试剂盒还包括 RT-PCR增强剂，该RT-PCR增强剂为浓度是 100 ~500mmol/L的Mn(OAc) 2(Manganous acetate，即乙酸猛）。
[0070] 优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒进一步还包 括：
[0071] RNA提取溶液I:由质量/体积比为0. 2%~1. 0%的十二烷基硫酸钠、体积/体积 比为1. 0%~4. 0%的曲拉通，0. 2mol/L~1. 0mol/L的异硫氰酸胍、100~400μg/ml的磁 珠组成；
[0072]RNA提取溶液II:浓度为100~300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为 100~300mmol/L的氯化钠；该RNA提取溶液II的pH为6. 5±0. 2 ;
[0073]RNA提取溶液III:由体积/体积比为0. 1 %~1. 0 %的曲拉通、浓度为100~ 300mmol/L的氯化钠；
[0074] RNA提取溶液IV :矿物油。
[0075] 本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒所采用的RNA提取溶 液能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适用于人或动物血清、血浆、粪便标本中的HAV 的RNA提取和PCR检测。
[0076] 本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒进一步还包括 HAV定量参考品，该HAV定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓 度分别为 5.00E+06copies/m(A)、5.00E+05copies/ml(B)、5.00E+04copies/ml(C)和 5.00E+03copies/ml(D)。
[0077] 请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测 试剂盒的使用方法流程示意图。将本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试 剂盒用于检测血浆、血清等样本中HAV-RNA的操作步骤为：
[0078] S01 :按照人份取体积比为1000-1200 :1的RNA提取溶液I和内标，充分混和均匀 并形成RNA提取试剂I-mix，瞬时离心后备用；
[0079] S02 :根据待测样本（血浆、血清等待测样本）、阴性对照、阳性对照的数量，取体积 比为49 :1的PCR反应液和RT-PCR增强剂，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备 用；
[0080] S03 :在灭菌离心管中加入200μ1~lmlRNA提取溶液I-mix，然后加入100μΙ~ lml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心后备用；
[0081]S04:在步骤S03瞬时离心后备用的溶液中加入50μ1~400μ1RNA提取溶液II， 震荡混匀10秒钟后，室温静置10~30分钟；
[0082] S05 :静置结束后瞬时离心，瞬时离心结束后将灭菌离心管置于磁珠分离器上， 2~5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；
[0083] S06 :在备用的磁珠内加入400μ1~lml的RNA提取溶液III和100μ1~500μ1 的RNA提取溶液IV，震荡混匀3~7秒钟后瞬时离心，将瞬时离心后的灭菌离心管再次置于 磁珠分离器上进行分离；
[0084] S07 :2~5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入灭菌离心管底部，从底部开始缓 慢将液体完全吸出丢弃，静置1~3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃，上清液中的上 层液保留备用；
[0085]S08:在上述保留备用的上清液中的上层液加入10μ1~100ulRNA洗脱液，将灭 菌离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3~4次，室温静置5~30分钟后将灭菌离心管 再次置于磁珠分离器上2~5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1. 5ml灭菌离心管中；
[0086] S09 :根据根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量向八联管中加入45μ1的 PCR-mix，并取步骤S08的新的灭菌离心管中处理好的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μ1 加入到上述PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
[0087] S10 :将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
[0088] 本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒在对HAV的RNA进行提 取时所选用的方法为吸附效果好、易于纯化的磁珠法，使用磁珠法提纯HAV的RNA能够 有效去除复杂样本中的PCR抑制物，从而获得高纯度和高得率的核酸，大大提高检测的 灵敏度、准确度和稳定性，其中，检测的灵敏度可达50copie/ml，检测范围为5. 00E+01~ 5.00E+09copies/ml〇
[0089] 进一步，将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试包括以下步骤：
[0090] (1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考 品浓度；
[0091] (2)焚光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None)检测HAV; 选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标。
[0092] (3)荧光定量PCR反应条件为：
[0093]
[0094] 结果分析
[0095] 反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可 以手动调苄基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值和结果。扩 增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设 定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。对 于测定Ct值< 38的样本，报告为HAV-RNA阳性；对于测定无Ct值的样本，同时，内标检测 为阳性（Ct值彡40)，报告为HAV-RNA阴性。若内标Ct值>38或无显示，则该样本的检测结 果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。对于测定Ct值>38的样本，同时， 内标检测为阳性（Ct值< 40)，报告为低于检测下限。
[0096] (1)线性范围
[0097] 荧光PCR扩增结束后，输入HAV定量参考品A-D的浓度，通过软件自助分析可以得 知各样本的荧光扩增曲线以及各样本的定值结果（浓度值）。阳性对照和阴性对照的结果 能够验证实验的有效性，HAV定量参考品A-D的扩增曲线和标准曲线请参考附图2和3。
[0098] 从附图2和3可以看出，PCR反应体系的扩增曲线一致性较好，且线性相关系数 为-0. 999,说明具有良好的线性关系，同时也能够说明本试剂盒的线性范围为5. 00E+09~ 5. 00E+01copies/ml，检测下限可达 50copies/ml。
[0099] (2)准确性、灵敏性
[0100] 本发明实施例提供的检测试剂盒对HAV不同基因型（I、11、III、IV、V和VI型） 的HAV核酸进行荧光PCR反应测试，反应的测试结果请参考附图4。从附图4中能够看出 Ct值从21-41均具有很好的扩增曲线，且线性范围良好，由此可以说明本检测试剂盒具有 很高的灵敏度。
[0101] 从附图4中还可以看出，本发明实施例提供的检测试剂盒对HAV不同基因型的检 测结果均为阳性，且阳性符合率为100%，由此可以说明本检测试剂盒具有很高的准确性。
[0102] (3)特异性
[0103]请参考附图5,附图5示出了本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测 试剂盒对正常人血清样本、或者HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本进行荧光PCR反 应测试的扩增曲线图。
[0104] 从附图5中可以看出，本发明实施例提供的检测试剂盒通过对正常人血清样本、 或者HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本进行荧光PCR反应测试，反应的结果显示均为 阴性，未见扩增产物，且阴性符合率为100%。通过与对HAV不同基因型的HAV核酸进行荧 光PCR反应测试结合进行比较可以得出，本发明实施例提供的检测