uM 0.4 ul 0.2uM 样品溶液 2Ul ddHaO 7.2Ul 总体巧 20Ul
[0067] 加好反应体系后，上机检测。反应条件：95°C10分钟预变性后，95°C15秒一 60°C1 分钟，40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置。
[006引 PCR数据采用2 法进行比较分析。具体方法为：ct目的基因-Ct内参基因= ACt, A Ct实验组-A Ct对照组=A A Ct,表达量倍数变化=。QPCR检测结果见表 4。
[0069] 表4.上皮干/祖细胞及骨髓间充质干细胞
[0072] 实施例2 :细胞成肝诱导
[0073] Matrigel准备：使用接种细胞至Matrigel3D培养体系的前一晚，将-20°C中 Matrigel放于4°C环境中溶解。第二日Matrigel溶解为液状，在冰盒中操作，所用实验器 械及耗材均需在4°C中预冷准备后方可使用。将Matrigel与上皮细胞培养基W2比1比例 混合均匀，添加至24孔细胞培养板中，每孔350ul，铺平。置入37°C细胞培养箱中，约30分 钟后，Matrigel凝固为凝胶状，可接种细胞使用。
[0074] 细胞准备：从小诞腺组织中原代培养的上皮干/祖细胞扩增培养至P4进行成肝 诱导实验。P3细胞达到80~90%融合时，吸走培养瓶中原有培养基，用IXPBS洗涂细胞 2次，吸去PBS。加入适量0. 25%膜酶，轻轻旋转，使0. 25%膜酶均匀覆盖培养器皿表面， 37°C消化2-3分钟，显微镜下可见细胞间隙增大，细胞变圆，用手轻拍培养器皿的壁，当大 部分细胞都脱落后立即加入含10%FBS完全培养基终止消化。用吸管吸取液体，轻轻吹打 培养器皿表面，反复3-5次，使细胞彻底脱离瓶皿底壁，将细胞移入离屯、管中，再向培养瓶 中加入IXPBS洗1-2次，并将洗液一并转移至离屯、管中。离屯、（244g，4分钟），吸去上清 液。为将终止液中的血清洗干净，加入5mLIXPBS重悬细胞，再次离屯、（244g，4分钟）。弃 去上清，加入5mL的上皮细胞培养基重悬细胞沉淀，用吸管轻轻吹打收集的细胞悬液，取样 计数。W每孔约15000个细胞比例接种至Matrigel3D培养体系中，每孔添加上皮细胞培养 基500ul(图6)。接种1天后，上皮干/祖细胞可长入Matrigel凝胶中，换成肝诱导液开始 诱导。每孔添加500ul成肝诱导培养基。（还可W加入lOOmmol/L的苹果酸，加入后，可缩 短诱导时间。）每3天更换成肝诱导液，约诱导21天后形成肝细胞样细胞和胆管细胞样细 胞（图7)。经IF检测有肝细胞样细胞特异性蛋白ALB、CYP3A4、CK18、CK19表达（图8)。 QPCR检测显示ALB、AFP、CK18、S0X17、CXCR4 表达增高（表 5)。
[00巧]表5.小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱导QPCR结果
[0081] ICG摄取检测：诱导21天后，更换含ICG的培养液（终浓度Img/mL)，在细胞培养 箱中解育30min。吸去培养基，1XPBS清洗3次。置显微镜下观察细胞染色情况，胞浆浅蓝 色为阳性。结果显示：小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱导为阳性，对照组为阴性（图9)。
[0082] PAS染色检测糖原合成能力：诱导分化21天后，制备细胞涂片标本，用甲醒酒精固 定液固定1分钟。加入过舰酸溶液（periodicacid)，室溫反应5分钟，蒸馈水洗3次，加入 希夫试剂（Schiff'Sreagent),室溫反应15分钟。蒸馈水洗立次，加入苏木精染色90秒， 蒸馈水洗3次，显微镜下观察，紫红色为阳性。结果显示：小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱 导为阳性，对照组阴性（图10)。
[0083] 细胞色素功能检测：检测利用Promega公司的Luminescence-basedP45〇-Glo Assays分别检测CYP3A4(Luciferin-IPA，货号V9001)和CYP2C19(Luciferin-HEGE，货 号V8881)。CYP3A4 :小诞腺上皮干/祖细胞3D培养环境下成肝诱导2天后，吸去培养基， 1XPBS清洗3次，每孔添加含3ymLuciferin-IPA但不含血清的完全培养基300ul，37°C 细胞培养箱中解育60min。吸出上清液加至96孔白色不透板中每孔50ul，每孔再添加50ul LuciferinDetectionReagent,室溫下避光反应20min，使用酶标仪测定发光度，结果见图 11。CYP2C19 :小诞腺上皮干/祖细胞3D培养环境下成肝诱导2天后，吸去培养基，1XPBS清 洗3次，每孔添加含100ymLuciferin-HEGE但不含血清的完全培养基300ul，37°C细胞培 养箱中解育地。吸出上清液加至96孔白色不透板中每孔50ul，每孔再添加50ulLuciferin DetectionReagent,室溫下避光反应20min，使用酶标仪测定发光度，结果见图12。
【主权项】
1. 一种采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的方法，其 特征在于，按照如下步骤进行： (1) 制备人小涎腺上皮干/祖细胞： a) 预处理人小涎腺组织； b) 在角质细胞培养基中贴壁培养预处理后的人小涎腺组织，培养分离出小涎腺上皮干 /祖细胞； 小涎腺上皮于/祖细胞在上皮细胞培养基中进一培养扩增； (2) 人小涎腺上皮干/祖细胞诱导分化为肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞，接种人小 涎腺上皮干/祖细胞于平面培养体系或3D培养体系中，添加含有生长因子的上皮干/祖细 胞成肝诱导培养基，经过21天诱导培养后获得肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞。2. 根据权利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样 细胞的方法，其特征在于，所述预处理人小涎腺组织的步骤为： 将小涎腺组织转移到培养皿中，用小剪刀去除多余的结缔组织，分离得到完整的小涎 腺，吸去培养皿中的全部液体，用眼科剪将其剪成大约Imm3的碎块。3. 根据权利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样 细胞的方法，其特征在于，所述贴壁培养预处理后的人小涎腺组织的步骤为： 用小镊子将人小涎腺组织碎块均匀的铺于培养瓶底部，间距平均5_，加好培养基后竖 立放于培养箱中，添加5ml角质细胞培养基，6至8小时后放倒培养瓶，使组织块完全浸在培 养液中，每3天更换培养基，7天后，人小涎腺组织长出鹅卵石状或铺路石状的原代细胞。4. 根据权利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样 细胞的方法，其特征在于，所述小涎腺上皮干/祖细胞进一步培养和扩增的步骤为： 当细胞达到70-80%融合时，进行传代，吸走培养瓶中原有培养基，用IXPBS洗涤细胞 2次，吸去PBS，加入0. 25%胰酶，旋转，使胰酶均匀覆盖培养器皿表面，37°C消化3分钟，显 微镜下可见上皮干/祖细胞细胞间隙增大，细胞形态变圆，此时加入含10 %FBS完全培养基 终止消化，再次用吸管吸取液体，轻轻反复3-5次吹打培养器皿表面，使上皮干/祖细胞彻 底脱离瓶皿底壁，将细胞移入离心管中，再向培养瓶中加入IXPBS洗1-2次，并将洗液一并 转移至离心管中，244g离心5分钟，吸去上清液，弃去上清，加入5mL上皮细胞培养基重悬细 胞沉淀，用吸管轻轻吹打收集的细胞悬液，取样计数，接种细胞悬液于培养皿中，之后细胞 每3天更换上皮细胞培养基，第一次按I: 1传代，之后按1 : 3或1 : 4传代。5. 根据权利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样 细胞的方法，其特征在于，所述小涎腺上皮干/祖细胞诱导分化为肝细胞样细胞和胆管细 胞样细胞的步骤为： 小涎腺干/祖细胞在平面培养系统中培养扩增，当细胞增殖到85%融合时，可接种至Matrigel3D培养体系中用于成肝诱导，Matrigel3D培养体系制备方式为将充分溶解后 的Matrigel与上皮细胞培养基以2比1比例混合均勾，每孔350ul添加至24孔细胞培养 板中，铺平，置入37°C细胞培养箱中，约30分钟后，Matrigel凝固为凝胶状，可接种细胞使 用，胰酶法消化平面培养系统中小涎腺干/祖细胞至单细胞悬液并计数，接种至Matrigel 3D培养体系中，比例为每孔15000个细胞，并加入500yL上皮细胞培养基，待细胞培养1天 后换液，每孔加入500yL成肝细胞诱导培养基，随后每三天换液，诱导培养21天左右后，小 涎腺干/祖细胞转变成肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞。
【专利摘要】本发明公开了属于组织工程产品制备技术领域的一种采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞及胆管细胞样细胞的方法及应用。本发明的方法从人小涎腺组织体外分离培养出上皮干/祖细胞，并在上皮细胞培养基中进一步培养扩增，之后在含生长因子的成肝诱导培养基中，通过平面培养或三维培养体系，诱导分化获得肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞。本发明的优点是取材来源广，易于切取，创伤微小，口内供区隐蔽，制备的肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞可用于肝细胞的生理功能或病理变化的研究、肝脏疾病的细胞模型的建立、体外药物试验、体外毒性试验、体外生物工程化的类肝器官的构建、体内肝细胞移植治疗肝病。
【IPC分类】C12N5/074, C12N5/071
【公开号】CN105219698
【申请号】CN201510313877
【发明人】赵振民, 张辰, 张翔宇, 吕璘, 韩婷璐, 童海州, 刘磊, 杜水果
【申请人】赵振民
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年6月10日