一种簕欓悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明涉及一种簕欓悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法，包括叶片的消毒、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养、植株再生、炼苗移栽等步骤。采用本发明对簕欓进行组织培养，不受季节、气候地域等因素的制约，节省土地，速度快，质量高，便于集约化管理和工厂化生产。
【专利说明】
一种簕攩悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法
技术领域
[0001]本发明涉及簕攩组织培养的快繁方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]繁^,Zanthoxylumarice/wae，芸香科，又名狗花椒、鹰不泊，常绿灌木或乔木，高可达12米，干和枝有皮刺，皮刺三角形，红褐色，水平直出或稍向上，单数羽状复叶，列生;小叶7-23，纸质到革质，矩圆形、倒卵状矩圆形或为不对称的菱形，长2-6厘米，全缘或沿中部以上有不明显的锯齿，无毛，上面有光泽，伞房状圆锥花序，顶生;花小而多，淡青色;雌花较雄花稍大，无退化雄蕊，心皮2，分离至基部，果紫红色，有粗大腺点，顶端正有极短喙。分布于福建、广东、广西，疏林中，具有祛风利湿，活血止痛之功效，根可治疗黄疸型肝炎，肾炎水肿，风湿性关节炎;果用于治疗胃痛，腹痛;叶主治跌打损伤，腰肌劳损，乳腺炎，疖肿，目前尚未发现关于簕攩繁殖技术的相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种簕攩的快速繁殖方法，采用本发明对簕攩进行组织培养，不受季节、气候地域等因素的制约，节省土地，速度快，质量高，技术密度性高，便于集约化管理和工厂化生产。
[0004]本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的:
取簕攩的叶片，在洗衣粉中浸泡2min，流水冲洗20min，超净工作台上2.5%次氯酸钠处理5min，1%溴水处理5min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的簕攩叶片接入培养基配方为NH+IAA0.lmg/L+ZT2mg/l诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，诱导出来的愈伤组织放入不加琼脂的上述液体培养基配方中，110r/min旋转摇床培养15d，建立分散性好、均匀、生长迅速的悬浮细胞系，黑暗条件下进行，温度28± TC，pH5.8，培养条件为在40mL培养液中接种量为0.5g，18d继代I次，继代时保留I/3体积的旧培养液，培养出来的悬浮细胞转移到再生培养基1/2NH+硝酸银10-15mmol/L+0.1-0.2mg/ml活性炭中获得再生植株，附加蔗糖35g/L，琼脂6.5g/L，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28土 1°C、40001x白色荧光灯下，16h/8h光周期条件下生根，簕攩试管苗生根30天后，将封口膜打开，在自然光照下炼苗7天，选取根长5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已灭菌的基质(河沙:椰绒:珍珠岩=1:1:1)中，1/2MS营养液喷洒，烧杯罩住保温保湿，一个月后可见叶片、根明显增长，新叶萌发。
[0005]采用本发明制备的簕攩悬浮细胞增殖率高，再生植株成活率高，能耗少，有助于簕攩的大规模开发利用。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1取簕攩的叶片，在洗衣粉中浸泡2min，流水冲洗20min，超净工作台上2.5%次氯酸钠处理5min，1%溴水处理5min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的簕攩叶片接入培养基配方为NH+ IAA0.lmg/L+ZT2mg/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L， 诱导出来的愈伤组织放入不加琼脂的上述液体培养基配方中，ll〇r/min旋转摇床培养15d， 建立分散性好、均匀、生长迅速的悬浮细胞系，黑暗条件下进行，温度28±l°C，pH5.8,培养条件为在40mL培养液中接种量为0.5g，18d继代1次，继代时保留1/3体积的旧培养液，培养出来的悬浮细胞转移到再生培养基1/2NH+硝酸银10mmol/L+0.1mg/mL活性炭中获得再生植株，附加蔗糖35g/L，琼脂6.5g/L，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28土 rC、40001x白色荧光灯下，16h/8h光周期条件下生根，簕攩试管苗生根30天后，将封口膜打开，在自然光照下炼苗7天，选取根长5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已灭菌的基质(河沙:椰绒:珍珠岩=1:1:1)中，1/2MS营养液喷洒，烧杯罩住保温保湿，一个月后可见叶片、根明显增长，新叶萌发，再生成活率87%。
[0008]实施例2取簕攩的叶片，在洗衣粉中浸泡2min，流水冲洗20min，超净工作台上2.5%次氯酸钠处理5min，1%溴水处理5min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的簕攩叶片接入培养基配方为NH+ IAA0.lmg/L+ZT2mg/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L， 诱导出来的愈伤组织放入不加琼脂的上述液体培养基配方中，ll〇r/min旋转摇床培养15d， 建立分散性好、均匀、生长迅速的悬浮细胞系，黑暗条件下进行，温度28±l°C，pH5.8,培养条件为在40mL培养液中接种量为0.5g，18d继代1次，继代时保留1/3体积的旧培养液，培养出来的悬浮细胞转移到再生培养基1/2NH+硝酸银15mmol/L+0.2mg/mL活性炭中获得再生植株，附加蔗糖35g/L，琼脂6.5g/L，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28土 rC、40001x白色荧光灯下，16h/8h光周期条件下生根，簕攩试管苗生根30天后，将封口膜打开，在自然光照下炼苗7天，选取根长5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已灭菌的基质(河沙:椰绒:珍珠岩=1:1:1)中，1/2MS营养液喷洒，烧杯罩住保温保湿，一个月后可见叶片、根明显增长，新叶萌发，再生成活率90%。
[0009]实施例3取簕攩的叶片，在洗衣粉中浸泡2min，流水冲洗20min，超净工作台上2.5%次氯酸钠处理5min，1%溴水处理5min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的簕攩叶片接入培养基配方为NH+ IAA0.lmg/L+ZT2mg/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L， 诱导出来的愈伤组织放入不加琼脂的上述液体培养基配方中，ll〇r/min旋转摇床培养15d， 建立分散性好、均匀、生长迅速的悬浮细胞系，黑暗条件下进行，温度28±l°C，pH5.8,培养条件为在40mL培养液中接种量为0.5g，18d继代1次，继代时保留1/3体积的旧培养液，培养出来的悬浮细胞转移到再生培养基1/2NH+硝酸银10mmol/L+0.2mg/mL活性炭中获得再生植株，附加蔗糖35g/L，琼脂6.5g/L，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28土 rC、40001x白色荧光灯下，16h/8h光周期条件下生根，簕攩试管苗生根30天后，将封口膜打开，在自然光照下炼苗7天，选取根长5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已灭菌的基质(河沙:椰绒:珍珠岩=1:1:1)中，1/2MS营养液喷洒，烧杯罩住保温保湿，一个月后可见叶片、根明显增长，新叶萌发，再生成活率94%。
【主权项】
1.一种簕攩悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法，包括叶片的消毒、愈伤组织的诱导、 悬浮细胞的培养、植株再生、炼苗移栽，其主要步骤如下:(1)取簕攩的叶片，对其进行消毒处理；(2)将步骤(1)消毒处理过的簕攩叶片接入培养基配方为NH+IAA0.1mg/L+ZT2mg/L诱导 培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L;(3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织放入不加琼脂的上述液体培养基配方中，llOr/min 旋转摇床培养15d，建立分散性好、均匀、生长迅速的悬浮细胞系；(4)取步骤(3)培养出来的悬浮细胞转移到再生培养基1/2NH+硝酸银10-15mmol/L+ 0.1-0.2mg/ml活性炭中获得再生植株，附加蔗糖35g/L，琼脂6.5g/L;(5)步骤(4)获得的再生植株进行炼苗移栽。2.按照权利要求1所述的一种簕攩悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步骤(1)中所述簕攩无菌叶片的获得为，取簕攩的叶片，在洗衣粉中浸泡2min，流水冲洗 20min，超净工作台上2.5%次氯酸钠处理5min，1%溴水处理5min，无菌水冲洗5遍。3.按照权利要求1所述的一种簕攩悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步骤(2)和(3)中愈伤组织诱导、悬浮细胞培养、体细胞胚的诱导均在黑暗条件下进行，温度 28±l°C，pH5.8。4.按照权利要求1所述的一种簕攩悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步骤(3)悬浮细胞的培养条件为在40mL培养液中接种量为0.5g，18d继代1次，继代时保留1/ 3体积的旧培养液。5.按照权利要求1所述的一种簕攩悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步骤(4)中植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到 28± 1°C、40001x白色荧光灯下，16h/8h光周期条件下生根。6.按照权利要求1所述的一种簕攩悬浮细胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步骤(5)炼苗移栽的方法为簕攩试管苗生根30天后，将封口膜打开，在自然光照下炼苗7天， 选取根长5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已灭菌的基质(河沙:椰绒:珍珠岩=1:1:1) 中，1/2MS营养液喷洒，烧杯罩住保温保湿，一个月后可见叶片、根明显增长，新叶萌发。
【文档编号】A01H4/00GK106069759SQ201610455631
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】杨成东
【申请人】南京泽朗生物科技有限公司