方法增殖或者生长。增殖可以M5i单个步骤或者多步骤程序来完成。比 如，在单个步骤的增殖程序中，生产细胞从储存器中取出，直接接种到培养容 器，額卩里病毒生产将要进行。在多步骤的增殖禾聘中，生产细S^人存储器中 取出，然后M—些逐渐扩大尺寸的培养容器增殖，直到达到生产将要进行的 最终培养容器。在增殖的步骤中，细胞在为生长而最优化了的条件下生长。培 养剝牛，如温度，PH，溶解氧7K平等等是已知对于特定细胞系最佳的那些，这 对于本领:^术人员而言是显而易见的(参见例如，Animal Cell culture: APractical Approach 2nd edition, Rickwood^ D. and Hames, B.D. eds., Oxford University Press,
iiNew York (歷》。
在本领域已知的倒可合适的容器中，可以生长rAd生产细胞或rAd生产细 胞系，并且可以培养rAd生产细胞或生产病毒的iAd生产细胞。例如，可以在 生物发生器或者生物反应器中生鄉胞，并且培养感染的细胞。一I5^说，"生 物发生器"或'生物反应器'是指培养罐， 一般由不锈钢，或玻璃制成，容量0.5 升颇大，其包括搅拌系统，能注入C02气術荒的體和加氧體。通常情况 下，它配备有探针，所述探针测量生物发生器的内部参数，如培养的pH值，溶 解氧，纟鹏，罐压或某些理化参数(例如葡萄糖或谷氨,的消耗或乳酸和铵 离子的生产)。pH值，氧气和纟鹏探针连接到生物处理器，其恒定调节这些参 数。在另一实施方式中，该容器是WAVE生物反应^(WAVE Bioted^ Bridgewater， NJ,USA).
培养物中的细胞密度可以用本领域已知的任意方絲测定。例如，细胞密 度可用显微镜(例如，血细胞计数器)，或由电子细胞计数體(例如,COULTER COUNTER; AccuSizer780/SPOS单颗粒光^T帝(Single Particle Optical Sizer))来测定。
术语"感染"是指在一 定条件下将重组腺病毒暴露于细胞或细胞系以鹏细 胞被重组腺病毒感染。在已经被多个拷贝的给定的病毒感染的细胞中，病毒复 制和病毒体包装所需要的活性是协同的。因此，,条件被调整到让细胞能以 显著的概率被该病毒多重感染。提高细胞中病毒生产的条件的一个例子是感染 期中增加的病毒浓度。然而，可能旨细胞的病毒感染总数会过度，从而导致 对细胞的毒作用。因此，应努力维持在每毫升106至101()的范围，雌大约109
病毒体的病毒浓度的感染。化学剂还可被采用来增加细胞系的感染性。例如， 本发明提供了一种方法，通过包括钙蛋白酶抑制剂来增加细胞系对于病毒感染 性的感染性。可用于本发明实施的转蛋白,制齐啲实例包括钙蛋白酶抑制剂1
(也称为N-乙酰-亮氨酰-亮氨酰-norleucinal，商业上可获得于Boehringer Mannheim)。铐蛋白,制剂1已经t戯见察至,加细胞系对重组腺病毒的感染 性。
术语"在允i彌毒基因组复制的条件下培养"是指保持受感染的细胞的条件 以允许该病毒在细胞中增殖。控制条件以便最大化旨细胞生产的病毒颗粒的 数量是理想的。因此，有必要进行监观诉口控制反应条件，例如，、鹏，溶解氧和pH水平。商用生物反应器，如CelliGen plus生物反应器(可以从New Brunswick Scientific, Inc. 44 TaJmadge Roa4 Edisor^ NJ商业获得)有监测和维持所 述参数的體。优化感染和培养斜判贿所不同，但是，病毒的有效复制和生 产的条件是本领域技术人员考虑到生产细胞系的已知特性，该病毒的特性，以 及生物反应器的，而可获得的。
病毒，例如腺病毒，可以在这些细胞中生产。病毒可以通过培养细胞来生 产；任选地加入新鲜的生长±音养基给这些细胞；给这些细胞接种病毒；孵育接 种细胞(ftf可一段时间)；任鹏给接种的细胞加入雜羊生长培养基；和任iMk 从细胞和培养基收获病毒。 一鹏说，当通过常规方法测定的病毒颗粒的浓度 开始达到平稳状态，开始实施收获，所述常规方法例如使用Resource Q柱的高 效液相色谱，如Shabram,等Human Gene Ther邵y 8:453465 (1997)所述。
新鲜的生长培养基可以在任意点提供给接种的细胞。例如，可以通过灌注 、添加新鲜培养基。培养基的交换会大大增加细胞中病毒的生产。在本发明的一 个实船式中，细胞的培养基接魏续两次効^一次是在感染时，另外一次是 在感染后一天。
用于生产病毒的细胞可来自于在无血清培养基条件下的冷冻细胞系或在含 血清培养基条件下的冷冻细胞系(如，来自冷冻细胞库)。
为鉴定培养物中病毒的存在，即表明培养物中病毒蛋白的存在，的合适方 ^括免疫荧光试验，其可使用针对病毒蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体(Von B"0low等，in Diseases of Poultry. 10th editioi^ Iowa State University Press),聚合酶 链反应(PCR)或者嵌套式PCR (Soine等，Avian Diseases 37:467476 (1993》, ELISA (Von Biilow等，in Diseases of Poultry, 10th editioi^ Iowa State University Press))，通过流式细胞术分析的六邻体表达(Musco等Cytometry 33:290-296 (1998)，病毒中和，或鉴定特定病毒蛋白的樹可普通组织化学方法。
培养物中腺病毒量的滴定可以用本领域己知的技术实施。在一44寺定的实 施方式中，病毒颗粒的浓度通过如Shabram,等Human Gene Therapy 8:453465 (1997)所述的Resource Q测定而确定。本文中所{顿的术语"翻军"指的是含病毒 细胞的,。裂解可用本领域公知的多种技术实现。例如，哺乳动物细胞可以 招氏压(100-200磅/英寸2分压)斜牛下，ffl31匀浆，M31微流化，^M31常规 冻融方法而被裂解。夕卜源游离DNA/RNA可以M51用DNA/RNAse的糊军而去含有腺病毒的细胞可以7令冻。腺病毒可以从含病毒的细胞和培养基中收获。 在一个实膽式中，腺病毒同时从含有病毒的细胞和培养基中收获。在一^# 殊的实施方式中，在同时裂解含有病毒的细胞和澄清培养基中否贝哙干扰病毒 纯化的细胞碎片的条件下，生产腺病毒的细胞以及培养基进行交叉流1M过滤，
如例如美国专利号6,146,891所描述的那样。
术语"收获"是指从培养基收集含有腺病毒的细胞，可包括从培养基收集腺 病毒。这可由传统的方法实现，如差速离心或色谱手段。在这一阶段，收获的 细胞可冷冻储存或通过裂解和纯化进一步被加工以分离病毒。外源游离的 DNA/RNA可Mil用DNAse/RNAse，如BENZONASE(American International Chemicals, Inc.)的,而被去除。
病毒收 可皿例如超滤或切向流过滤的方法被进一步加工以浓縮该病 毒，如美国专利号6,146,891和6,544,769所描述的那样。
术语"回收"是指从l^解的生产细胞，任选地从上清培养基分离出基本上纯 的重组病毒颗粒群。本发明的的细胞培养物中生产的病毒颗粒可MW领域公 知的任何方法被分离和纯化。常规的纯化技术如色谱法或差别密度梯度离心的 方法可被^ffl。例如，病毒颗粒可通过以下方法纯化氯化铯梯度纯化，柱或 分批色谱法，二乙氨乙基(DEAE )色谱,aruna等Virology 13: 264-267 (1961); 幻emperer等,Virology 9: 536-545 (1959); Philipson等,Virology 10:459465 (I960》, 羟 1灰石色谱法(美国专利申请公开号US2002/0064860)和使用其他树脂如 均质交联多糖的色谱法，其包括软凝胶(如琼月離)，大孔聚合物'throughpores"， "tentacular"吸附剂，其具有旨在加快与蛋白质的相互作用而设计的触手 (tencales)(例如，fractogel)和基于坚硬外壳中的软凝胶的材料，它利用软;疑 胶的高容量和复合材料的冈'J度(例如，Ceramic HyperD F) (Boschetti, Chromatogr. 658:207 (1994); Rodriguez J. Chromatogr. 699:47-61 (1997》。在本发明的雌实施 中，病毒^K1S本^^M Huyghe等,Human Gene Therapy 6:1403-1416 (1995)的 柱色谱法纯化的，所述方法如Shabram等，美国专利5,837,520，其于1998年 11月17日出版，以及美国专利6,261,823戶鹏，它们的全部教导M:援引并入 本文。
实施例
14一般i鹏从Molecular Therapy, 2005 Aug;12(2):254國63描述的方案，我们评 价了在给予了 PEG化或者没有PEG化的重组腺病毒的小鼠中的心血管反应。 EKG和心率都被评价。重组腺病毒用SPA-PEG5K连皿lj来PEG化。在多个实 验中结果基于n是4和5。
观察到，在三个3拉实验的一半被治疗小鼠中，rAd-载体的PEG化抑制血 流动力学反应。在正常小鼠中禾,具有大约每病毒体600—800PEG分子的rAd-载体可获得血流动力学心血管反应的抑制。
PEG 4W全身体内转导的效果在通过静脉内途径注入1 x 10"刺針布或 PEG化rAd-载体颗粒的小鼠中3天后进行刑介。生物分布通过定量实时PCR和 RT-PCR在肝，脾，肾上腺，肺，小及大肠，肾和心脏组织中进行刑介，以评 价各种形式的相对转导能力。令人惊讶的是，刺斷布和PEG-rAd载條各器官 的转导效率是相对相等的。转基因特定DNA的生物分布在所有被检查的器官中 并且相比于看家GAPDH基因的表达基本上相等。这些结 明，转导效率是 和利用具有600—800PEG ^^/病毒体的rAd-PEG的非PEG化rAd-载体类似的。
还在微敏反应模型中测试了 rAd-载体PEG化離不利事件的能力。这种 模型为劍门樹共了检查表面上具有不同程度的PEG化的rAd-PEG载体减轻徵 敏反应，以及a柳制与慢性炎症相关的加剧反应所需要的PEG似呈度(即，每 个病毒体颗粒共^i接的PEG分子数)相关联的能力。高于彌毒体1250PEG 分子，最高达1600PEG分子(在PEG化反应中8%SPA-PEG)的rAd-载体的 PEG化导致类过敏反应的抑制。
本发明不限于此处所述的实施例。事实上，本发明的多种修饰，除了本文 所述的那些之外，从，说明对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修 饰意图落在所附权利要求的范围内。
贯穿本申请引用了专利，专利申请，出版物，产品描述，Genbank登录号
以及方案，为了所有目的，它们的全部公开内容M:援弓I并A^文。
权利要求
1、一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利效应的方法，所述方法包括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中腺病毒病毒体的PEG化程度是在大约每病毒体400PEG分子到大约每病毒体1250PEG分子之间。
2、 权利要求1所述的方法，其中所述不利 她是心血管不利效应。
3、 权利要求1所述的方法，其中所述不利'鹏是类过敏反应。
4、 权利要求1所述的方法，其中所述不利效应是凝血紊乱。
5、 权利要求1所述的方法，其中所述不利效应是炎症。
6、 权利要求1所述的方法，其中PEG化重组腺病毒的转导效率等于或者 高于没有PEG化的重组腺病毒的转导效率。
7、 权利要求1所述的方法，其中所述PEG连接剂是具有5kD的PEG舒 量的PEG-SPA连,U。
8、 权利要求1所述的方法，其中所繊病毒病毒体的PEG似呈度是在大 约每病毒体600PEG分子到大约,毒体1000PEG M之间。
9、 一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利效应的方 法，所述方法包括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中所M病毒 病毒体的PEG 4^M高于大约^毒体1250PEG分子，最高达大约每病毒体 1600PEG舒2、权利要求1所述的方法，其中所述不利效应是心血管不利效 应。
10、 权利要求9所述的方法，其中所述不利^她是类过敏反应。
11、 权利要求9所述的方法，其中所述不利效应是凝血紊乱。
12、 权利要求1所述的方法，其中所述不利 赃是炎症。
13、 权利要求l所述的方法，其中所述PEG雜剂是具有5kD的PEG分 子量的PEG國SPA连翻。
14、 一种减轻与用于基因治疗的重组腺病毒全身给药相关的不利效应的方 法，所述方法包括将PEG化的重组腺病毒病毒体给予受试者，其中所 病毒 病毒体的PEG化禾S^是在大约,毒体400PEG M到大约每病毒体1600PEG 針之间。
全文摘要
本发明涉及用于基因治疗，特别是使用PEG化腺病毒的基因治疗，的改进方法。特别地，本发明提供了用于减轻与用于基因治疗的重组腺病毒的全身给药相关的不利效应的方法和组合物。
文档编号A61K48/00GK101678117SQ200780035940
公开日2010年3月24日 申请日期2007年9月28日 优先权日2006年9月29日
发明者D·M·拉法斯, V·T·蔡 申请人:坎吉有限公司