一种提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微藻生物技术领域，特别是设及一种既能提高小球藻对高浓度苯酪的 耐受性，又能提高小球藻对高浓度苯酪降解率的方法。
【背景技术】
[0002] 水是生命之源，然而随着经济的发展，人们生活水平日益提高，冶金、化工、电锻、 造纸、印染、制革等行业随之迅速发展，各种有毒有机物的排放量日益增多。酪类化合物主 要存在于炼油、煤气洗涂、炼焦、造纸、合成氨、木材防腐、石油化工、化学、制药、油漆、涂料、 塑料农药等工业废水中。苯酪是一种高毒物质，可W通过皮肤接触或经口腔进入人体，与细 胞原浆中的蛋白质接触形成不溶性蛋白而使细胞失去活性，对皮肤和粘膜具有强烈的腐蚀 作用，对神经系统也具有较大的危害。
[0003] 工业废水中苯酪浓度范围为600-42000mg/l，文献调研发现，实验室中使用的 菌类（芽抱杆菌）能处理的最大苯酪浓度为2000mg/l，其对苯酪的降解率为10.42% [Banerjee,A.andA.K.Ghoshal,PhenoldegradationbyBacilluscereus:Pathwayand kineticmodeling.BioresourceTechnology, 2010. 101 (14) :p. 5501-5507]，实验室中使 用的微藻（小球藻）能处理的最大苯酪浓度为700mg/l，初始接种密度为6. 3g/L时能将浓 度为 800mg/L的苯酪经过 8 天能被完全降解[Klekner,V.andN.Kosaric,DEGRADATIONOF P肥NOLSBYALGAE.化vironmentalTechnology，1992. 13 巧）：p. 493-501.]，但其初始接种 密度为3. 4g/l，需要大约7天能将700mg/L苯酪完全降解。钢铁工业水污染排放标准规定， 企业废水总排放口要求挥发酪的含量应<0. 5mg/l，因此，寻找一种简单、高效、快捷的含苯 酪废水处理方法至关重要。
[0004] 20 世纪 50 年代，Oswald等[Oswal抓J，GotaasHB，GoluekeCG，etal.Algae inwastetreatment[J].SewageandIndustrialWastes, 1957,29(4):437-457.]提出利用 微藻处理污水，奠定了藻类污水处理技术的基础。
[0005] 苯酪废水流入江河，可导致鱼类大量死亡，从而破坏水体的氧平衡。藻类不仅可W 降解苯酪，还可W通过光合作用产生大量氧气，减少水中生物的死亡及水体因缺氧而产生 的恶臭气味。此外，藻类能够去除废水中含氮、含憐化合物，减少水体富营养化，同时能够富 集重金属离子，降解有毒有机物。利用藻类处理废水具有净化效率高、系统建造运行费用 低、操作简单等优点。因此，用藻类处理污水[VoleskyB,SchiewerS.In=FlickingerMC Drew(eds),Encylopediaofbioprocessengingeering.Wiley,NewYork, 1999:433-453.] 在水质的改善中得到越来越广泛的应用。
[0006] A.比Scragg[Scragg,A.吐，TheeffectofphenolonthegrowthofChlorella vulgarisandChlorellaVT-1.EnzymeandMicrobialTechnology, 2006. 39(4) :p. 796-799.]分别W不同浓度（0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L)苯酪培养 两种小球藻，发现两种小球藻均能降解苯酪，但是苯酪浓度为400mg/L时，两种小球藻生 长均受到抑制。HIROOKA等出irooka,T.,etal.,Removalofhazardousphenolsby microalgaeunderphotoautotrophicconditions.JournalofBioscienceandBioeng ineering，2003. 95(2) :p. 200-203.]在光合自养条件下，W2, 4-二硝基苯酪培养小球藻发 现，5d后90%的40yM的硝基酪和DNP被完全去除，氯酪和2, 4-二氯苯酪也可W被去除， 但去除效果不明显。AbelE.化varro等阳avarro,A.E.,etal.,EffectofpHon地enol biosorptionbymarineseaweeds.JournalofHazardousMaterials, 2008. 156 (I-3) :p. 405-411.]研究初始抑对两种海藻降解苯酪的影响发现，抑为10时，两种海藻对苯 酪的降解率分别为10 %、35 %，并且两种海藻对苯酪的降解依赖于溶液初始pH。
[0007] 现有的关于小球藻降解高浓度苯酪的研究存在两大问题，一是小球藻的初始接种 密度过高，二是小球藻对高浓度苯酪的耐受性较差，降解率不高。因此，我们提出对小球藻 进行适应性进化的实验方法，该方法既能提高在较低细胞接种密度下小球藻对高浓度苯酪 的耐受性，又能提高小球藻对高浓度苯酪的降解率。
[0008] 所谓的实验室适应性进化是使微生物在某一特定条件下持续处于对数生长期状 态。在对数生长期时，细胞增殖快，容易发生遗传物质的重组并且容易产生适宜外界条件变 化的种株。它是一种广泛存在的、能够增强微生物潜在途径、表型优化及环境适应性。实验 室环境条件下，微生物的适应性进化实验可W作为研究进化的工具，也可W作为工业开发 新菌株的手段。
[0009] Fu等[Fu,W.Q.,加dmundsson, 0. ,Feist,A.M. ,Herjolfsson,G. ,B;rynjolfS son,S.,Palsson,B. ,2012.Maximizingbiomassproductivityandcelldensity ofChlorell曰vulg曰risbyusinglight-emittingdiode-b曰sedphotobiore曰ctor. J.Biotechnol. 161，242 - 249.]在国际上首先报道了小球藻在光生物反应器内的适应进 化，他对普通小球藻进行38个周期（114天）的不断增加光照强度及C〇2通气速率（2. 5 -9. 5% (v/v))实验。C〇2通气速率进化试验结束后，小球藻的生长速率由0.84曲CW/L/day 增加到到1. 75曲CW/L/day;光照强度进化试验结束后，小球藻的生物量在第4个周期时 达到最大为 1. 32曲CW/E。化等[化,W.Q. ,Gu血undsson, 0.,化glia,G. ,Herjolfsson,G. ,Andresson,Q.S. ,Palsson,B. 0. ,Brynjolfsson,S. , 2013.Enhancementofcarotenoid biosynthesisinthegreenmicroalgaDunaliellasalinawithlight-emittingdiodes andadaptivelaboratoryevolution.Appl.Microbiol.Biotechnol. 97, 2395 - 2403.]将 盐生杜氏藻在红光（128iiE/m2/s)、蓝光（42iiE/m2/s)组合下进行16个周期的实验室适应 性进化发现，0 -胡萝h素和叶黄素的含量分别比原始值增加了 3. 3、2. 3倍，生长速率平均 增加0. 40 + 0.Ol曲CW/L/day，生物量平均增加0. 27 + 0.Ol曲CW/E，大约是初始值的1. 8倍。 Yu等[YuS,ZhaoQ,MiaoX,etal.Enhancementoflipidproductioninlow-starch mutantsChlamydomonasreinhardtiibyadaptivelaboratoryevolution[J]. Bioresourcetechnology, 2013, 147:499-507.]采用莱茵衣藻的S个淀粉合成缺陷藻株在 进行实验室进化后发现，=者的生长速率较未进化的藻株加快，生物量分别是未进化藻株 的 1. 17、1.33、1.48 倍，油脂产量分别从 32%、24. 27%增加到 36. 67%、44. 67%。
[0010] 本专利和上述研究不同，研究对象为不能耐受且不能降解高浓度苯酪的小球藻， 适应性进化后，不仅使得小球藻的生长速率明显增加，而且小球藻能够耐受并且降解的苯 酪的浓度也显著提高。
【发明内容】
[0011] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高小球藻对苯酪的 耐受性和降解率的方法，用于解决现有技术中小球藻的初始接种密度过高且小球藻对高浓 度苯酪的耐受性较差W及降解率不高的问题。
[0012] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种提高小球藻对苯酪的耐受性和 降解率的方法，所述方法至少包括如下步骤：
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